JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Высокопроизводительный скрининг для получения кристаллических попаданий для кристаллографии белка

Published: March 10, 2023
doi:
10.3791/65211
, , , ,
1National High-Throughput Crystallization Center,Hauptman-Woodward Medical Research Institute, 2Department of Biochemistry, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences,The State University of New York

Summary

В этом протоколе подробно описывается высокопроизводительный кристаллизационный скрининг, начиная с подготовки 1,536 микротестовых пластин до конца 6-недельного экспериментального временного окна. Включены подробные сведения о настройке образца, полученной визуализации и о том, как пользователи могут выполнять анализы с помощью графического пользовательского интерфейса с поддержкой искусственного интеллекта для быстрого и эффективного определения условий кристаллизации макромолекул.

Abstract

Рентгеновская кристаллография является наиболее часто используемым методом различения макромолекулярных структур, но решающий этап кристаллизации белка в упорядоченную решетку, поддающуюся дифракции, остается сложным. Кристаллизация биомолекул в значительной степени определена экспериментально, и этот процесс может быть трудоемким и непомерно сложным для исследователей в учреждениях с ограниченными ресурсами. В Национальном центре высокопроизводительной кристаллизации (HTX) были внедрены высоковоспроизводимые методы для облегчения роста кристаллов, в том числе автоматизированная высокопроизводительная установка на 1,536 лунок для микропартии под маслом, предназначенная для отбора проб широкого спектра параметров кристаллизации. Планшеты контролируются с использованием самых современных методов визуализации в течение 6 недель, чтобы дать представление о росте кристаллов, а также точно различить ценные попадания кристаллов. Кроме того, реализация обученного алгоритма оценки искусственного интеллекта для идентификации попаданий кристаллов в сочетании с удобным интерфейсом с открытым исходным кодом для просмотра экспериментальных изображений упрощает процесс анализа изображений роста кристаллов. Здесь описаны ключевые процедуры и инструменты для приготовления коктейлей и кристаллизационных пластин, визуализации пластин и идентификации попаданий таким образом, чтобы обеспечить воспроизводимость и увеличить вероятность успешной кристаллизации.

Introduction

Даже в эпоху огромного прогресса в методах структурной биологии рентгеновская кристаллография продолжает оставаться надежным и популярным методом создания высококачественных структурных моделей макромолекул. Более 85% всех трехмерных структурных моделей, депонированных в Банк данных о белках (PDB), получены из структурных методов на основе кристаллов (по состоянию на январь 2023 года). 1 Кроме того, рентгеновская кристаллография остается незаменимой для решения белково-лигандных структур, важнейшего компонента процесса открытия и разработки лекарств2. Несмотря на то, что кристаллизация белка оставалась доминирующим методом структурной биологии на протяжении более полувека, методы прогнозирования вероятности кристаллизации на основе физических свойств3 или последовательности 4,5 все еще находятся в зачаточном состоянии.

Предсказание условий кристаллизации еще более неясно; Был достигнут ограниченный прогресс в прогнозировании вероятных условий кристаллизации даже для модельных белков 6,7. В других исследованиях была предпринята попытка определить условия кристаллизации на основе гомологии белка и условий, полученных из PDB 8,9,10. Однако предсказательная сила, которую можно найти в PDB, ограничена, поскольку депонируются только окончательные, успешные условия кристаллизации, что по необходимости пропускает часто обширные эксперименты по оптимизации, необходимые для точной настройки роста кристаллов. Кроме того, во многих записях PDB отсутствуют метаданные, содержащие эти детали, включая формулы коктейлей, формат кристаллизации, температуру и время кристаллизации11,12. Поэтому для многих белков, представляющих интерес, наиболее доступным способом определения условий кристаллизации является экспериментальное использование как можно большего количества условий в широком диапазоне химических возможностей.

Несколько подходов, позволяющих сделать кристаллизационный скрининг как можно более плодотворным и тщательным, были исследованы с большим эффектом, включая разреженные матрицы 13, неполный факториальный скрининг 14, добавки 15,16, посев 17 и зародышеобразующие агенты 18. Национальный центр HTX при Медицинском научно-исследовательском институте Хауптмана-Вудворда (HWI) разработал эффективный конвейер для кристаллизационного скрининга с использованием подхода19 «микропартия под маслом», в котором используются автоматизированные методы обработки жидкостей и визуализации для упрощения идентификации начальных условий кристаллизации с использованием сравнительно минимальных объемов образцов и коктейлей (рис. 1). Набор из 1 536 уникальных коктейлей основан на условиях, ранее определенных как способствующие росту кристаллов белка, и предназначен для химического разнообразия, чтобы отбирать широкий диапазон возможных условий кристаллизации20,21,22. Широкая выборка условий кристаллизации увеличивает вероятность наблюдения одного или нескольких отведений кристаллизации.

