JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Protein kristalografisi için kristal isabetleri elde etmek için yüksek verimli tarama

Published: March 10, 2023
doi:
10.3791/65211
, , , ,
1National High-Throughput Crystallization Center,Hauptman-Woodward Medical Research Institute, 2Department of Biochemistry, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences,The State University of New York

Summary

Bu protokol, 1.536 mikrotahlil plakası hazırlığından 6 haftalık deneysel zaman penceresinin sonuna kadar değişen yüksek verimli kristalizasyon taramasını detaylandırır. Örnek kurulumu, elde edilen görüntüleme ve kullanıcıların makromoleküler kristalleşme koşullarını hızlı ve verimli bir şekilde tanımlamak için yapay zeka özellikli bir grafik kullanıcı arabirimi kullanarak analizleri nasıl gerçekleştirebilecekleri hakkında ayrıntılar dahil edilmiştir.

Abstract

X-ışını kristalografisi, makromoleküler yapıları ayırt etmek için en yaygın kullanılan tekniktir, ancak bir proteini kırınıma uygun düzenli bir kafese kristalize etmenin önemli adımı zor olmaya devam etmektedir. Biyomoleküllerin kristalleşmesi büyük ölçüde deneysel olarak tanımlanmıştır ve bu süreç sınırlı kaynak kurumlardaki araştırmacılar için emek yoğun ve engelleyici olabilir. Ulusal Yüksek Verimli Kristalizasyon (HTX) Merkezi’nde, kristalleşme parametrelerinin geniş bir genişliğini örneklemek için tasarlanmış otomatik yüksek verimli 1.536 kuyucuklu mikroparti-yağ altı plaka kurulumu da dahil olmak üzere kristal büyümesini kolaylaştırmak için yüksek oranda tekrarlanabilir yöntemler uygulanmıştır. Plakalar, kristal büyümesi hakkında fikir vermek ve değerli kristal vuruşlarını doğru bir şekilde ayırt etmek için 6 hafta boyunca en son teknoloji görüntüleme yöntemleri kullanılarak izlenir. Ayrıca, kristal vuruşlarını tanımlamak için eğitimli bir yapay zeka puanlama algoritmasının uygulanması, deneysel görüntüleri görüntülemek için açık kaynaklı, kullanıcı dostu bir arayüzle birleştiğinde, kristal büyüme görüntülerini analiz etme sürecini kolaylaştırır. Burada, kokteyllerin ve kristalizasyon plakalarının hazırlanması, plakaların görüntülenmesi ve isabetlerin tekrarlanabilirliği sağlayacak ve başarılı kristalleşme olasılığını artıracak şekilde tanımlanması için anahtar prosedürler ve enstrümantasyon açıklanmaktadır.

Introduction

Yapısal biyoloji yöntemlerinde muazzam bir ilerleme çağında bile, X-ışını kristalografisi, makromoleküllerin yüksek kaliteli yapısal modellerini oluşturmak için güvenilir ve popüler bir yöntem olmaya devam etmektedir. Protein Veri Bankası’na (PDB) yatırılan tüm üç boyutlu yapısal modellerin% 85’inden fazlası kristal bazlı yapısal yöntemlerden (Ocak 2023 itibariyle) alınmıştır. 1 Ayrıca, X-ışını kristalografisi, ilaç keşif ve geliştirme sürecinin çok önemli bir bileşeni olan protein-ligand yapılarını çözmek için vazgeçilmez olmaya devam etmektedir2. Protein kristalizasyonu yarım yüzyıldan fazla bir süredir baskın yapısal biyoloji tekniği olarak kalmasına rağmen, fiziksel özellikler3 veya sekans 4,5’e dayanarak kristalleşme olasılığını tahmin etme yöntemleri hala emekleme aşamasındadır.

Kristalleşme koşullarının tahmini daha da belirsizdir; Model proteinler 6,7 için bile olası kristalleşme koşullarını tahmin etmek için sınırlı ilerleme kaydedilmiştir. Diğer çalışmalar, protein homolojisine ve PDB 8,9,10’dan çıkarılan koşullara dayanarak kristalleşme koşullarını tanımlamaya çalışmıştır. Bununla birlikte, PDB’de bulunacak öngörücü güç sınırlıdır, çünkü yalnızca nihai, başarılı kristalleşme koşulları biriktirilir, bu da zorunlu olarak, kristal büyümesine ince ayar yapmak için gereken genellikle kapsamlı optimizasyon deneylerini kaçırır. Ayrıca, birçok PDB girişi, kokteyl formülleri, kristalleşme formatı, sıcaklık ve 11,12’yi kristalleştirme süresi dahil olmak üzere bu ayrıntıları içeren meta verilerden yoksundur. Bu nedenle, ilgilenilen birçok protein için, kristalleşme koşullarını belirlemenin en erişilebilir yolu, çok çeşitli kimyasal olasılıklarda mümkün olduğunca çok koşul kullanarak deneysel olarak yapmaktır.

Kristalizasyon taramasını mümkün olduğunca verimli ve kapsamlı hale getirmek için seyrek matrisler 13, eksik faktöriyel tarama 14, katkı maddeleri 15,16, tohumlama 17 ve çekirdeklendirici ajanlar 18 dahil olmak üzere çeşitli yaklaşımlar araştırılmıştır. Hauptman-Woodward Tıbbi Araştırma Enstitüsü’ndeki (HWI) Ulusal HTX Merkezi, nispeten minimum numune ve kokteyl hacimleri kullanarak ilk kristalleşme koşullarının tanımlanmasını kolaylaştırmak için otomatik sıvı işleme ve görüntüleme modalitelerini kullanan mikroparti-yağ-alt-yağ yaklaşımı19’u kullanarak kristalizasyon taraması için verimli bir boru hattı geliştirmiştir (Şekil 1). 1.536 benzersiz kokteyl seti, daha önce protein kristal büyümesine elverişli olduğu belirlenen koşullara dayanmaktadır ve çok çeşitli olası kristalleşme koşullarını örneklemek için kimyasal olarak çeşitli olacak şekilde tasarlanmıştır20,21,22. Kristalleşme koşullarının geniş örneklemesi, bir veya daha fazla kristalleşme yolunu gözlemleme olasılığını arttırır.

Literatürde tarama için kaç koşulun gerekli olduğuna dair az sayıda resmi analiz ortaya çıkmıştır. Bir çalışma, farklı ekranların örnekleme düzenine odaklanmış ve bileşenlerin rastgele örneklemesinin (tamamlanmamış bir faktöriyele benzer) en kapsamlı ve verimli örnekleme yöntemini temsil ettiğini bulmuştur23. Başka bir tarama çalışması, çok kapsamlı 1.536 ekranın sadece tek bir kristal isabeti24 verdiği sayısız örnek olduğunu ve çok yakın tarihli bir çalışmanın, çoğu ticari ekranın, tarama isabetleri25 ile ilişkili olduğu bilinen kristalleşme alanını alt örneklemesini vurguladığını belirtti. Tüm kristalleşme yolları, kristal içindeki doğal bozukluk, kırınım sınırlamaları veya kristal kusurları nedeniyle veri toplama için uygun bir kırınım kalitesi kristali vermeyecektir; Bu nedenle, koşullar için daha geniş bir ağ dökümü, optimizasyon için alternatif kristal formları sağlama avantajına sahiptir.

