タンパク質結晶構造解析のためのクリスタルヒットを得るためのハイスループットスクリーニング(英語)

1. 16個の96ウェル深井戸ブロック用のカクテルの準備または購入 96ウェルディープウェル(DW)ブロックに分注して、自社で生成されたケミカルカクテルを調製します。ロボット式リキッドハンドラーを使用して、塩、バッファー、ポリマー、および水のストック溶液を分注および混合します。 市販の96ウェルDWブロックスクリーンに、ロボットリキッドハンドラーまたはマルチチャンネルピペットを使用して、社内で改良されたケミカルカクテルを調製します。 市販のDWブロックを購入します。 ラベルの付いた96ウェルDWブロックを-20°Cで12〜18か月間保管します。注:ステップ1.1で準備されたカクテル。および 1.2.10/16 96ウェルDWブロックを充填し、5/16 96ウェルDWブロックは購入時に使用されます。添加剤スクリーンの沈殿を避けるために、スクリーン内の1つの96ウェルDWブロックが1,536ウェルプレート分注時に設置されます(セクション3を参照)。 2. カクテルを384ウェルプレートに分注 96ウェルDWブロックを4°Cで一晩解凍します。384ウェルプレートの調製を開始する前に、室温(20〜23°C)に戻します。注意: カクテルプレートの準備には室温が適しています。これらのプレートを調製する際の主な関心事は、液体処理装置を詰まらせ、カクテル成分の濃度の予測不可能な変化につながる可能性のある沈殿物を回避することです。 必要に応じて反転によってブロックを完全に混合し、持続的な不透明な沈殿物を溶解します。ウェルに沈殿物が含まれている場合は、ブロックを30°Cに温めて溶解します。 96シリンジまたはピペッターヘッドを備えたリキッドハンドリングロボットを使用して、4つの96ウェルDWブロックから1つの384ウェルプレートに50 μLのカクテル溶液を供給します。4つの96ウェルDWブロックは、象限が充填されるように384ウェルプレートに打ち抜かれます(例えば、96-DW1のA1から384プレート1のA1、96-DW2のA1から384プレート1のB1など)。(図3)。 16個の96ウェルDWブロックのうち15個を384ウェルプレートに送達して保管します。 384ウェルプレートを-20°Cで最大6か月間保管し、1,536ウェルプレートの調製に使用します。 3. オイルと結晶化カクテルを使用した1,536ウェルプレートの準備 ゆっくりと吸引および送達できるロボットリキッドハンドリングシステムを使用して、1,536ウェルプレートの各ウェルに5 μLのパラフィンオイルを供給します。オイルプレートを4°Cで最大6か月間保管します。 セクション2の384ウェルプレートを4°Cで一晩解凍します。プレートを反転させて溶液を混合し、沈殿物を溶解します。プレートを30°Cでインキュベートして、持続性沈殿物を溶解します。 添加剤スクリーンコンポーネントを調製するには、0.1 M HEPES pH 6.8、30% PEG3350を含む最終的な96ウェルDWブロックを使用し、リキッドハンドリングロボットまたはマルチチャンネルピペットを使用して市販の添加剤スクリーンと混合します。 ステップ3.3で調製した緩衝PEG3350溶液と添加剤スクリーニングの1:1混合物を、適切な384ウェルプレートで最終容量50 μLまで分注することにより、添加剤スクリーニング溶液を調製します。 384シリンジまたはピペッターヘッドを備えたリキッドハンドリングロボットを使用して、1,536ウェルプレートの各ウェルに200 nLのカクテル溶液を供給します。象限が満たされるように、4つの384ウェルプレートを1,536ウェルプレートに打ち抜きます(例:384-プレート1のA1から1,536ウェルプレートのA1、384-プレート1のA2から1,536ウェルプレートのA3など)。(図3)。 プレートを150 × g で5分間遠心分離してから、4°Cで最大4週間保存します。 4. サンプル提出 サンプルを提出するには、次のスクリーニング実行の予約期限前に予約メールを送信してください。スクリーニング実験の数、名前、PI、機関、およびサンプルの特別な取り扱い要件を含めます。スクリーニングは月に1回程度実施され、年間12回実施されます。 