В литературе появилось несколько формальных анализов того, сколько условий необходимо для скрининга. Одно исследование было сосредоточено на компоновке выборки различных экранов и показало, что случайная выборка компонентов (аналогичная неполному факториалу) представляет собой наиболее тщательный и эффективный метод выборки23. В другом исследовании скрининга отмечалось, что было много случаев, когда очень тщательный экран 1,536 давал только один кристалл24, а совсем недавнее исследование показало, что большинство коммерческих экранов недооценивают пространство кристаллизации, которое, как известно, связано с просеиванием25. Не все кристаллизационные выводы дают кристалл дифракционного качества, пригодный для сбора данных, из-за присущего кристаллу беспорядка, дифракционных ограничений или дефектов кристалла; Таким образом, отливка более широкой сетки для условий имеет дополнительное преимущество, заключающееся в предоставлении альтернативных форм кристаллов для оптимизации.

Формат экспериментов по кристаллизации белка также влияет на успех экрана. Диффузия пара является наиболее часто используемой установкой для высокопроизводительных кристаллизационных приложений и используется в современных кристаллизационных центрах, включая высокопроизводительные сортировочные центры EMBL Hamburg и Institut Pasteur26,27,28. Центр HTX использует метод микропартии под маслом; Хотя он используется реже, это надежный метод, который сводит к минимуму потребление образцов и кристаллизационных коктейлей20,21,22. Одним из преимуществ метода микропартии под маслом, особенно при использовании высоковязкого парафинового масла, является то, что во время эксперимента внутри капли происходит лишь небольшое испарение, а это означает, что равновесная концентрация достигается при смешивании капель. Если положительные результаты кристаллизации наблюдаются в методе микропартии под нефтью, воспроизведение этих условий, как правило, более прямолинейно, чем в установках диффузии пара, в которых кристаллизация происходит в некоторой неопределенной точке во время равновесия между кристаллизационной каплей и резервуаром. Воспроизводимость попаданий желательна для высокопроизводительных подходов к кристаллизации, которые производят непомерно крошечные кристаллы белка, которые обычно необходимо оптимизировать для экспериментов с монокристаллами рентгеновского излучения.

Высокопроизводительный кристаллизационный экран для растворимых белков состоит из коктейлей, которые готовятся собственными силами, готовых коммерческих экранов и модифицированных внутри производства коммерческих экранов22. Коктейли были первоначально разработаны с использованием неполной факториальной стратегии с использованием ранее успешных кристаллизационных коктейлей20. Реагенты в сите, которые коммерчески доступны, включают массивы полимеров, кристаллизационных солей, ПЭГ и ионных комбинаций, а также экраны, в которых используются разреженные матрицы и неполные факторные подходы. Существуют также реагенты, которые модифицируются перед включением в сито: аддитивный экран, рН-экран и буферный экран, ионный жидкостный аддитивный экран и полимерный экран.

Сила известных условий и стратегий кристаллизации была использована в 1,536 кристаллизационных коктейлях, наряду с преимуществами системы микропартии под маслом для создания конвейера, в котором используется автоматизированная обработка жидкости, автоматизированная визуализация светлого поля и нелинейная визуализация хиральных кристаллов второго порядка (SONICC). Автоматизация как работы с жидкостями, так и визуализации обеспечивает преимущества меньшего количества часов влажной лаборатории и более высокой воспроизводимости. Высокая пропускная способность автоматизированного кристаллизационного скрининга обуславливает необходимость автоматизации процесса мониторинга роста кристаллов. Эти достижения достигаются с помощью самых современных технологий визуализации, помогающих идентифицировать положительные попадания кристаллов. Как стандартная визуализация пластин в светлом поле, так и многофотонные методы для расширенного детектирования используются через систему визуализации кристаллов с SONICC (рис. 2). SONICC сочетает в себе микроскопию генерации второй гармоники (SHG)29 и ультрафиолетовую двухфотонную флуоресцентную флуоресценцию (UV-TPEF)30 для обнаружения очень маленьких кристаллов, а также тех, которые скрыты осадком. Визуализация SONICC информирует о том, содержат ли лунки белок (через УФ-TPEF) и кристаллы (через SHG). Помимо положительной идентификации белковых кристаллов, дополнительная информация также может быть получена с использованием самых современных методов визуализации. Визуализация только коктейля перед добавлением образца служит отрицательным контролем; Эти изображения могут идентифицировать внешний вид скважины до добавления образца, в том числе с точки зрения кристаллов соли и мусора. Кроме того, визуализация SHG и UV-TPEF помогает дифференцировать кристаллы белка от кристаллов соли и может быть использована для визуализации комплексного материала31 белка и нуклеиновой кислоты.