Protein kristalizasyon deneylerinin formatı da ekranın başarısı üzerinde bir etkiye sahiptir. Buhar difüzyonu, yüksek verimli kristalizasyon uygulamaları için en yaygın kullanılan kurulumdur ve EMBL Hamburg ve Institut Pasteur yüksek verimli tarama merkezleri26,27,28 dahil olmak üzere son teknoloji kristalizasyon merkezlerinde kullanılır. HTX Merkezi, mikroparti-under-oil yöntemini kullanır; Daha az yaygın olarak kullanılmasına rağmen, numune ve kristalizasyon kokteyllerinin tüketimini en aza indiren sağlam bir yöntemdir20,21,22. Mikroparti-under-oil yönteminin bir avantajı, özellikle yüksek viskoziteli bir parafin yağı kullanıldığında, deney sırasında damla içinde sadece hafif buharlaşmanın meydana gelmesidir, bu da denge konsantrasyonunun damla karıştırma üzerine elde edildiği anlamına gelir. Mikroparti-yağ-altında-yönteminde pozitif kristalleşme sonuçları gözlenirse, bu koşulların çoğaltılması tipik olarak, kristalleşmenin kristalleşme damlası ile rezervuar arasındaki denge sırasında tanımlanmamış bir noktada gerçekleştiği buhar difüzyon kurulumlarından daha basittir. Vuruşların tekrarlanabilirliği, tipik olarak tek kristalli X-ışını deneyleri için optimize edilmesi gereken engelleyici derecede küçük protein kristalleri üreten yüksek verimli kristalizasyon yaklaşımları için arzu edilir.

Çözünür proteinler için yüksek verimli kristalizasyon eleği, şirket içinde hazırlanan kokteyllerden, hazır ticari eleklerden ve şirket içi modifiye edilmiş ticari eleklerden oluşur22. Kokteyller başlangıçta daha önce başarılı olan kristalizasyon kokteylleri20 kullanılarak tamamlanmamış faktöriyel strateji kullanılarak geliştirilmiştir. Ekrandaki ticari olarak temin edilebilen reaktifler, polimer dizilerini, kristalizasyon tuzlarını, PEG ve iyon kombinasyonlarını ve seyrek matris ve eksik faktöriyel yaklaşımları kullanan elekler içerir. Eleğe dahil edilmeden önce modifiye edilen reaktifler de vardır: bir katkı maddesi eleği, bir pH ve tampon eleği, bir iyonik sıvı katkı maddesi eleği ve bir polimer elek.

Bilinen kristalleşme koşullarının ve stratejilerinin gücü, 1.536 kristalizasyon kokteylinde, otomatik sıvı işleme, otomatik parlak alan görüntüleme ve kiral kristallerin ikinci dereceden doğrusal olmayan görüntülemesini (SONICC) kullanan bir boru hattı oluşturmak için mikroparti-yağ altı sisteminin faydalarından yararlanılmıştır. Hem sıvı elleçleme hem de görüntülemenin otomasyonu, daha az ıslak laboratuvar saati ve daha yüksek tekrarlanabilirlik avantajları sağlar. Otomatik kristalizasyon taramasının yüksek verimli doğası, kristal büyümesi için izleme sürecinin otomasyonunu gerektirir. Bu ilerlemeler, pozitif kristal vuruşlarının tanımlanmasına yardımcı olmak için en son görüntüleme teknolojileri ile elde edilmektedir. Hem plakaların standart parlak alan görüntülemesi hem de gelişmiş algılama için çoklu foton yöntemleri, SONICC ile kristal görüntüleme sistemi aracılığıyla kullanılır (Şekil 2). SONICC, ikinci harmonik nesil (SHG)29 mikroskopi ve ultraviyole iki foton uyarılmış floresan (UV-TPEF)30 mikroskopisini birleştirerek çok küçük kristalleri ve çökelti tarafından gizlenenleri tespit eder. SONICC görüntüleme, kuyucukların protein (UV-TPEF yoluyla) ve kristal (SHG yoluyla) içerip içermediği konusunda bilgi verir. Protein kristallerinin pozitif tanımlanmasının ötesinde, son teknoloji görüntüleme yöntemleri kullanılarak ek bilgiler de elde edilebilir. Numune eklemeden önce sadece kokteyl görüntüleme, negatif bir kontrol görevi görür; Bu görüntüler, tuz kristalleri ve döküntüler de dahil olmak üzere numune eklemeden önce kuyu görünümünü tanımlayabilir. Ek olarak, SHG ve UV-TPEF görüntüleme, protein kristallerini tuz kristallerinden ayırt etmeye yardımcı olur ve protein-nükleik asit kompleksli materyali görselleştirmek için kullanılabilir31.

Görüntüleme yoluyla tekrarlanan izlemeye tabi tutulan yüksek verimli kristalizasyon deneyleri, incelenmesi gereken çok büyük miktarda görüntüyle sonuçlanır. Otomatik kristal puanlama yöntemleri, kullanıcı üzerindeki yükü azaltmak ve pozitif kristal vuruşlarını belirleme olasılığını artırmak için geliştirilmiştir. HTX Merkezi, parlak alan kuyu görüntülerini sınıflandırmak için akademik, kar amacı gütmeyen, hükümet ve endüstri ortaklarından oluşan bir konsorsiyum tarafından geliştirilen eğitimli bir derin evrişimli sinir ağı mimarisi olan MAchine Recognition of Crystallization Outcomes (MARCO) puanlama algoritmasının geliştirilmesine katıldı32. Algoritma, farklı kristalizasyon yöntemleri ve farklı görüntüleyiciler kullanılarak birden fazla kurumdan kristalizasyon deneylerinden elde edilen yaklaşık yarım milyon parlak alan görüntüsü üzerinde eğitildi. Algoritma, belirli bir görüntünün dört olası görüntü sınıfına girip girmediğini gösteren olasılıksal bir puan çıkarır: “kristal”, “net”, “çökeltme” ve “diğer”. MARCO’nun %94,5 oranında bir sınıflandırma doğruluğu bildirilmiştir. Kristal algılama, algoritmayı uygulayan ve AI özellikli puanlama yetenekleri32,33 ile etkinleştirilen, erişilebilir ve basit görüntü görüntüleme için bir grafik kullanıcı arayüzü (GUI) sağlayan yazılımla daha da geliştirilmiştir. MARCO Polo GUI, 1.536 kuyucuklu ekrandaki isabetleri tanımlamak için HTX Merkezi’ndeki görüntüleme ve veri yönetim sisteminin kurulumuyla sorunsuz bir şekilde çalışacak ve sıralanmış listelerin çıktısını incelemek için insan katılımıyla çalışacak şekilde tasarlanmıştır. Ek olarak, GitHub’da bulunan açık kaynaklı yazılım olarak GUI, diğer laboratuvar gruplarının özel ihtiyaçlarını yansıtacak şekilde değiştirilmeye hazırdır.

Burada, hem kokteyli hem de proteini sağlamak için robotik sıvı elleçleme kullanarak yüksek verimli bir mikroparti-yağ altı deneyi kurma süreci açıklanmaktadır. HTX Merkezi, ilgilenen kullanıcılara tarama hizmetleri ve eğitim kaynakları sağlamak amacıyla diğer kurumlarda bulunmayan benzersiz bir dizi enstrümantasyon ve kaynağa sahiptir. Robotik destekli yüksek verimli tekniklerin yöntem ve yeteneklerini göstermek, topluluğun mevcut teknolojiler hakkında bilgi sahibi olmasını ve kendi yapı belirleme çabaları için kararlar almasını sağlayacaktır.

