בדיקת כדאיות של Trichoderma stromaticum conidia בתוך מקרופאגים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי
Summary
הטכניקה המערבת פאגוציטוזה של קונידיה פטרייתית על ידי מקרופאגים נמצאת בשימוש נרחב למחקרים המעריכים את אפנון התגובה החיסונית נגד פטריות. מטרת כתב היד היא להציג שיטה להערכת יכולות הפאגוציטוזה והפינוי של מקרופאגים חד-גרעיניים מדם היקפי אנושי המגורות באמצעות Trichoderma stromaticum conidia.
Abstract
מקרופאגים מהווים קו הגנה חיוני ואחראים למניעת גדילה והתיישבות של פתוגנים ברקמות שונות. פגוציטוזה קונידיאלית היא תהליך מפתח המאפשר לחקור את האירועים הציטופלזמיים והמולקולריים המעורבים באינטראקציות מקרופאגים-פתוגנים, כמו גם לקביעת זמן המוות של קונידיה מופנמת. הטכניקה המערבת פאגוציטוזה של קונידיה פטרייתית על ידי מקרופאגים נמצאת בשימוש נרחב למחקרים המעריכים את אפנון התגובה החיסונית נגד פטריות. התחמקות מפאגוציטוזה ובריחה של פגוזומים הם מנגנונים של אלימות פטרייתית. כאן, אנו מדווחים על השיטות שניתן להשתמש בהן לניתוח של phagocytosis, סליקה, ואת הכדאיות של T. stromaticum conidia, פטרייה אשר משמש biocontrol ו biofertilizer סוכן והוא מסוגל לגרום זיהומים אנושיים. הפרוטוקול מורכב מ-1) תרבית טריכודרמה (Trichoderma ), 2) שטיפה להשגת קונידיה (conidia), 3) בידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) בשיטת תמיסת רב-סוכרוז והתמיינות ה-PBMCs למקרופאגים, 4) שיטת פאגוציטוזה חוץ-גופית באמצעות כיסויי זכוכית עגולים וצבע, ו-5) בדיקת פינוי להערכת הכדאיות של הקונידיה לאחר פגוציטוזה של קונידיה. לסיכום, ניתן להשתמש בטכניקות אלה כדי למדוד את יעילות פינוי הפטריות של מקרופאגים.
Introduction
סוג טריכודרמה (סדר: Hypocreales, משפחה: Hypocreaceae) מורכב מפטריות ספרופיטיות הנמצאות בכל מקום, שהן טפילים של מיני פטריות אחרים ומסוגלות לייצר מגוון אנזימים שימושיים מסחרית1. מיני פטריות אלה משמשים לייצור חלבונים הטרולוגיים2, לייצור תאית3, אתנול, בירה, יין ונייר4, בתעשיית הטקסטיל5, בתעשיית המזון6, ובחקלאות כסוכני הדברה ביולוגית 7,8. בנוסף להתעניינות התעשייתית במינים פטרייתיים אלה, המספר ההולך וגדל של זיהומים בבני אדם העניק לחלק ממיני הטריכודרמה מעמד של פתוגנים אופורטוניסטיים9.
Trichoderma spp. גדלים במהירות בתרבות, עם מושבות לבנות וכותנות בתחילה שהופכות צהוב ירקרק לירוק כהה10. הם מותאמים לחיות במגוון רחב של תנאי pH וטמפרטורה, והמינים האופורטוניסטיים מסוגלים לשרוד ב- pH פיזיולוגי ובטמפרטורות ובכך ליישב רקמות אנושיות שונות 11,12,13. חשוב לציין, העלייה בשיעור הזיהום של Trichoderma spp. עשויה להיות קשורה לגורמי אלימות, ואלה אינם נחקרים היטב. בנוסף, מחקרים המתמקדים בהבנת התגובה החיסונית נגד מיני טריכודרמה אופורטוניסטיים הם עדיין נדירים.
במהלך זיהום, יחד עם נויטרופילים, מקרופאגים מייצגים את קו ההגנה האחראי לפאגוציטוזה, ובכך מונעים צמיחה והתיישבות של פתוגנים ברקמות שונות. באמצעות שימוש בקולטנים לזיהוי דפוסים, כגון קולטנים דמויי טול וקולטני לקטין מסוג C, פטריות פאגוציטוזה של מקרופאגים ועיבודן לפגוליזוזומים, ובכך קידום התפרצות נשימתית, שחרור ציטוקינים מעודדי דלקת והרס מיקרואורגניזמים פגוציטוזים14. מנגנון הפאגוציטוזה, לעומת זאת, יכול להיות מושפע ולהתחמק על ידי אסטרטגיות מיקרוביאליות שונות, כגון גודל וצורה של תאים פטרייתיים; נוכחות של כמוסות המעכבות phagocytosis; הפחתת מספר הקולטנים הגורמים לפאגוציטוזה; שיפוץ המבנה של סיבי אקטין בציטופלסמה; מעכב את היווצרות pseudopodia; ופאגוזום או פאגוליזוזום בורחים לאחר תהליך הפאגוציטוזה14.