Высокопроизводительные эксперименты по кристаллизации, подвергающиеся повторному мониторингу с помощью визуализации, приводят к очень большому объему изображений, требующих изучения. Автоматизированные методы подсчета очков кристаллов были разработаны для снижения нагрузки на пользователя и повышения вероятности выявления положительных попаданий кристаллов. Центр HTX участвовал в разработке алгоритма оценки MAchine Recognition of Crystallization Outcomes (MARCO), обученной архитектуры глубокой сверточной нейронной сети, разработанной консорциумом академических, некоммерческих, правительственных и отраслевых партнеров для классификации изображений светлого поля32. Алгоритм был обучен на почти полумиллионе изображений светлого поля из экспериментов по кристаллизации из нескольких учреждений с использованием различных методов кристаллизации и разных тепловизоров. Алгоритм выводит вероятностную оценку, указывающую, относится ли данное изображение к четырем возможным классам изображений: «кристаллическое», «прозрачное», «выпадающее в осадок» и «другое». Сообщается, что точность классификации MARCO составляет 94,5%. Обнаружение кристаллов дополнительно улучшается с помощью программного обеспечения, которое реализует алгоритм и предоставляет графический пользовательский интерфейс (GUI) для доступного и простого просмотра изображений, обеспечиваемый возможностями оценки с поддержкой искусственного интеллекта32,33. Графический интерфейс MARCO Polo предназначен для бесперебойной работы с настройкой системы визуализации и управления данными в HTX Center для выявления попаданий в экран с 1,536 лунками, с участием человека для изучения выходных данных отсортированных списков. Кроме того, как программное обеспечение с открытым исходным кодом, доступное на GitHub, графический интерфейс легко доступен для модификации, чтобы отразить конкретные потребности других лабораторных групп.

Здесь описан процесс организации высокопроизводительного эксперимента с микропартиями под маслом с использованием роботизированной обработки жидкости для доставки как коктейля, так и белка. Центр HTX имеет уникальный набор инструментов и ресурсов, которых нет в других учреждениях, с целью предоставления услуг скрининга и образовательных ресурсов заинтересованным пользователям. Демонстрация методов и возможностей высокопроизводительных технологий с поддержкой робототехники позволит сообществу получить знания о доступных технологиях и принимать решения для своих собственных усилий по определению структуры.