Protocol

1. On altı adet 96 kuyu derinliğindeki kuyu bloğu için kokteyllerin hazırlanması veya satın alınması 96 kuyu derinliğindeki kuyu (DW) bloklarına dağıtarak şirket içinde üretilen kimyasal kokteylleri hazırlayın. Tuzların, tamponların, polimerlerin ve suyun stok çözeltilerini dağıtmak ve karıştırmak için robotik bir sıvı işleyici kullanın. Ticari olarak satın alınan 96 delikli DW blok eleklere ek bileşenler eklemek için robotik sıvı işleyicisi veya çok kanallı pipet kullanarak şirket içinde modifiye edilmiş kimyasal kokteyller hazırlayın. Piyasada satılan DW blokları satın alın. 96 delikli DW bloklarını 12-18 ay boyunca -20 ° C’de saklayın.NOT: Adım 1.1’de hazırlanan kokteyller. ve 1.2. 10/16 96 delikli DW blokları doldurun ve satın alınan olarak 5/16 96 delikli DW blokları kullanılır. Ekrandaki bir adet 96 delikli DW bloğu, katkı maddesi eleğinin çökelmesini önlemek için 1.536 delikli plaka dağıtımı sırasında kurulmuştur (bkz. bölüm 3). 2. Kokteyllerin 384 delikli tabaklara dağıtılması 96 kuyucuklu DW bloklarını gece boyunca 4 °C’de çözün. 384 delikli plakaların hazırlanmasına başlamadan önce oda sıcaklığına (20-23 ° C) getirin.NOT: Oda sıcaklığı kokteyl tabaklarının hazırlanması için uygundur. Bu plakaların hazırlanmasındaki temel endişe, sıvı taşıma cihazlarını tıkayabilecek ve kokteyl bileşenlerinin konsantrasyonlarında öngörülemeyen değişikliklere yol açabilecek çökeltilerden kaçınmaktır. Herhangi bir kalıcı opak çökeltiyi çözmek için blokları gerektiği gibi ters çevirerek iyice karıştırın. Herhangi bir kuyucuk çökelti içeriyorsa, blokları çözmek için 30 ° C’ye ısıtın. 96 şırınga veya pipetleyici kafasıyla donatılmış bir sıvı taşıma robotu kullanarak dört adet 96 delikli DW bloğundan bir adet 384 delikli plakaya 50 μL kokteyl çözeltisi sunun. Dört adet 96 delikli DW bloğu, kadranlar doldurulacak şekilde 384 delikli plakaya damgalanır (örneğin, 96-DW1’in A1’i ila 384 plakanın1’i1, 96-DW2’nin A1’i ila 384 plakanın1’i B1, vb.) (Şekil 3). 16 adet 96 delikli DW bloğundan 15’ini depolama için 384 delikli plakalara teslim edin. 384 delikli plakaları, 1.536 delikli plakaların hazırlanmasında kullanılmak üzere 6 aya kadar -20 ° C’de saklayın. 3. 1.536 kuyucuklu plakaların yağ ve kristalizasyon kokteylleri ile hazırlanması Yavaş aspirasyon ve dağıtım kapasitesine sahip robotik bir sıvı taşıma sistemi kullanarak 1.536 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 5 μL parafin yağı verin. Yağ plakalarını 4 °C’de 6 aya kadar saklayın. Bölüm 2’deki 384 delikli plakaları gece boyunca 4 ° C’de çözün. Çözeltileri karıştırmak ve çökeltiyi çözmek için plakaları ters çevirin. Kalıcı çökeltileri çözmek için plakaları 30 ° C’de inkübe edin. Katkı eleği bileşenlerini hazırlamak için, sıvı taşıma robotu veya çok kanallı pipet kullanarak ticari katkı maddesi eleği ile karıştırmak üzere 0,1 M HEPES pH 6,8, PEG3350 içeren son 96 delikli DW bloğunu kullanın. Katkı maddesi elek çözeltilerini, adım 3.3’te hazırlanan tamponlanmış PEG3350 çözeltisinin 1:1’lik bir karışımını ve katkı maddesi eleğini uygun 384 delikli plakada 50 μL’lik son bir hacme dağıtarak hazırlayın. 1.536 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 200 nL kokteyl çözeltisi vermek için 384 şırınga veya pipetleyici kafası ile donatılmış bir sıvı taşıma robotu kullanın. Dört adet 384 delikli plakayı 1.536 delikli plakaya, kadranlar doldurulacak şekilde damgalayın (örneğin; 384 delikli plakanın A1’i1 ila 1.536 delikli plakanın A1’i, 384 delikli plakanın A2’si1 ila 1.536 delikli plakanın A3’ü vb.) (Şekil 3). Plakaları 4 ° C’de 4 haftaya kadar saklamadan önce 5 dakika boyunca 150 × g’da santrifüj edin. 4. Örnek gönderimi Bir örnek göndermek için, yaklaşan gösterim çalışması için son rezervasyon tarihinden önce bir rezervasyon e-postası gönderin. Tarama deneylerinin sayısını, adını, PI’sini ve kurumunu ve ayrıca numune için özel işleme gereksinimlerini ekleyin. Tarama çalışmaları ayda yaklaşık bir kez yapılır ve yılda 12 çalışma ile sonuçlanır. Numuneyi göndermeden önce bir numune gönderme formu doldurun.Yeni kullanıcılar için, bölüm 7’deki kristalleşme görüntülerini indirmek için kullanılacak bir parola seçin. Yerleşik kullanıcılar için mevcut bir parolayı kullanın veya bu adımda parolayı değiştirin. Numuneyi 1,5 mL’lik bir tüp içinde gönderin. Makromolekülün homojen olduğundan ve kristalleşmeyi teşvik etmek için yeterince konsantre olduğundan emin olun. Test edilen numune konsantrasyonlarının berrak düşüşlere veya çökeltiye neden olup olmadığını gözlemleyerek uygun numune konsantrasyonunu araştırmak için tipik olarak amonyum sülfat veya PEG 4.000’den oluşan bir ön kristalizasyon testi kullanın34.NOT: Saflık ve homojenliği kontrol etmek için numune gönderilmeden önce yapılabilecek uygun kalite testleri, diğerlerinin yanı sıra SDS-PAGE, jel filtrasyonu ve dinamik ışık saçılımını (DLS) içerir. Kristalleşme, küçük safsızlıkların varlığından bile etkilenebilir. Şu anda 1.536 delikli bir plaka oluşturmak için 500 μL’lik bir numune hacmi gerekmektedir. Numune hacmi gereksinimini azaltmak için testler devam etmektedir.50 mM’den büyük tampon konsantrasyonlarının yanı sıra ekran içinde kristalleşebilecek fosfatları kullanmaktan kaçının. w/v’den daha yüksek gliserol konsantrasyonları da dahil olmak üzere aşırı çözünürleştirici ajanlardan kaçının. Kapalı bir kapta kuru buz, ıslak buz veya soğutma paketleri kullanarak uygun bir sıcaklığı güvenli bir şekilde korumak için numuneyi paketleyin. Numune önceliğini Pazartesi-Çarşamba günleri çalışma sırasında bir gecede gönderin. Örnek gönderildikten sonra takip numarasını e-postayla gönderin. 5. Hazırlanan 1.536 delikli plakalarda numune kurulumu Numuneleri ambalajından çıkarın ve hemen kullanıcının istediği sıcaklıkta inkübe edin. Çözüldükten sonra, numuneyi oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 10.000 × g’da santrifüj edin. Kurulumdan önce numunenin yağışını, rengini ve durumunu tanımlamak için numuneyi görsel olarak gözlemleyin. 1.536 delikli plakayı 23 ° C’ye ısıtın ve 5 dakika boyunca 150 × g’da santrifüjleyin. Negatif kontrol olarak parlak alan görüntülemeyi kullanarak yalnızca kokteyl plakasını görüntüleyin.NOT: Tüm plakalar, numune kurulumundan önce parlak alan görüntüleme ile görüntülenir, bu da negatif kontrol olarak numune eklenmeden önce içinde kristal veya döküntü bulunan kuyucukların tanımlanmasını sağlar. Ayrıca, kristalleşme kokteylinin teslim edilmediği kuyuların tanımlanmasını sağlar. Plakanın oda sıcaklığına ısıtılması, plaka yüzeyindeki yoğuşmayı ortadan kaldırarak net görüntülere yol açar. Bir sıvı taşıma robotu kullanarak 1.536 delikli plakadaki her bir kuyucuğa 200 nL numune dağıtın. 150 × g’da santrifüj plakası ve 4 ° C, 14 ° C veya 23 ° C’de inkübe plakaları.NOT: Microbatch yağ altı deneyleri, protein ve kokteylin istenen yağ altına dağıtılmasıyla elle ayarlanabilir. Bununla birlikte, tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için her protein ve kokteylden en az 1 μL kullanılması önerilir. 6. Kristal oluşumu için 1.536 delikli plakaları izleyin Numune 1.536 kuyucuklu plakalara eklendikten sonra, 1. gün ve 1. haftada, 2. haftada, 3. haftada, 4. haftada ve 6. haftada parlak alan görüntüleme ile görüntü. SHG ve UV-TPEF ile 23 ° C’de inkübe edilen plakalar için 4 haftalık zaman noktasında ve 14 ° C veya 4 ° C’de inkübe edilen plakalar için 6 haftalık zaman noktasında SONICC görüntüleme gerçekleştirin.NOT: SONICC görüntülemenin zamanlaması, yüksek verimli 1.536 mikrotahlil plakası için 4 haftalık ve 6 haftalık zaman noktalarında planlanmıştır, çünkü tipik olarak, kristaller bu zaman noktalarında görünecektir. Yağ veya buhar difüzyon deneyleri altında 96 kuyucuklu bir mikropartide modifikasyon için, SONICC görüntülemenin zaman penceresinde daha erken yapılması önerilir. Dahili bir LIMS sistemi kullanarak kullanıcı hesabına otomatik olarak aktarılan deneysel görüntülere erişin. Otomatik bir htslab e-posta daemonu aracılığıyla kullanıcıları görüntülemenin gerçekleştiği konusunda bilgilendirin. 