サンプルを発送する前に、サンプル送信フォームに記入してください。新規ユーザーの場合は、セクション7の結晶化画像のダウンロードに使用する パスワード を選択します。 確立されたユーザーの場合は、既存のパスワードを使用するか、この手順で パスワード を変更します。 サンプルを1.5 mLチューブに入れます。高分子が均質であり、結晶化を促進するために適切に濃縮されていることを確認してください。通常、硫酸アンモニウムまたはPEG 4,000で構成される結晶化前テストを使用して、テストされたサンプル濃度が透明な液滴または沈殿物34をもたらすかどうかを観察することにより、適切なサンプル濃度を調査します。注:純度と均質性をチェックするためにサンプル提出前に実施できる適切な品質テストには、SDS-PAGE、ゲルろ過、動的光散乱(DLS)などがあります。結晶化は、わずかな不純物の存在によっても影響を受ける可能性があります。現在、1,536ウェルプレートを1枚セットアップするには、500 μLのサンプル容量が必要です。サンプル量要件を減らすためのテストが進行中です。50 mMを超えるバッファー濃度や、スクリーン内で結晶化する可能性のあるリン酸塩の使用は避けてください。 10%w / vを超えるグリセロール濃度を含む過度の溶解補助剤は避けてください。 密閉容器内のドライアイス、ウェットアイス、または冷却パックを使用して、サンプルを安全に適切な温度に維持するようにパッケージ化します。 実行中に月曜日から水曜日に一晩サンプルを優先して出荷します。 サンプルが出荷されたら、追跡番号を電子メールで送信します。 5. 調製した1,536ウェルプレートでのサンプルセットアップ サンプルを開梱し、ユーザーが要求した温度ですぐにインキュベートします。 解凍したら、サンプルを10,000 × g で室温で2分間遠心分離します。セットアップ前に、サンプルを視覚的に観察して、サンプルの降水量、色、および状態を特定します。 1,536ウェルプレートを23°Cに温め、150 × g で5分間遠心分離します。ネガティブコントロールとして明視野イメージングを使用してカクテルのみのプレートを画像化します。注:すべてのプレートは、サンプルのセットアップ前に明視野イメージングで画像化されるため、サンプルを追加する前に、ネガティブコントロールとしてすでに結晶や破片が含まれているウェルを識別できます。さらに、結晶化カクテルが送 達されていないウェル の同定を可能にする。プレートを室温まで温めることで、プレート表面の結露がなくなり、鮮明な画像が得られます。 リキッドハンドリングロボットを使用して、1,536ウェルプレート内の各ウェルに200 nLのサンプルを分注します。プレートを150 × g で遠心分離し、プレートを4°C、14°C、または23°Cでインキュベートします。注:マイクロバッチアンダーオイル実験は、目的のオイルの下にタンパク質とカクテルを分注することにより、手作業でセットアップできます。ただし、再現性のある結果を得るには、各タンパク質とカクテルを1 μL以上使用することをお勧めします。 6. 1,536ウェルプレートの結晶形成をモニター サンプルを1,536ウェルプレートに添加した後、1日目および1週目、2週目、3週目、4週目、および6週目の明視野イメージングによる画像。 23°Cでインキュベートされているプレートの場合は4週間の時点で、14°Cまたは4°Cでインキュベートされているプレートの場合は6週間の時点で、SHGおよびUV-TPEFを使用してSONICCイメージングを実行します。注:SONICCイメージングのタイミングは、通常、これらの時点までに結晶が現れるため、ハイスループット1,536マイクロアッセイプレートの4週間および6週間の時点でスケジュールされます。油または蒸気拡散実験下で96ウェルマイクロバッチを修正する場合は、時間枠の早い段階でSONICCイメージングを実行することをお勧めします。 内部LIMSシステムを使用して、ユーザーアカウントに自動的に転送された実験画像にアクセスします。自動化されたhtslab電子メールデーモン を介して 、イメージングが発生したことをユーザーに通知します。 7. 画像解析 各.rarファイルの HWI ftp サイトからスクリーニング画像を取得します。