Protocol

1. Приготовление или покупка коктейлей для шестнадцати 96-луночных блоков глубоких скважин Готовьте химические коктейли собственного производства, разливая их в блоки глубоких скважин (DW) с 96 лунками. Используйте роботизированный погрузчик жидкостей для дозирования и смешивания исходных растворов солей, буферов, полимеров и воды. Приготовьте модифицированные на собственном производстве химические коктейли с помощью роботизированного манипулятора жидкости или многоканальной пипетки для добавления дополнительных компонентов в 96-луночные блочные экраны DW, которые были приобретены на коммерческой основе. Приобретите имеющиеся в продаже блоки DW. Храните 96-луночные блоки DW с маркировкой при температуре −20 °C в течение 12-18 месяцев.ПРИМЕЧАНИЕ: Коктейли, приготовленные на шаге 1.1. и 1.2. заполняют 10/16 блоков DW на 96 лунок и 5/16 блоков DW на 96 скважин используются по мере приобретения. Один блок DW на 96 лунок в грохоте устанавливается во время дозирования пластины на 1 536 лунок, чтобы избежать осаждения аддитивного сита (см. раздел 3). 2. Раздача коктейлей на 384-луночные тарелки Разморозьте 96-луночные блоки DW при температуре 4 °C за ночь. Доведите до комнатной температуры (20-23 °C) перед началом подготовки 384-луночных планшетов.ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления коктейльных тарелок подходит комнатная температура. Основная задача при приготовлении этих тарелок – избежать осадков, которые могут засорить устройства для обработки жидкостей и привести к непредсказуемым изменениям концентрации ингредиентов коктейля. Тщательно перемешайте блоки путем инверсии по мере необходимости, чтобы растворить стойкий непрозрачный осадок. Если какие-либо скважины содержат осадок, нагрейте блоки до 30 ° C для растворения. Подайте 50 мкл коктейльного раствора из четырех 96-луночных блоков DW в одну 384-луночную пластину с помощью робота для работы с жидкостью, оснащенного шприцем или пипеткой на 96 лунок. Четыре блока DW с 96 лунками штампуются в 384-луночную пластину таким образом, чтобы квадранты были заполнены (например, A1 96-DW1 до A1 384-plate1, A1 из 96-DW2 до B1 из 384-plate1 и т. д.) (Рисунок 3). Поставка 15 из 16 96-луночных блоков DW на 384-луночные пластины для хранения. Храните планшеты на 384 лунки при температуре -20 °C до 6 месяцев для использования при подготовке пластин на 1 536 лунок. 3. Приготовление 1,536-луночных тарелок с маслом и кристаллизационными коктейлями Подайте 5 мкл парафиновой нефти в каждую скважину пластины на 1 536 скважин с помощью роботизированной системы обработки жидкости с возможностью медленной аспирации и доставки. Храните масляные пластины при температуре 4 °C до 6 месяцев. Разморозьте 384-луночные пластины из секции 2 при температуре 4 ° C на ночь. Переверните пластины, чтобы смешать растворы и растворить осадок. Инкубируют пластины при 30 °C для растворения стойких осадков. Для приготовления компонентов аддитивного сита используйте конечный блок DW с 96 лунками, содержащий 0,1 М HEPES pH 6,8, 30% PEG3350, для смешивания с коммерческим экраном для присадок с помощью робота для обработки жидкостей или многоканальной пипетки. Приготовляют аддитивные сита путем дозирования смеси 1:1 буферного раствора PEG3350, приготовленного на этапе 3.3, и аддитивного сита до конечного объема 50 мкл в соответствующей 384-луночной пластине. Используйте робота для обработки жидкостей, оснащенного шприцем или головкой пипетки на 384 человека, чтобы доставить 200 нл раствора для коктейля в каждую лунку пластины на 1,536 лунок. Выштампуйте четыре пластины с 384 лунками в пластину с 1 536 лунками таким образом, чтобы квадранты были заполнены (например, А1 из 384 пластины1 в А1 из 1 536 лунок, А2 из 384 пластин 1 в А3 из 1 536 лунок и т. д.) (Рисунок 3). Центрифугируют пластины при концентрации 150 × г в течение 5 мин, а затем хранят при температуре 4 °C до 4 недель. 4. Представление образца Чтобы отправить образец, отправьте электронное письмо с бронированием до крайнего срока бронирования для предстоящего показа. Укажите количество скрининговых экспериментов, название, PI и учреждение, а также любые особые требования к обращению с образцом. Скрининговые прогоны проводятся примерно один раз в месяц, в результате чего получается 12 пробежек в год. Заполните форму отправки образца перед отправкой образца.Для новых пользователей выберите пароль , который будет использоваться для загрузки кристаллизационных изображений в разделе 7. Для постоянных пользователей используйте существующий пароль или измените пароль на этом шаге. Отправьте образец в пробирку объемом 1,5 мл. Убедитесь, что макромолекула однородна и достаточно сконцентрирована, чтобы способствовать кристаллизации. Используйте испытание на предварительную кристаллизацию, обычно состоящее из сульфата аммония или ПЭГ 4000, для исследования соответствующей концентрации образца путем наблюдения за тем, приводят ли испытуемые концентрации образца к явным падениям или осадку34.ПРИМЕЧАНИЕ: Подходящие тесты качества, которые могут быть проведены перед отправкой образца для проверки чистоты и однородности, включают, среди прочего, SDS-PAGE, гель-фильтрацию и динамическое рассеяние света (DLS). На кристаллизацию может влиять наличие даже незначительных примесей. В настоящее время для установки одной 1,536-луночной пластины требуется объем образца 500 мкл. В настоящее время проводятся испытания для снижения требований к объему образца.