7. Görüntü analizi Her .rar dosyası için HWI ftp sitesinden tarama görüntülerini alın.NOT: 1.536 ekrandan alınan görüntü çıktısı, parlak alan görüntüleri, SHG görüntüleri ve UV-TPEF görüntüleri içeren bir dizi dosyayla sonuçlanır. Her görüntüleme yöntemi veya zaman noktası ayrı bir .rar dosyasıdır. Her .rar dosyası, ambalajı açıldığında, belirli bir görüntüleme yöntemi kullanılarak belirli bir zaman noktasında 1.536 delikli plakanın her bir kuyucuğundan bir görüntü içerir.FTP verilerine erişmek için FileZilla İstemcisi’ni veya diğer seçenekleri kullanın.NOT: FileZilla İstemcisi, hesaplama çökmelerini en aza indirmek için büyük dosya aktarım birimini yönetmenin önerilen yoludur.FileZilla İstemcisi’nin kullanıcı bilgisayarına yüklenmesi gerekiyorsa, FileZilla yazılımını indirin. FileZilla Client zaten yüklüyse veya kurulum sonrasında, yazılımı açmak için FileZilla simgesine tıklayın. Ana bilgisayar ftp web sitesini, kullanıcı adını ve parolayı girerek FileZilla’dan uzak ftp sunucusunda oturum açın. .rar dosyalarını istediğiniz dizine indirin. Kristalleşme görüntülerini görüntülemek, puanlamak ve analiz etmek için yapay zeka özellikli açık kaynaklı GUI’yi kullanın.NOT: GUI çoğu Windows, Mac ve Linux işletim sisteminde (OS) kullanılabilir ve indirme için işletim sistemine özgü yönergeler GitHub sitesinde bulunur. MARCO Polo, HTX Center’da uygulanan yüksek verimli 1.536 kristalizasyon ekranından meta verileri içeren açık kaynaklı bir GUI’dir. Diğer laboratuvar gruplarının özel ihtiyaçlarını yansıtacak şekilde değişiklik yapmak üzere GitHub’dan herkesin indirmesi mümkündür.Dosya indirildikten sonra .rar dosyasını GUI’de açın (bkz. Ek Şekil S1).İçe Aktar’a tıklayın, açılır menüden Görüntüler’i seçin ve ardından Rar Arşivinden/Dizinden’i seçin. Açılır pencerede Klasöre Gözat’a tıklayın ve ardından görüntüleri içeren klasöre gidin. İstediğiniz dosyaları seçin ve Aç’a tıklayarak GUI’ye aktarın. Dosya(lar)ın Seçili Yollar penceresinde görünmesini bekleyin. GUI’ye indirmek için bir veya daha fazla dosya seçin ve Çalıştırmaları İçe Aktar’a tıklayın. GUI’deki Slayt Gösterisi Görüntüleyicisi’nin penceresindeki ilk kuyucuğun görüntüsünü, örnek adının solundaki > sembolüne tıklayarak ve ardından üzerine çift tıklayarak uygun okumayı seçerek görüntüleyin (okumalar, görüntü-parlak alanı, UV-TPEF veya SHG’nin tarihine ve türüne göre listelenir). Tüm pencereyi yeniden boyutlandırarak görüntüyü büyütün. Görüntü Ayrıntıları kutusu, puanlama bilgileri de dahil olmak üzere görüntü hakkında bilgiler içerir (okuma puanlanana kadar boş). Kokteyl Ayrıntıları kutusu, kokteyl bileşenleri hakkında meta veriler içerir. Gezinme panelindeki İleri düğmesini tıklatarak veya klavyede sağ ok tuşuna basarak bir sonraki kutucuğa geçin. Kuyu Numarasına Göre penceresine kuyu numarasını girerek belirli bir kuyuya gidin. Tüm Tarihleri Göster kutusunu işaretleyerek tüm okumaları (GUI’ye aktarılanların) görüntüleyin. Tüm Spektrumları Göster kutusunu işaretleyerek tüm spektrumları (GUI’ye aktarılanların) görüntüleyin. Her spektrum görüntüsünü ayrı ayrı görüntülemek için Spektrumu Değiştir düğmesine tıklayın. MARCO algoritmasını kullanarak kristal görüntüleri, önce pencerenin sol tarafındaki listeden belirli bir çalıştırmayı vurgulayarak puanlayın. Ardından, Seçilen Çalıştırmayı Sınıflandır düğmesine tıklayın. 1.536 kuyunun tamamı için bir görüntüleme okuması yapıldıktan sonra Görüntü Ayrıntıları penceresinde MARCO puanlama bilgilerini görüntüleyin.NOT: Sınıflandırma, bilgisayar hızına ve kullanılabilir belleğe bağlı olarak genellikle 2-5 dakika sürer. Algoritma, içeriği “kristal”, “berrak”, “çökeltme” veya “diğer” sınıflara ayıran puanlar üretir. Her bir kuyucuğun sınıflandırmasıyla ilişkili sayısal değerler, o sınıfın kuyu içeren nesnelerinin olasılığını yansıtır.Görüntü Filtreleme panelinde istediğiniz kutuları işaretleyip Filtreleri Gönder düğmesini tıklatarak puanlanan görüntülerin bir alt kümesini görüntüleyin. Örneğin, Kristaller ve MARCO kutularını işaretleyip Filtreleri Gönder’e tıklayarak yalnızca MARCO tarafından kristal olarak sınıflandırılan görüntüleri görüntüleyin. “İnsan tarafından puanlanan” kümesini oluşturmak için kristal görüntüleri manuel olarak puanlayın. Uygun düğmeye tıklayarak bir kuyuya puan atayın (“kristal”, “temizle”, “çökelt” veya “diğer” düğmeleri pencerenin altındaki Sınıflandırma panelinde bulunur). Alternatif olarak, puanı atamak için klavyedeki sayısal tuş takımını kullanın (1 = “kristal”, 2 = “temizle”, 3 = “çökelt”, 4 = “diğer”). İnsan tarafından puanlanan bir görüntüyü Favori’yi işaretleyerek “favori” olarak mı belirleyeceksiniz?kutu.NOT: Kristaller ve İnsan kutularını işaretleyip Filtreleri Gönder’e tıklayarak yalnızca bir insan tarafından kristal olarak sınıflandırılan görüntüleri görüntüleyin. Filtreleme panelindeki Sık Kullanılanlar kutusuna tıklandığında, döndürülen görüntüler daha da daraltılır ve yalnızca sık kullanılanlar olan insan puanlı kristal görüntüler döndürülür. Aynı anda birden fazla kuyuyu görüntülemek için Plaka Görüntüleyici sekmesini kullanın. Kontroller panelindeki ikinci Plaka Görüntüleyici sekmesinde, Plaka Başına Görüntüler bölümündeki açılır menüden 16, 64 veya 96 görüntü seçin. İlgilenmeyen görüntüleri grileştirmek için Görüntü Filtreleme Sekmesini kullanın. Görüntüleri filtrelemek için Filtre Uygula kutusunu seçin.NOT: Örneğin, “insan” ve “kristal” kutularını seçin ve yalnızca bir insan tarafından kristal olarak puanlanan kuyular kolayca görülebilir.Bir sonraki 16/64/96 görüntü kümesini görüntülemek için İleri düğmesine tıklayarak Plaka Görüntüleyici sekmesinde gezinin. Varsayılan olarak, kristal olarak puanlanan görüntüler kırmızı, net olarak puanlananlar mavi, çökelti olarak puanlananlar yeşil ve diğerleri olarak puanlananlar turuncudur. Açılır menüleri kullanarak renkleri değiştirin. Etiketler sekmesindeki çeşitli kutuları işaretleyerek kuyularda görüntülenecek bilgileri seçin. Geçerli görünümün görüntü dosyasını kaydetmek için Görünümü Kaydet’e tıklayın. Çok kuyucuklu görüntü için parlak alan, SHG ve UV-TPEF görüntüleri arasında geçiş yapmak üzere Spektrumu Değiştir’e tıklayın. Dışa Aktar’a tıklayın ve puanlanan dosyaları diğer programlarda kullanmak üzere dışa aktarmak için açılır menüden uygun dosya türünü seçin.NOT: CSV (virgülle ayrılmış değerler) dosyaları, Microsoft Excel veya Google E-Tablolar gibi e-tablo programlarıyla uyumludur. JSON (JavaScript Object Notation) dosyaları çoğu metin düzenleyicisiyle açılabilir. PPTX (PowerPoint Sunumu), parlak alan, UV-TPEF ve SHG görüntülerinin karşılaştırılması da dahil olmak üzere Polo’dan görüntüleri görüntülemek için kullanılabilir. Dosyalar MARCO Polo GUI’de yeniden açılmak üzere .xtal biçiminde kaydedilir.Sayfanın üst kısmındaki Dosya’ya tıklayıp Kaydet, Çalıştır veya Farklı Kaydet’i seçerek .xtal biçimindeki bir dosyayı kaydedin. Bir dosya adı ve dizin konumu sağlayın. İçe Aktar’a tıklayıp Görüntüler’i ve ardından Kaydedilmiş Çalıştırma’dan seçeneğini belirleyerek .xtal biçimindeki dosyaları açın. Uygun dosya konumuna göz atın, dosya adına tıklayın ve ardından Aç’a tıklayın.