注:1,536画面から出力される画像は、明視野画像、SHG画像、およびUV-TPEF画像を含む多数のファイルになります。各イメージングモダリティまたは時点は、個別の.rarファイルです。各.rarファイルは、開梱されると、特定のイメージングモダリティを使用して特定の時点での1,536ウェルプレートの各ウェルからの画像を含む。FileZilla クライアントまたはその他のオプションを使用して、ftp データにアクセスします。注: FileZilla クライアントは、計算上のクラッシュを最小限に抑えるために、大きなファイル転送ボリュームを管理するために推奨される方法です。FileZilla クライアントをユーザーのコンピューターにインストールする必要がある場合は、FileZilla ソフトウェアをダウンロードします。 FileZillaクライアントがすでにインストールされているか、インストール時に、 FileZillaアイコン をクリックしてソフトウェアを開きます。 ホストの ftp ウェブサイト、ユーザー名、およびパスワードを入力して、FileZilla からリモート ftp サーバーにログインします。 .rarファイルを目的のディレクトリにダウンロードします。 AI対応のオープンソースGUIを使用して、結晶化画像を表示、スコアリング、分析します。注: GUI は、ほとんどの Windows、Mac、および Linux オペレーティング システム (OS) で使用でき、OS 固有のダウンロード手順は GitHub サイトにあります。MARCO Poloは、HTXセンターで実装されたハイスループット1,536結晶化スクリーンのメタデータを組み込んだオープンソースのGUIです。GitHubから誰でもダウンロードして、他の研究室グループの特定のニーズを反映するように変更できます。ファイルをダウンロードした後、GUI で .rar ファイルを開きます( 補足図 S1 を参照)。[ インポート]をクリックし、ドロップダウンメニューから [画像 ]を選択して、[ Rarアーカイブ/ディレクトリから]を選択します。 ポップアップウィンドウで[フォルダ の参照 ]をクリックし、画像を含むフォルダに移動します。 目的のファイルを選択し、[ 開く]をクリックしてGUIにインポートします。ファイルが [選択したパス ]ウィンドウに表示されるまで待ちます。GUI にダウンロードする 1 つ以上のファイルを選択し、[ インポート実行] をクリックします。 GUIの スライドショービューア のウィンドウで最初のウェルの画像を表示するには、サンプル名の左側にある > 記号をクリックし、それをダブルクリックして適切な読み取り値を選択します(読み取り値は、画像明視野、UV-TPEF、またはSHGの日付とタイプ別に一覧表示されます)。 ウィンドウ全体のサイズを変更して画像を拡大します。[ イメージの詳細 ] ボックスには、スコアリング情報を含むイメージに関する情報が含まれています (読み取りがスコアリングされるまで空です)。 [カクテルの詳細 ] ボックスには、カクテル コンポーネントに関するメタデータが含まれています。 ナビゲーションパネルの[次へ]ボタンをクリックするか、キーボードの右矢印キーを押して、次のウェルに移動します。「井戸番号別」ウィンドウに井戸番号を入力して、特定の井戸に移動します。 (GUI にインポートされた)すべての読み取りを表示するには、[ すべての日付を表示(Show All Date )] チェックボックスをオンにします。 (GUI にインポートされたスペクトルの)すべてのスペクトルを表示するには、[ すべてのスペクトルを表示] チェックボックスをオンにします。[スペクトラムの入れ替え]ボタンをクリックして、各 スペクトラム 画像を個別に表示します。 最初にウィンドウの左側にあるリストから特定の実行を強調表示することにより、MARCOアルゴリズムを使用して結晶画像をスコアリングします。次に、[ 選択した実行の分類 ] ボタンをクリックします。1,536ウェルすべてについてイメージングリードがスコアリングされたら、 画像の詳細 ウィンドウでMARCOスコアリング情報を表示します。メモ: 分類には、コンピュータの速度と使用可能なメモリに応じて、通常 2 分から 5 分かかります。