Избегайте использования буферных концентраций более 50 мМ, а также фосфатов, которые могут кристаллизоваться в сине. Избегайте чрезмерных солюбилизирующих агентов, включая концентрации глицерина более 10% по массе. Упакуйте образец для безопасного поддержания соответствующей температуры с помощью сухого льда, влажного льда или охлаждающих пакетов в герметичный контейнер. Приоритет образцов доставки в ночь с понедельника по среду во время пробега. Отправьте номер отслеживания по электронной почте после отправки образца. 5. Установка образцов на подготовленных 1 536-луночных планшетах Распакуйте образцы и немедленно инкубируйте при температуре, запрошенной пользователем. После размораживания центрифугируют образец при 10 000 × г в течение 2 мин при комнатной температуре. Визуально наблюдайте за образцом, чтобы определить осадки, цвет и состояние образца перед установкой. Прогрейте 1,536-луночный планшет до 23 °C и центрифугу при 150 × г в течение 5 мин. Изобразите тарелку, предназначенную только для коктейлей, используя изображение светлого поля в качестве негативного элемента управления.ПРИМЕЧАНИЕ: Все пластины визуализируются с помощью изображений светлого поля перед установкой образца, что позволяет идентифицировать лунки, в которых уже есть кристаллы или обломки до добавления образца, в качестве отрицательного контроля. Кроме того, это позволяет идентифицировать лунки, в которые кристаллизационный коктейль не был доставлен. Нагревание пластины до комнатной температуры устраняет конденсацию на поверхности пластины, что приводит к получению четких изображений. Распределите 200 нл пробы в каждую скважину на 1,536-луночном планшете с помощью робота для обработки жидкости. Центрифужная пластина при 150 × г и инкубационные пластины при 4 °C, 14 °C или 23 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты с микропартиями под маслом можно проводить вручную, распределяя белок и коктейль под желаемым маслом. Тем не менее, рекомендуется использовать не менее 1 мкл каждого белка и коктейля для достижения воспроизводимых результатов. 6. Мониторинг 1,536-луночных пластин для образования кристаллов После того, как образец был добавлен к 1,536-луночным планшетам, изображение с изображением светлого поля на 1-й день и 1-ю неделю, 2-ю, 3-ю, 4-ю и 6-ю недели. Выполняйте визуализацию SONICC с помощью SHG и UV-TPEF в течение 4 недель для планшетов, инкубируемых при 23 ° C, и в течение 6 недель для планшетов, инкубируемых при 14 ° C или 4 ° C.ПРИМЕЧАНИЕ: Время для визуализации SONICC запланировано на 4 недели и 6 недель для высокопроизводительной пластины для микроанализа 1,536, потому что, как правило, кристаллы появляются к этим временным точкам. Для модификации 96-луночной микропартии в экспериментах по диффузии нефти или пара рекомендуется выполнить визуализацию SONICC раньше во временном окне. Получите доступ к экспериментальным изображениям, которые были автоматически переданы в учетную запись пользователя с помощью внутренней системы LIMS. Уведомите пользователей с помощью автоматизированного демона электронной почты htslab о том, что произошло создание образа. 7. Анализ изображений Извлеките экранирующие изображения с ftp-сайта HWI для каждого файла .rar.ПРИМЕЧАНИЕ: Изображение, выводимое с экрана 1,536, приводит к появлению ряда файлов, содержащих изображения светлого поля, изображения SHG и изображения UV-TPEF. Каждый метод визуализации или момент времени представляет собой отдельный файл .rar. Каждый .rar файл при распаковке содержит изображение из каждой скважины 1,536-луночной пластины в определенный момент времени с использованием определенного метода визуализации.Используйте клиент FileZilla или другие параметры для доступа к данным ftp.ПРИМЕЧАНИЕ: Клиент FileZilla является рекомендуемым способом управления большим объемом передачи файлов, чтобы свести к минимуму сбои вычислений.Если клиент FileZilla должен быть установлен на компьютере пользователя, загрузите программное обеспечение FileZilla. Если клиент FileZilla уже установлен или после установки, щелкните значок FileZilla , чтобы открыть программное обеспечение. Войдите на удаленный ftp-сервер из FileZilla, введя ftp-сайт хоста, имя пользователя и пароль. Загрузите файлы .rar в нужный каталог. Используйте графический интерфейс с открытым исходным кодом с поддержкой искусственного интеллекта для просмотра, оценки и анализа кристаллизационных изображений.ПРИМЕЧАНИЕ: Графический интерфейс можно использовать в большинстве операционных систем (ОС) Windows, Mac и Linux, а инструкции по загрузке для конкретной ОС находятся на сайте GitHub. MARCO Polo – это графический интерфейс с открытым исходным кодом, который включает в себя метаданные с высокопроизводительного экрана кристаллизации 1,536, реализованного в HTX Center. Он доступен для всех, кто может загрузить с GitHub для модификации, чтобы отразить конкретные потребности других лабораторных групп.Откройте файл .rar в графическом интерфейсе после того, как файл был загружен (см. дополнительный рисунок S1).