Representative Results

1.536 kuyucuklu kristal tarama deneyinin sonuçları, 0. günde (negatif kontrol), 1. günde, 1. haftada, 2. haftada, 3. haftada, 4. haftada ve 6. haftada toplanan yedi tam parlak alan görüntü setinden oluşmaktadır (Şekil 4). SONICC görüntüleri, 23 ° C’de inkübe edilen plakalar için 4 haftalık zaman noktasında ve 4 ° C veya 14 ° C’de inkübe edilen plakalar için 6 haftalık zaman noktasında toplanır. Görüntüler toplandıkça yüklenecektir. Kristalleşme tarama deneyi 6 hafta sonra sona erer. 1.536 delikli plaka kurulumu, tüm tarama deneylerinin aynı plaka içinde yürütülmesine izin verir, böylece numune tüketimini sınırlar ve görüntülemeyi kolaylaştırır ve görüntüleme yöntemleri arasında doğrudan karşılaştırma yapar. Tek bir kokteyl koşulu için kristal büyümesinin zaman seyri için temsili sonuçlar Şekil 4’te gösterilmiştir. Deney boyunca otomatik plaka görüntüleme, parlak alan görüntüleme ile hem hızlı hem de yavaş büyüyen kristallerin tanımlanmasına izin verir. UV-TPEF ve SHG görüntüleme, parlak alan görüntüleme ile gözlenen isabetlerin çapraz doğrulanmasına izin verir ve gözlenen kristallerin sırasıyla proteinli ve kristalin olduğunu gösterir (Şekil 5A, B). Ayrıca, SONICC görüntüleme, çökelti veya filmler (Şekil 5C) veya aksi takdirde çökelti ile karıştırılabilecek mikrokristaller (Şekil 5D) tarafından görsel olarak gizlenen kristallerin tanımlanmasını sağlar. Bazı kristaller için, SHG sinyalinin eksikliği diskalifiye edici değildir, çünkü bazı nokta grupları, Şekil 5C’deki tetragonal thaumatin kristali tarafından örneklendiği gibi, bir SHG sinyali35,36 üretmez. Tersine, triptofan kalıntıları olmayan proteinler için UV-TPEF sinyalinin eksikliği beklenmelidir. UV-TPEF ve SHG sinyallerinin gözlemlenmesi, parlak alanda ortaya çıkacak ve güçlü bir pozitif SHG sinyali sergileyecek, ancak bir UV-TPEF sinyalinden yoksun olacak protein olmayan tuz kristallerinin tanımlanmasını da kolaylaştırır (Şekil 5E). Plaka kurulumu için görüntü analizi, HWI sunucularından ftp veri aktarımını da paketleyen MARCO Polo GUI ile kolaylaştırılmıştır (FileZilla ile dosya aktarımına alternatif olarak). MARCO Polo GUI, kolayca gezinilebilen plaka ve görüntü görüntülemeye izin verir ve MARCO algoritmasını kullanarak hesaplamalı görüntü puanlaması gerçekleştirir, böylece görüntü sonuçları HTX Center’dan hızlı bir şekilde indirilebilir, görüntülenebilir ve analiz edilebilir. MARCO Polo GUI’de uygulandığı gibi MARCO puanlama algoritması, 1.536 kuyucuklu plakanın tamamından görüntüleri 5 dakikadan daha kısa sürede puanlayabilir. MARCO algoritması tarafından kristal olarak işaretlenen görüntüler daha sonra görüntülenmek üzere Polo GUI tarafından sıralanabilir. MARCO algoritması, kristal tanımlama ve herhangi bir pozitif isabeti kaçırmamak için yanlış negatifleri en aza indirmek için optimize edildiğinden, puanlama yanlış pozitif bayraklarla sonuçlanabilir. Bununla birlikte, MARCO’nun kristal içerme olasılığı yüksek kuyulara odaklanarak incelenmesi gereken görüntü kümesini sınırlama yeteneği, kullanıcılar için veri işleme yükünde önemli bir azalmaya neden olmaktadır. Algoritmanın kullanıcı dostu MARCO Polo görüntüleme platformunda uygun şekilde uygulanması, görüntüleri MARCO puanlarına göre sıralama yeteneği ile, kullanıcının veri kümesini hızlı bir şekilde analiz etme ve kristal vuruşlarını doğru bir şekilde belirleme yeteneğini büyük ölçüde geliştirir. Şekil 1: HTX Merkezi’nde gerçekleştirilen yüksek verimli 1.536 kuyucuklu kristalizasyon tarama deneyinin şeması. (1) Bu adımda, her bir kuyucuğa 5 μL parafin yağı ve 200 nL kokteyl eklenir (protokol adım 3.1 ve adım 3.5). Sağda sadece yağ ve kokteyl içeren bir kuyunun karikatür illüstrasyonu ve temsili bir resim gösterilmektedir. (2) Örnekler HTX Merkezine ulaşır (protokol adım 5.1). 3) Bu adımda, her bir kuyucuğa 200 nL numune eklenir (protokol adımı 5.4). (4) 1.536 kuyunun tamamı, parlak alan görüntüleme, 5) ve UV-TPEF ve SHG modaliteleri (protokol adım 6) kullanılarak zaman içinde izlenir. 6) AI özellikli açık kaynaklı GUI, kristalleşme görüntülerini görüntülemek, puanlamak ve analiz etmek için kullanılır (protokol adımı 7). Kısaltmalar: HTX = yüksek verimli kristalleşme; UV-TPEF = UV-iki-foton uyarılmış floresan; SHG = ikinci harmonik nesil; AI = yapay zeka; GUI = grafik kullanıcı arayüzü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Parlak alan, UV-TPEF ve SHG görüntüleme kullanılarak görüntülenen, tarama deneyleri içeren tek 1.536 kuyucuklu plakalar. 1.536 kuyucuklu plakalar, ölçek için bir Amerikan kuruşu ile gösterilir (üstte). Her tarama deneyi, kurulumdan önce bir kez ve parlak alan görüntüleme ile örnek eklendikten sonra altı kez görüntülenir (toplam yedi parlak alan görüntü kümesi, solda). Plaklar 4 hafta veya 6 haftada UV-TPEF (merkez) ve SHG (sağ) görüntülemeye tabi tutulur. Kısaltmalar: UV-TPEF = UV-iki-foton uyarılmış floresan; SHG = ikinci harmonik nesil. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: 1.536 delikli plakaların nasıl oluşturulduğunu gösteren şematik. On altı adet 96 delikli DW bloğu, dört adet 384 delikli plakayı damgalamak için kullanılır ve her 384 delikli plakanın her bir çeyreği kristalizasyon kokteylleri dağıtılarak doldurulur. Dört adet 96 delikli DW bloğu, bir adet 384 delikli plakayı (ortada) doldurur. Tek 1.536 delikli plakayı (sağda) damgalamak için dört adet 384 delikli plaka kullanılır. Kısaltma: DW = derin kuyu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: 1.536 kuyucuklu bir tarama deneyinde tek bir kuyunun temsili zaman seyri. Plakalar, numune kurulumundan önce (0. gün) ve ayrıca 1. gün, 1. hafta, 2. hafta, 3. hafta, 4. ve 6. haftalarda parlak alan görüntüleme ile görüntülenir. 23 °C’de inkübe edilen plakalar 4. haftada SONICC ile görüntülenir. Ölçek çubukları = 80 μm (parlak alan), 200 μm (SHG, UV-TPEF). Kısaltmalar: SONICC = kiral kristallerin ikinci dereceden doğrusal olmayan görüntülenmesi; UV-TPEF = UV-iki-foton uyarılmış floresan; SHG = ikinci harmonik nesil. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: HT 1.536 kristal tarama deneyleri için temsili görüntüleme sonuçları. Brightfield, UV-TPEF ve SHG görüntüleme sonuçları beş örnek kuyucuk için gösterilmiştir. (A,B) Brightfield, UV-TPEF ve SHG görüntüleme ile gözlenen protein kristalleri her üç görüntüleme yönteminde de açıkça görülmektedir. (C) Parlak alan görüntülemede film tarafından gizlenen bir protein kristali UV-TPEF görüntüleme ile görülebilir; nokta grubu uyumsuzluğu nedeniyle SHG görüntüleme ile kristal gözlenmez. (D) UV-TPEF ve SHG görüntüleme ile doğrulanan ve aksi takdirde çökelti olarak kabul edilebilecek mikrokristal örneği. (E) Parlak alan ve SHG görüntüleme ile kristal gibi görünen ancak UV-TPEF sinyali göstermeyen tuz kristalleri örneği. Ölçek çubukları = 200 μm. Kuyu çapı = 0,9 mm. Kısaltmalar: UV-TPEF = UV-iki-foton uyarılmış floresan; SHG = ikinci harmonik nesil. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Şekil S1: Görüntü dosyalarını MARCO Polo’da açma. Görüntü dosyaları MARCO Polo GUI içinde İçe Aktarma | Üst kısımdaki Görüntüler sekmesi (a). Dosyaların doğrudan MARCO Polo (a) içindeki FTP’den aracı aracılığıyla da aktarılabileceğini veya protokol adımı 7.2’de açıklandığı gibi FileZilla aracılığıyla aktarılabileceğini unutmayın. Daha önce indirilmiş dosyaları içe aktarmak için Görseller | Rar Arşivi / Dizininden. Görüntülenen açılır pencerede, Klasör (b) için Gözat’ı seçin ve plaka görüntüsü dosyalarının kaydedildiği dosya dizinine gidin. Dosyalar Seçili Yollar penceresine (c) girdikten sonra, bir dosyayı vurgulayın ve İçe Aktarma Çalıştırmaları’na (d) tıklayın. MARCO Polo GUI, görüntülerle birlikte içe aktarılacak doğru Kokteyl Dosyası meta verilerini tanımlar. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Yöntem, mikroparti-under-oil formatında 1.536 ayrı kristalizasyon deneyi için 500 μL kadar az numune gerektiren protein kristalizasyon taraması için yüksek verimli bir boru hattını açıklamaktadır. Boru hattı, deney kurulumuna hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde yardımcı olmak için sıvı işleme robotlarına ve kristal vuruşlarını tanımlamak ve izole etmek için MARCO algoritmasını kullanarak 1.536 delikli plaka görüntülerini analiz etmek üzere özelleştirilmiş hesaplamalı görüntü analizi kaynağı MARCO Polo’ya güveniyor.

Bireysel eleme damlalarının küçük hacmi (1:1 numune:kokteyl oranı ile toplam 400 nL), pozitif kristalleşme koşullarını tanımlamak için son derece küçük numune hacimlerinin gerekli olduğu anlamına gelir. Bu küçük damla boyutları mutlaka geleneksel döngü ile avlanamayan küçük kristaller üretir. 1.536 plakadan hasat için yöntemler geliştirilmiştir37; Ek olarak, kristalli plakalar, yerinde veri toplama38 için doğrudan senkrotron kaynaklarında kullanılmıştır. Bu kristalleri toplamak için sağlam bir yöntem geliştirilirse, senkrotron teknolojisindeki ve mikro odaklı ışınlardaki ilerlemeler, yararlı veri kümelerinin elde edilmesini daha da sağlayacaktır. Ek olarak, elde edilen kristaller potansiyel olarak optimizasyon çabaları için tohum olarak kullanılabilir.