アルゴリズムは、コンテンツを「クリスタル」、「クリア」、「沈殿物」、または「その他」のクラスに分類するスコアを生成します。各井戸の分類に関連付けられた数値は、そのクラスのオブジェクトを含む井戸の尤度を反映します。スコアリングされた画像のサブセットを表示するには、[ 画像フィルタリング ]パネルで目的のボックスにチェックマークを付け、[ フィルターの送信 ]ボタンをクリックします。たとえば、MARCO によってクリスタルとして分類された画像のみを表示するには、[ クリスタル] ボックスと [MARCO ] ボックスにチェックマークを付け、[ フィルターの送信] をクリックします。 クリスタル画像を手動でスコアリングして、「ヒューマンスコア」セットを生成します。適切なボタンをクリックして、井戸にスコアを割り当てます(「クリスタル」、「クリア」、「沈殿物」、または「その他」ボタンは、ウィンドウの下部にある 分類 パネルにあります)。または、キーボードのテンキーを使用してスコアを割り当てます(1 =「クリスタル」、2 =「クリア」、3 =「沈殿物」、4 =「その他」)。人間が採点した画像を「お気に入り」として指定するには、[ お気に入り] にチェックマークを付けますか?箱。注:人間がクリスタルとして分類した画像のみを表示するには、[クリスタル]ボックスと[ヒューマン]ボックスにチェックマークを付け、[フィルターの送信]をクリックします。フィルタリングパネルのお気に入りボックスをクリックすると、返される画像がさらに絞り込まれ、お気に入りでもある人間がスコアを付けたクリスタル画像のみが返されます。 [プレート ビューアー] タブを使用して、一度に複数のウェルを表示します。コントロールパネルの2番目のプレートビューアタブで、[プレートあたりの画像]セクションのドロップダウンメニューから16、64、または96の画像を選択します。[画像フィルタリング]タブを使用して、関心のない画像をグレーアウトします。[フィルターの適用] ボックスを選択して、画像をフィルター処理します。注:たとえば、「人間」ボックスと「クリスタル」ボックスを選択すると、人間によってクリスタルとしてスコアリングされたウェルのみが簡単に表示されます。[プレートビューア]タブに移動し、[次へ]ボタンをクリックして、次の16/64/96画像のセットを表示します。デフォルトでは、結晶としてスコア付けされた画像は赤、クリアとしてスコア付けされた画像は青、沈殿物としてスコア付けされた画像は緑、その他としてスコア付けされた画像はオレンジです。ドロップダウンメニューを使用して色を変更します。 ウェルに表示する情報を選択するには、[ ラベル] タブのさまざまなボックスにチェックマークを付けます。 [ ビューの保存 ] をクリックして、現在のビューの画像ファイルを保存します。 スペクトラムの入れ替えをクリックして、マルチウェル画像の明視野、SHG、UV-TPEF画像を切り替えます。 [エクスポート ]をクリックし、ドロップダウンメニューから適切なファイルタイプを選択して、他のプログラムで使用するためにスコアリングされたファイルをエクスポートします。注: CSV (カンマ区切り値) ファイルは、Microsoft Excel や Google スプレッドシートなどのスプレッドシート プログラムと互換性があります。JSON (JavaScript オブジェクト表記法) ファイルは、ほとんどのテキスト エディターで開くことができます。PPTX(PowerPointプレゼンテーション)は、明視野、UV-TPEF、およびSHG画像の比較を含む、ポロからの画像を表示するために使用できます。ファイルは.xtal形式で保存され、マルコポーロGUIで再度開くことができます。.xtal 形式のファイルを保存するには、ページの上部にある [ ファイル ] をクリックし、[実行 の保存 ] または [ 実行に名前を付けて保存] を選択します。ファイル名とディレクトリの場所を指定します。 .xtal形式のファイルを開くには、[ インポート ]をクリックして[ 画像 ]、[ 保存した実行から]の順に選択します。適切なファイルの場所を参照し、ファイル名をクリックして、[ 開く] をクリックします。