Нажмите « Импорт», выберите « Изображения » в раскрывающемся меню, а затем выберите «Из архива/каталога Rar». Нажмите « Обзор папки » во всплывающем окне, а затем перейдите в папку, содержащую изображения. Выберите нужные файлы и импортируйте их в графический интерфейс, нажав « Открыть». Подождите, пока файлы появятся в окне «Выбранные пути ». Выберите один или несколько файлов для загрузки в графический интерфейс и нажмите « Импортировать запуски». Просмотрите изображение для первой лунки в окне Slideshow Viewer в графическом интерфейсе, щелкнув символ > слева от имени образца, а затем выбрав соответствующее чтение, дважды щелкнув по нему (чтения перечислены по дате и типу изображения – яркое поле, UV-TPEF или SHG). Увеличьте изображение, изменив размер всего окна. Поле «Сведения об изображении » содержит сведения об изображении, в том числе сведения об оценке (пустые до тех пор, пока чтение не будет оценено). Поле «Сведения о коктейле » содержит метаданные о компонентах коктейля. Перейдите к следующему колодцу, нажав кнопку « Далее » на панели навигации или нажав клавишу со стрелкой вправо на клавиатуре. Перейдите к конкретной скважине, введя номер скважины в окне «По номеру скважины ». Просмотрите все чтения (импортированных в графический интерфейс), установив флажок «Показать все даты ». Просмотрите все спектры (из тех, которые импортированы в графический интерфейс), установив флажок « Показать все спектры ». Нажмите кнопку « Поменять местами спектр», чтобы просмотреть каждое изображение спектра по отдельности. Оцените кристаллические изображения с помощью алгоритма MARCO, сначала выделив определенный прогон из списка в левой части окна. Затем нажмите кнопку « Классифицировать выбранный запуск ». Просмотрите информацию о скоринговой оценке MARCO в окне «Сведения об изображении » после того, как показания изображения будут оценены для всех 1 536 скважин.ПРИМЕЧАНИЕ: Классификация обычно занимает от 2 до 5 минут, в зависимости от скорости компьютера и доступной памяти. Алгоритм генерирует оценки, которые классифицируют содержимое на «кристаллические», «прозрачные», «осажденные» или «другие» классы. Числовые значения, связанные с классификацией каждой скважины, отражают вероятность того, что скважина содержит объекты этого класса.Просмотрите подмножество оцененных изображений, поставив галочку в нужных полях на панели «Фильтрация изображений » и нажав кнопку «Отправить фильтры ». Например, просматривайте только изображения, классифицированные MARCO как кристаллы, установив флажки «Кристаллы» и «MARCO » и нажав « Отправить фильтры». Вручную оцените изображения кристаллов, чтобы сгенерировать набор «человеческих баллов». Присвойте оценку скважине, нажав на соответствующую кнопку (кнопки «кристалл», «очистить», «выпасть в осадок» или «другое» расположены на панели «Классификация » в нижней части окна). В качестве альтернативы используйте цифровую клавиатуру на клавиатуре, чтобы присвоить счет (1 = «кристалл», 2 = «прозрачный», 3 = «осадок», 4 = «другое»). Обозначить изображение, набранное человеком, как «избранное», отметив галочкой « Избранное»? коробка.ПРИМЕЧАНИЕ: Просматривайте только изображения, классифицированные человеком как кристаллы, поставив галочку в полях « Кристаллы» и « Человек » и нажав « Отправить фильтры». Щелчок по полю «Избранное » на панели «Фильтрация » еще больше сужает список возвращаемых изображений, возвращая только кристаллические изображения с человеческими баллами, которые также являются избранными. Вкладка Plate Viewer используется для одновременного просмотра нескольких скважин. На второй вкладке « Средство просмотра пластин» на панели « Управление » выберите 16, 64 или 96 изображений из раскрывающегося меню в разделе «Изображения на пластине ». Вкладка «Фильтрация изображений» используется для выделения серым цветом изображений, которые не представляют интереса. Установите флажок «Применить фильтр», чтобы отфильтровать изображения.ПРИМЕЧАНИЕ: Например, выберите ящики «человек» и «кристалл», и только те лунки, которые были забиты человеком как кристалл, будут легко видны.Перейдите на вкладку Plate Viewer , нажав кнопку « Далее », чтобы просмотреть следующий набор изображений 16/64/96. По умолчанию изображения, оцененные как кристаллы, окрашены в красный цвет, те, которые оценены как чистые, — в синий, те, которые оценены как осадок, — в зеленый, а те, которые оцениваются как другие, — оранжевые. Измените цвета с помощью раскрывающихся меню. Выберите информацию, которая будет отображаться на скважинах, установив различные флажки на вкладке «Метки ». Нажмите « Сохранить вид », чтобы сохранить файл изображения текущего вида. Нажмите « Поменять местами спектр», чтобы переключаться между изображениями светлого поля, SHG и UV-TPEF для изображения с несколькими лунками. Нажмите « Экспорт» и выберите соответствующий тип файла в раскрывающемся меню, чтобы экспортировать оцененные файлы для использования в других программах.ПРИМЕЧАНИЕ: Файлы CSV (значения, разделенные запятыми) совместимы с программами для работы с электронными таблицами, такими как Microsoft Excel или Google Sheets. Файлы JSON (JavaScript Object Notation) можно открыть в большинстве текстовых редакторов. PPTX (PowerPoint Presentation) можно использовать для отображения изображений из Polo, включая сравнение изображений светлого поля, УФ-TPEF и SHG. Файлы сохраняются в формате .xtal для повторного открытия в графическом интерфейсе MARCO Polo.Сохраните файл формата .xtal, щелкнув «Файл» в верхней части страницы, а затем выбрав «Сохранить запуск» или «Сохранить запуск как». Укажите имя файла и расположение каталога. Откройте файлы формата .xtal, нажав «Импорт» и выбрав «Изображения», а затем «Из сохраненного запуска». Найдите подходящее расположение файла, щелкните имя файла, а затем нажмите «Открыть».