SONICC görüntüleme, hem küçük protein kristallerini hem de çökelti altında gizlenmiş protein kristallerini tanımlamada açıkça avantajlıdır. Bu avantajlara rağmen, tüm numune tipleri SHG ve UV-TPEF görüntülemeye uygun değildir. Örneğin, aromatik triptofan kalıntıları az olan veya hiç olmayan proteinler belirsiz bir UV-TPEF sinyali gösterecektir. Ayrıca, sentrosimetrik gruplar veya nokta grubu 432 dahil olmak üzere belirli uzay gruplarındaki kristaller, SHG görüntüleme ile tespit edilmeyecektir. Floroforlu numuneler bazen SHG sinyaline müdahale eder, bu da sinyalin iptaline veya yoğunluğunun artmasına neden olur, bu da metal içeren proteinler ve floresan moieties içeren proteinler için SHG sinyallerinin dikkatli bir şekilde yorumlanması gerektiği anlamına gelir. Bununla birlikte, birçok durumda, bir SHG veya UV-TPEF sinyalinin yokluğunu rasyonelleştirmek mümkündür ve bu sinyallerin eksikliği mutlaka bir protein kristalinin varlığını dışlamamalıdır.

Mikroparti-under-oil formatı, yüksek verimli kristalografi için kullanılan daha yaygın buhar difüzyon yöntemine bir alternatif sağlar. Daha da önemlisi, kristalizasyon formatı, yüksek verimli tarama çabaları için farklı kristalizasyon formatlarının kullanılması için bir gerekçe sağlayan isabet tanımlama39’u etkiler. Otomatik görüntüleme ve SONICC özellikli modaliteler, 6 haftalık deneysel zaman kursu boyunca protein kristallerinin hızlı bir şekilde tanımlanmasına yardımcı olur. Son olarak, MARCO Polo GUI, kullanıcıların optimizasyon için umut verici isabet kuyularını belirlemek için 1.536 koşuldan görüntüleri hızlı bir şekilde analiz etmelerini sağlar. HTX Center’daki yetenekler, robotik özellikli yüksek verimli deney kurulumu da dahil olmak üzere, analizler için son teknoloji görüntüleme ve hesaplama araçlarıyla birleştiğinde, araştırmacıları kristal tabanlı yapısal çalışmalarda birincil bir darboğazı etkili bir şekilde ele almaları için güçlendirerek yapısal biyoloji topluluğuna büyük bir katkı sağlamaktadır: kristalleşme koşullarını bulmak.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Kullanıcılarımıza, değerli örneklerini kristal tarama için bize emanet ettikleri ve yapısal biyoloji topluluğuna daha iyi hizmet vermek için kaynaklarımızı iyileştirmemize ve geliştirmemize yardımcı olan kritik geri bildirim ve talepler sağladıkları için şükranlarımızı sunmak istiyoruz. Ayrıca MARCO Polo GUI’nin geliştirilmesine öncülük eden Ethan Holleman, Dr. Lisa J Keefe ve Dr. Erica Duguid’e de teşekkür ederiz. HWI meslektaşlarına, özellikle Dr. Diana CF Monteiro’ya destekleri ve önerileri için teşekkür ederiz. Ulusal Sağlık Enstitüleri, R24GM141256’nın finansman desteğini kabul ediyoruz.