פתוגנים רבים, כולל Cryptococcus neoformans, משתמשים במקרופאגים כנישה לשרוד בפונדקאי, להפיץ ולגרום לזיהום15. בדיקת הפאגוציטוזה והפינוי משמשת להערכת התגובה החיסונית נגד פתוגנים ולזיהוי האסטרטגיות המיקרוביאליות המשמשות להתחמקות ממערכת החיסון המולדת 15,16,17. סוג זה של טכניקה יכול לשמש גם כדי לבחון את הקינטיקה הדיפרנציאלית של phagocytosis, החמצה מאוחרת phagosome, פרץ חמצוני שתוצאתם הרג פטרייתי מופחת18.
ניתן להשתמש בשיטות שונות כדי להעריך פגוציטוזה, הישרדות פטרייתית והתחמקות מתהליך ההבשלה של הפאגוזומים. אלה כוללים מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המשמשת לצפייה בפאגוציטוזה, במיקום התא ובמולקולות המיוצרות במהלך פגוציטוזה19; ציטומטריית זרימה, המספקת נתונים כמותיים על פגוציטוזה ומשמשת להערכת הסמנים השונים המעורבים בתהליך20,21; מיקרוסקופיה תוך חיונית, המשמשת להערכת לכידת חיידקים והבשלת פגוזום22; פגוציטוזה בתיווך נוגדנים, המשמשת להערכת הספציפיות של תהליך הפאגוציטוזה עבור פתוגן23; ואחרים 24,25,26,27.
הפרוטוקול המוצג כאן משתמש בשיטה נפוצה, זולה וישירה באמצעות מיקרוסקופ אופטי ובדיקת צמיחת לוחות כדי להעריך את הפאגוציטוזה וההרג של קונידיה פטרייתית. פרוטוקול זה יספק לקוראים הוראות שלב אחר שלב לביצוע בדיקת פאגוציטוזה וסילוק באמצעות מקרופאגים חד-גרעיניים מדם היקפי אנושי שנחשפו ל- T. stromaticum. PBMCs שימשו מכיוון ש – Trichoderma conidia מיושמים כהדברה ביולוגית נגד פיטופתוגנים ודשן ביולוגי לגידולי צמחים ברחבי העולם וגרמו למספר זיהומים בבני אדם, הנקראים Trichodermosis. מלבד זאת, יש רק שתי עבודות קודמות המתמקדות באינטראקציה בין Trichoderma conidia לבין מערכת החיסון האנושית, שבהן בחנו נויטרופילים28 ואוטופגיה במקרופאגים29. מאמר זה מראה תחילה כיצד ניתן לחקור את הפאגוציטוזה של הקונידיה של T. stromaticum על ידי מקרופאגים שמקורם ב-PBMC, ולאחר מכן כיצד ניתן להעריך את הכדאיות של הקונידיה הנבלעת באמצעות טכניקות פשוטות המבוססות על מיקרוסקופיה. פרוטוקול זה עשוי להקל עוד יותר על חקירות של תגובה חיסונית הקשורה למקרופאגים או מנגנונים הקשורים לאפנון מערכת החיסון.
Protocol
Representative Results
Discussion
עבור מספר פתוגנים פטרייתיים, כולל Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans, ואחרים, phagocytosis conidial או שמרים הוא תהליך מפתח המאפשר לחקור את האירועים cytoplasmic ומולקולרי באינטראקציות מקרופאג פתוגן, כמו גם לקביעת זמן המוות של conidiaמופנם 14,39,40. פג…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מוסדות המימון הברזילאים הבאים: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) עם מענקים RED0011/2012 ו- RED008/2014. U.R.S., J.O.C. ו- M.E.S.M. מכירים במלגה המוענקת על ידי Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) ו- FAPESB, בהתאמה.