Representative Results

Результаты эксперимента по скринингу кристаллов на 1,536 лунок состоят из семи полных наборов изображений светлого поля, собранных в день 0 (отрицательный контроль), день 1, неделя 1, неделя 2, неделя 3, неделя 4 и неделя 6 (рис. 4). Изображения SONICC собираются в течение 4 недель для планшетов, инкубированных при 23 ° C, и в течение 6 недель для планшетов, инкубированных при 4 ° C или 14 ° C. В целом, после отправки образца пользователи могут ожидать, что их пластины будут установлены в течение 1 дня после прибытия. Изображения будут загружаться по мере их сбора. Эксперимент по скринингу кристаллизации завершается через 6 недель. Планшетная установка на 1 536 лунок позволяет проводить все эксперименты по скринингу в одной и той же пластине, тем самым ограничивая потребление образца и облегчая визуализацию и прямое сравнение между методами визуализации. Репрезентативные результаты для временного хода роста кристаллов для одного состояния коктейля показаны на рисунке 4. Автоматизированная визуализация пластин на протяжении всего эксперимента позволяет идентифицировать как быстрорастущие, так и медленно растущие кристаллы с помощью визуализации светлого поля. Визуализация UV-TPEF и SHG позволяет перекрестно проверять попадания, наблюдаемые при визуализации светлого поля, и указывает на то, что наблюдаемые кристаллы являются белковыми и кристаллическими соответственно (рис. 5A, B). Кроме того, визуализация SONICC позволяет идентифицировать кристаллы, которые визуально скрыты осадком или пленками (рис. 5C) или микрокристаллами, которые в противном случае могут быть ошибочно приняты за осадок (рис. 5D). Для некоторых кристаллов отсутствие сигнала SHG не является дисквалифицирующим, поскольку некоторые точечные группы не производят сигнал SHG35,36, как показано на примере тетрагонального кристалла тауматина на рисунке 5C. И наоборот, следует ожидать отсутствия сигнала УФ-TPEF для белков, в которых отсутствуют остатки триптофана. Наблюдение сигналов УФ-ТПЭФ и ГСП также облегчает идентификацию кристаллов небелковых солей, которые будут появляться в светлом поле и демонстрировать сильный положительный сигнал ГСП, но не будут иметь сигнала УФ-ТПЭФ (рис. 5E). Анализ изображений для настройки пластины оптимизирован с помощью графического интерфейса MARCO Polo, который также объединяет передачу данных ftp с серверов HWI (в качестве альтернативы передаче файлов с помощью FileZilla). Графический интерфейс MARCO Polo позволяет легко перемещаться по планшетам и изображениям, а также выполняет вычислительную оценку изображений с использованием алгоритма MARCO, чтобы результаты изображений можно было быстро загружать, просматривать и анализировать из HTX Center. Алгоритм подсчета очков MARCO, реализованный в графическом интерфейсе MARCO Polo, способен оценивать изображения со всей 1,536-луночной пластины менее чем за 5 минут. Изображения, помеченные алгоритмом MARCO как кристаллические, могут быть впоследствии отсортированы графическим интерфейсом Polo для отображения. Поскольку алгоритм MARCO был оптимизирован для идентификации кристаллов и минимизации ложноотрицательных результатов, чтобы не пропустить ни одного положительного попадания, подсчет очков может привести к ложноположительным флагам. Тем не менее, способность MARCO ограничивать набор изображений, подлежащих исследованию, фокусируя внимание на скважинах с высокой вероятностью содержания кристаллов, приводит к существенному снижению нагрузки на обработку данных для пользователей. Удобная реализация алгоритма в удобной для пользователя платформе просмотра MARCO Polo с ее возможностью сортировки изображений на основе оценок MARCO значительно улучшает способность пользователя быстро анализировать набор данных и точно определять попадания кристаллов. Рисунок 1: Схема высокопроизводительного эксперимента по кристаллизационному скринингу на 1 536 лунок, выполненного в Центре HTX. (1) На этом этапе в каждую лунку добавляют 5 мкл парафиновой нефти и 200 нл коктейля (этап протокола 3.1 и этап 3.5). Мультяшная иллюстрация одной скважины, содержащей только нефть и коктейль, и репрезентативное изображение показаны справа. (2) Образцы поступают в Центр HTX (этап протокола 5.1). 