Materials

1536 Well Imp@ct LBR LoBase Greiner Bio-One 790 801
Acetic acid Hampton Research HR2-853
AlumaSeal II Sealing Film Hampton Research HR8-069
Ammonium bromide Molecular Dimensions MD2-100-247
Ammonium chloride Hampton Research HR2-691
Ammonium hydroxide Hampton Research HR2-855
Ammonium nitrate Hampton Research HR2-665
Ammonium phosphate dibasic Hampton Research HR2-629
Ammonium phosphate monobasic Hampton Research HR2-555
Ammonium sulfate Hampton Research HR2-541
Ammonium thiocyanate Molecular Dimensions MD2-100-301
Bicine pH 9.0 Hampton Research HR2-723
Bis-tris propane pH 7.0 Hampton Research HR2-993-08
Calcium acetate Hampton Research HR2-567
Calcium chloride dihydrate Hampton Research HR2-557
CAPS pH 10.0 Rigaku Reagents none given
ClearSeal Film Hampton Research HR4-521
Cobalt sulfate heptahydrate Molecular Dimensions MD2-100-42
Crystal Screen HT screen Hampton Research HR2-130
Formulator Formulatrix
Glycerol Hampton Research HR2-623
Gryphon liquid handling robot Art Robbins Instruments
HEPES pH 7.0 Hampton Research HR2-902-03
HEPES pH 7.5 Hampton Research HR2-902-08
HWI HTX Center sample submission form https://hwi.buffalo.edu/high-throughput-crystallization-screening-center-sample-submission-form/    
Hydrochloric acid Hampton Research HR2-581
Index HT screen Hampton Research HR2-134
Ionic Liquid screen Hampton Research HR2-214
Lithium bromide Molecular Dimensions MD2-100-312
Lithium chloride Hampton Research HR2-631
Lithium sulfate monohydrate Hampton Research HR2-545
Magnesium acetate tetrahydrate Hampton Research HR2-561
Magnesium chloride hexahydrate Hampton Research HR2-559
Magnesium nitrate hexahydrate Hampton Research HR2-657
Magnesium sulfate heptahydrate Hampton Research HR2-821
Manganese chloride tetrahydrate Millipore Sigma 63535-50G
Manganese sulfate monohydrate Molecular Dimensions MD2-100-310
MARCO Polo GUI download https://hauptman-woodward.github.io/Marco_Polo/
Matrix Platemate 2 x 3 liquid handling robot Thermo Scientific
MES pH 6.0 Hampton Research HR2-943-09
Mosquito liquid handling robot SPTLabtech
Paraffin Oil/White Mineral Oil Saybolt Viscosity 340-365 at 100 °F  Sigma Aldrich PX0045-3
PEG 1000 Hampton Research HR2-523
PEG 2000 Hampton Research HR2-592
PEG 20000 Hampton Research HR2-609
PEG 3350 Hampton Research HR2-527
PEG 400 Hampton Research HR2-603
PEG 4000 Hampton Research HR2-529
PEG 6000 Hampton Research HR2-533
PEG 8000 Hampton Research HR2-535
PEG/Ion HT screen Hampton Research HR2-139
PEGRx HT screen Hampton Research HR2-086
Plate reservations htslab@hwi.buffalo.edu
Potassium acetate Hampton Research HR2-671
Potassium bromide Hampton Research HR2-779
Potassium carbonate Molecular Dimensions MD2-100-311
Potassium chloride Hampton Research HR2-649
Potassium nitrate Hampton Research HR2-663
Potassium phosphate dibasic Hampton Research HR2-635
Potassium phosphate-monobasic Hampton Research HR2-553
Potassium phosphate-tribasic Molecular Dimensions MD2-100-309
Potassium thiocyanate Hampton Research HR2-695
Rock Imager 1000 with SONICC Formulatrix
Rock Imager 54 Formulatrix
Rubidium chloride Millipore Sigma R2252-10G
SaltRx HT screen Hampton Research HR2-136
Silver Bullets screen Hampton Research HR2-096
Slice pH screen Hampton Research HR2-070
Sodium acetate pH 5.0 Hampton Research HR2-933-15
Sodium bromide Hampton Research HR2-699
Sodium chloride Hampton Research HR2-637
Sodium citrate pH 4.2 Hampton Research HR2-935-01
Sodium citrate pH 5.6 Hampton Research HR2-735
Sodium hydroxide Hampton Research HR2-583
Sodium molybdate dihydrate Molecular Dimensions MD2-100-207
Sodium nitrate Hampton Research HR2-661
Sodium phosphate monobasic Hampton Research HR2-551
Sodium thiosulfate pentahydrate Molecular Dimensions MD-100-307
StockOptions Polymer screen Hampton Research HR2-227
Tacsimate pH 7 Hampton Research HR2-755
TAPS pH 9.0 bioWORLD 40121071
Tris pH 8 Hampton Research HR2-900-11
Tris pH 8.5 Hampton Research HR2-725
ViaFLO 384 Integra
ViaFLO 384 384 channel pipettor head (0.5-12.5µL) Integra
ViaFLO 384 96 channel pipettor head (300µL) Integra
Zinc acetate dihydrate Hampton Research HR2-563
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. PDB data distribution by experimental method and molecular type. RCSB Protein Data Bank Available from: https://www.rcsb.org/stats/summary (2022)
  2. Maveyraud, L., Mourey, L. Protein X-ray crystallography and drug discovery. Molecules. 25 (5), 1030 (2020).
  3. Dupeux, F., Röwer, M., Seroul, G., Blot, D., Márquez, J. A. A thermal stability assay can help to estimate the crystallization likelihood of biological samples. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (11), 915-919 (2011).
  4. Elbasir, A., et al. DeepCrystal: A deep learning framework for sequence-based protein crystallization prediction. Bioinformatics. 35 (13), 2216-2225 (2019).
  5. Zucker, F. H., et al. Prediction of protein crystallization outcome using a hybrid method. Journal of Structural Biology. 171 (1), 64-73 (2010).
  6. George, A., Wilson, W. W. Predicting protein crystallization from a dilute solution property. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 50 (4), 361-365 (1994).
  7. Jia, Y., Liu, X. -. Y. From surface self-assembly to crystallization: prediction of protein crystallization conditions. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (13), 6949-6955 (2006).
  8. Slabinski, L., et al. XtalPred: A web server for prediction of protein crystallizability. Bioinformatics. 23 (24), 3403-3405 (2007).
  9. Abrahams, G. J., Newman, J. BLASTing away preconceptions in crystallization trials. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 75 (3), 184-192 (2019).
  10. Rosa, N., et al. Tools to ease the choice and design of protein crystallisation experiments. Crystals. 10 (2), 95 (2020).