Materials
| 15 mL centrifuge tubes | Corning | CLS431470 | 15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile |
| 24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate | Kasvi | K12-024 | Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation; |
| Cell culture CO2 incubator | Sanyo | 303082 | A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types. |
| Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL | Capp | 5101500 | Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens |
| Circular coverslip 15 mm | Olen | K5-0015 | Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm |
| Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets | Esco Lifesciences group | 2010274 | Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface. |
| Dextrose Potato Agar medium | Merck | 145 | Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi |
| EDTA vacuum blood collection tube | FirstLab | FL5-1109L | EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology. |
| Entellan | Merck | 1.07961 | Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A2720801 | Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells. |
| Flaticon | database of images | ||
| Glycerol | Merck | 24900988 | The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores |
| Histopaque-1077 | polysucrose solution | ||
| Image J | Image analysis software | ||
| Microscopy slides | Precision | 7105 | Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections |
| Mini centrifuge | Prism | C1801 | The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time. |
| Neubauer chamber | Kasvi | K5-0011 | The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles. |
| Panoptic fast | Laborclin | 620529 | Laborclin's panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology |
| Penicillin/Streptomycin Solution – 10,000U | LGC- Biotechnology | BR3011001 | antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow. |
| Petri dish 90 x 15 mm Smooth | Cralplast | 18248 | Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm. |
| Phosphate buffered saline (PBS) | thermo fisher Scientific | 10010001 | PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells. |
| Pipette Pasteur 3 mL Sterile | Accumax | AP-3-B-S | STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile |
| Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | TS-HM16R | The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g. |
| RPMI-1640 Medium | Merck | MFCD00217820 | HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture |
| The single channel micropipettes | Eppendorf | Z683809 | Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids. |
| Tip for Micropipettor | Corning | 4894 | Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable |
| Triocular inverted microscope | LABOMED | VU-7125500 | It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems. |
References
- Samuels, G. J. Trichoderma: A review of biology and systematics of the genus. Mycological Research. 100 (8), 923-935 (1996).
- Nevalainen, H., Peterson, R., Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. Chapter 7 – Heterologous expression of proteins in Trichoderma. Biotechnology and Biology of Trichoderma. , (2014).
- Do Vale, L. H. F., Filho, E. X. F., Miller, R. N. G., Ricart, C. A. O., de Sousa, M. V., Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. Chapter 16 – Cellulase systems in Trichoderma: An overview. Biotechnology and Biology of Trichoderma. , (2014).
- Ferreira, N. L., Margeot, A., Blanquet, S., Berrin, J. G., Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. Chapter 17 – Use of cellulases from Trichoderma reesei in the twenty-first century part I: Current industrial uses and future applications in the production of second ethanol generation. Biotechnology and Biology of Trichoderma. , (2014).
- Puranen, T., Alapuranen, M., Vehmaanperä, J., Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. Chapter 26 – Trichoderma enzymes for textile industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. , (2014).
- Kunamneni, A., Plou, F. J., Alcalde, M., Ballesteros, A., Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. Chapter 24 – Trichoderma enzymes for food industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. , (2014).
- Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Herrera-Estrella, A., Schmoll, M., Kenerley, C. M. Trichoderma research in the genome era. Annual Review of Phytopathology. 51 (1), 105-129 (2013).
- Mukherjee, M., et al. Trichoderma-plant-pathogen interactions: Advances in genetics of biological control. Indian Journal of Microbiology. 52 (4), 522-529 (2012).
- dos Santos, U. R., dos Santos, J. L. Trichoderma after crossing kingdoms: Infections in human populations. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 26 (2), 97-126 (2023).
- Asis, A., et al. Identification patterns of Trichoderma strains using morphological characteristics, phylogenetic analyses and lignocellulolytic activities. Molecular Biology Reports. 48 (4), 3285-3301 (2021).
- Antal, Z., et al. Comparative study of potential virulence factors in human pathogenic and saprophytic Trichoderma longibrachiatum strains. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 52 (3-4), 341-350 (2005).
- Hatvani, L., Manczinger, L., Vágvölgyi, C., Kredics, L., Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Singh, U. S., Mukherjee, M., Schmoll, M. Trichoderma as a human pathogen. Trichoderma: Biology and Applications. , (2013).
- Kredics, L., et al. Clinical importance of the genus Trichoderma: A review. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 50 (2-3), 105-117 (2003).
- Erwig, L. P., Gow, N. A. R. Interactions of fungal pathogens with phagocytes. Nature Reviews Microbiology. 14 (3), 163-176 (2016).
- Nicola, A. M., Casadevall, A. In vitro measurement of phagocytosis and killing of Cryptococcus neoformans by macrophages. Methods in Molecular Biology. 844, 189-197 (2012).
- Medina, E., Goldmann, O. In vivo and ex vivo protocols for measuring the killing of extracellular pathogens by macrophages. Current Protocols in Immunology. , 1-17 (2011).
- Drevets, D. A., Canono, B. P., Campbell, P. A. Measurement of bacterial ingestion and killing by macrophages. Current Protocols in Immunology. 109, 1-17 (2015).
- Gresnigt, M. S., et al. Differential kinetics of Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus phagocytosis. Journal of Innate Immunity. 10 (2), 145-160 (2018).
- Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
- Yan, Q., Ahn, S. H., Fowler, V. G. Macrophage phagocytosis assay of Staphylococcus aureus by flow cytometry. Bio-Protocol. 5 (4), 1406 (2015).
- Marr, K. A., Koudadoust, M., Black, M. Early events in macrophage killing of Aspergillus fumigatus conidia New flow cytometric viability assay. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1240-1247 (2001).
- Surewaard, B. G. J., Kubes, P. Measurement of bacterial capture and phagosome maturation of Kupffer cells by intravital microscopy. Methods. 128, 12-19 (2017).
- Siggins, M. K., et al. Differential timing of antibody-mediated phagocytosis and cell-free killing of invasive African Salmonella allows immune evasion. European Journal of Immunology. 44 (4), 1093-1098 (2014).
- Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. Journal of Cell Science. 101 (4), 907-913 (1992).
- Harvath, L., Terle, D. A. Assay for phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 115, 281-290 (1999).
- dos Santos, A. G., et al. Trichoderma asperelloides spores downregulate dectin1/2 and TLR2 receptors of mice macrophages and decrease Candida parapsilosis phagocytosis independent of the M1/M2 polarization. Frontiers in Microbiology. 8, 1681 (2017).
- Souza, J. A. M., et al. Characterization of Aspergillus fumigatus extracellular vesicles and their effects on macrophages and neutrophils functions. Frontiers in Microbiology. 10, 2008 (2019).
- Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Inhibition of extracellular traps by spores of Trichoderma stromaticum on neutrophils obtained from human peripheral blood. Molecular Immunology. 141, 43-52 (2022).
- Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Trichoderma stromaticum spores induce autophagy and downregulate inflammatory mediators in human peripheral blood-derived macrophages. Current Research in Microbial Sciences. 3, 100145 (2022).
- Johnston, L., Harding, S. A., La Flamme, A. C. Comparing methods for ex vivo characterization of human monocyte phenotypes and in vitro responses. Immunobiology. 220 (12), 1305-1310 (2015).
- Abedon, S. T., Bartom, E., Maloy, S., Hughes, K. Multiplicity of infection. Brenner’s Encyclopedia of Genetics. Second Edition. , (2013).
- Rios, F. J., Touyz, R. M., Montezano, A. C. Isolation and differentiation of human macrophages. Methods in Molecular Biology. 1527, 311-320 (2017).
- Lombard, Y., Giaimis, J., Makaya-Kumba, M., Fonteneau, P., Poindron, P. A new method for studying the binding and ingestion of zymosan particles by macrophages. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 155-165 (1994).
- Ghoneum, M., Gollapudi, S. Phagocytosis of Candida albicans by metastatic and non metastatic human breast cancer cell lines in vitro. Cancer Detection and Prevention. 28 (1), 17-26 (2004).
- Nunes, J. P. S., Dias, A. A. M. ImageJ macros for the user-friendly analysis of soft-agar and wound-healing assays. BioTechniques. 62 (4), 175-179 (2017).
- Alves-Filho, E. R., et al. The biocontrol fungus Trichoderma stromaticum downregulates respiratory burst and nitric oxide in phagocytes and IFN-gamma and IL-10. Journal of Toxicology and Environmental Health – Part A: Current Issues. 74 (14), 943-958 (2011).
- Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
- Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: Evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 15 (3), 403-411 (2013).
- Alonso, M. F., et al. The nature of the fungal cargo induces significantly different temporal programmes of macrophage phagocytosis. The Cell Surface. 8, 100082 (2022).
- Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
- Dos Santos, U. R., et al. Exposition to biological control agent Trichoderma stromaticum increases the development of cancer in mice injected with murine melanoma. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 252 (2020).
- Wang, G., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii induces macrophage activation. Carbohydrate Polymers. 149, 112-120 (2016).
- Xu, Y., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii promotes maturation of murine dendritic cells. International Journal of Biological Macromolecules. 92, 1155-1161 (2016).
- Schmoll, M., Esquivel-Naranjo, E. U., Herrera-Estrella, A. Trichoderma in the light of day – Physiology and development. Fungal Genetics and Biology. 47 (11), 909-916 (2010).
- Zhang, G., Li, D. Trichoderma longibrachiatum-associated skin inflammation and atypical hyperplasia in mouse. Frontiers in Medicine. 9, 865722 (2022).
- Paredes, K., Capilla, J., Mayayo, E., Guarro, J. Virulence and experimental treatment of Trichoderma longibrachiatum, a fungus refractory to treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (8), 5029-5032 (2016).
- Perkhofer, S., Speth, C., Dierich, M. P., Lass-Flörl, C. In vitro determination of phagocytosis and intracellular killing of Aspergillus species by mononuclear phagocytes. Mycopathologia. 163 (6), 303-307 (2007).