  11. Newman, J., et al. On the need for an international effort to capture, share and use crystallization screening data. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 68 (3), 253-258 (2012).
  12. Lynch, M. L., Dudek, M. F., Bowman, S. E. A searchable database of crystallization cocktails in the PDB: analyzing the chemical condition space. Patterns. 1 (4), 100024 (2020).
  13. Jancarik, J., Kim, S. -. H. Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins. Journal of Applied Crystallography. 24 (4), 409-411 (1991).
  14. Carter, C. W. Efficient factorial designs and the analysis of macromolecular crystal growth conditions. Methods. 1 (1), 12-24 (1990).
  15. McPherson, A., Cudney, B. Searching for silver bullets: An alternative strategy for crystallizing macromolecules. Journal of Structural Biology. 156 (3), 387-406 (2006).
  16. McPherson, A., Nguyen, C., Cudney, R., Larson, S. The role of small molecule additives and chemical modification in protein crystallization. Crystal Growth & Design. 11 (5), 1469-1474 (2011).
  17. Luft, J. R., DeTitta, G. T. A method to produce microseed stock for use in the crystallization of biological macromolecules. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 55 (5), 988-993 (1999).
  18. Thakur, A. S., et al. Improved success of sparse matrix protein crystallization screening with heterogeneous nucleating agents. PLoS One. 2 (10), 1091 (2007).
  19. Chayen, N. E., Stewart, P. D. S., Blow, D. M. Microbatch crystallization under oil-a new technique allowing many small-volume crystallization trials. Journal of Crystal Growth. 122 (1-4), 176-180 (1992).
  20. Luft, J. R., et al. A deliberate approach to screening for initial crystallization conditions of biological macromolecules. Journal of Structural Biology. 142 (1), 170-179 (2003).
  21. Luft, J. R., Snell, E. H., DeTitta, G. T. Lessons from high-throughput protein crystallization screening: 10 years of practical experience. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (5), 465-480 (2011).
  22. Lynch, M. L., Snell, M. E., Potter, S. A., Snell, E. H., Bowman, S. E. 20 years of crystal hits: Progress and promise in ultrahigh-throughput crystallization screening. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. , (2023).
  23. Segelke, B. W. Efficiency analysis of sampling protocols used in protein crystallization screening. Journal of Crystal Growth. 232 (1-4), 553-562 (2001).
  24. Luft, J. R., Newman, J., Snell, E. H. Crystallization screening: the influence of history on current practice. Acta Crystallographica Section F. 70 (7), 835-853 (2014).
  25. Mlynek, G., Kostan, J., Leeb, S., Djinovic-Carugo, K. Tailored suits fit better: Customized protein crystallization screens. Crystal Growth & Design. 20 (2), 984-994 (2019).
  26. Mueller-Dieckmann, J. The open-access high-throughput crystallization facility at EMBL Hamburg. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 62 (12), 1446-1452 (2006).
  27. Weber, P., et al. High-throughput crystallization pipeline at the crystallography core facility of the Institut Pasteur. Molecules. 24 (24), 4451 (2019).
  28. Lin, Y. What’s happened over the last five years with high-throughput protein crystallization screening. Expert Opinion on Drug Discovery. 13 (8), 691-695 (2018).
  29. Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55 (4), 379-386 (2011).
  30. Madden, J. T., DeWalt, E. L., Simpson, G. J. Two-photon excited UV fluorescence for protein crystal detection. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (10), 839-846 (2011).
  31. Fleming, A. M., et al. Second harmonic generation interrogation of the endonuclease APE1 binding interaction with G-quadruplex DNA. Analytical Chemistry. 94 (43), 15027-15032 (2022).
  32. Bruno, A. E., et al. Classification of crystallization outcomes using deep convolutional neural networks. PLoS One. 13 (6), 0198883 (2018).
  33. Holleman, E. T., Duguid, E., Keefe, L. J., Bowman, S. E. Polo: An open-source graphical user interface for crystallization screening. Journal of Applied Crystallography. 54 (2), 673-679 (2021).
  34. Niesen, F. H., et al. An approach to quality management in structural biology: Biophysical selection of proteins for successful crystallization. Journal of Structural Biology. 162 (3), 451-459 (2008).
  35. Padayatti, P., Palczewska, G., Sun, W., Palczewski, K., Salom, D. Imaging of protein crystals with two-photon microscopy. Biochemistry. 51 (8), 1625-1637 (2012).
  36. Haupert, L. M., DeWalt, E. L., Simpson, G. J. Modeling the SHG activities of diverse protein crystals. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (11), 1513-1521 (2012).
  37. Luft, J. R., Grant, T. D., Wolfley, J. R., Snell, E. H. A new view on crystal harvesting. Journal of Applied Crystallography. 47 (3), 1158-1161 (2014).
  38. Bruno, A. E., Soares, A. S., Owen, R. L., Snell, E. H. The use of haptic interfaces and web services in crystallography: An application for a ‘screen to beam’ interface. Journal of Applied Crystallography. 49 (6), 2082-2090 (2016).
  39. Baldock, P., Mills, V., Stewart, P. S. A comparison of microbatch and vapour diffusion for initial screening of crystallization conditions. Journal of Crystal Growth. 168 (1-4), 170-174 (1996).

Tags

High-throughput ScreeningProtein CrystallographyCrystal HitsStructural BiologyComputational Structure PredictionMicro EDSerial CrystallographyAdvanced ImagingUVTBFSHGMarco AlgorithmCrystallization CocktailNon-linear Optical MethodsX-ray Crystallography1536-well Microbatch-under-oil PlateAutomated High-throughputState-of-the-art Imaging

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Budziszewski, G. R., Snell, M. E., Wright, T. R., Lynch, M. L., Bowman, S. E. J. High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography. J. Vis. Exp. (193), e65211, doi:10.3791/65211 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image