3) На этом этапе в каждую лунку добавляют 200 нл образца (этап протокола 5.4). (4) Все 1 536 скважин контролируются с течением времени с использованием визуализации светлого поля, 5), а также методов УФ-TPEF и SHG (шаг 6 протокола). 6) Графический интерфейс с открытым исходным кодом с поддержкой искусственного интеллекта используется для просмотра, оценки и анализа кристаллизационных изображений (шаг 7 протокола). Сокращения: HTX = высокопроизводительная кристаллизация; УФ-ТПЭФ = УФ-двухфотонная возбужденная флуоресценция; SHG = генерация второй гармоники; ИИ = искусственный интеллект; GUI = графический интерфейс пользователя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2: Одиночные 1,536-луночные планшеты, содержащие скрининговые эксперименты, визуализированные с использованием светлого поля, УФ-TPEF и ГВГ-визуализации. Пластины с 1,536 лунками показаны американским пенни для масштаба (вверху). Каждый скрининговый эксперимент визуализируется один раз до настройки и шесть раз после добавления образца с визуализацией светлого поля (всего семь наборов изображений светлого поля, слева). Пластины подвергаются визуализации УФ-TPEF (в центре) и SHG (справа) через 4 или 6 недель. Сокращения: УФ-ТПЭФ = УФ-двухфотонная возбужденная флуоресценция; SHG = генерация второй гармоники. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3: Схема, показывающая, как генерируются пластины на 1 536 лунок. Шестнадцать 96-луночных блоков DW используются для штамповки четырех 384-луночных планшетов, при этом каждый квадрант каждой 384-луночной пластины заполняется дозированием кристаллизационных коктейлей. Четыре 96-луночных блока DW заполняют одну 384-луночную пластину (посередине). Четыре пластины на 384 лунки используются для штамповки одной пластины на 1,536 лунок (справа). Аббревиатура: DW = глубокая скважина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 4: Репрезентативный временной ход одной скважины в эксперименте по скринингу на 1 536 лунок. Планшеты визуализируются до установки образца (день 0), а также с помощью визуализации светлого поля на 1-й день, 1-ю неделю, 2-ю неделю, 3-ю, 4-ю и 6-ю недели. Пластины, инкубированные при 23 ° C, визуализируются с помощью SONICC на 4-й неделе. Масштабные линейки = 80 мкм (светлое поле), 200 мкм (SHG, UV-TPEF). Сокращения: SONICC = нелинейная визуализация хиральных кристаллов второго порядка; УФ-ТПЭФ = УФ-двухфотонная возбужденная флуоресценция; SHG = генерация второй гармоники. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 5: Репрезентативные результаты визуализации для экспериментов по скринингу кристаллов HT 1,536. Результаты визуализации Brightfield, UV-TPEF и SHG показаны для пяти примерных скважин. (А,Б) Кристаллы белка, наблюдаемые с помощью визуализации светлого поля, УФ-TPEF и SHG, четко видны во всех трех методах визуализации. (C) Кристалл белка, скрытый пленкой при съемке в светлом поле, виден с помощью УФ-ТПЭФ-визуализации; кристалл не наблюдается при визуализации SHG из-за несовместимости точечных групп. (D) Пример микрокристаллов, проверенных с помощью УФ-ТПЭФ и ГСП, которые в противном случае можно было бы считать осадком. (E) Пример кристаллов соли, которые кажутся кристаллическими при ярком поле и визуализации SHG, но не проявляют сигнала UV-TPEF. Масштабные линейки = 200 мкм. Диаметр скважины = 0,9 мм. Сокращения: УФ-ТПЭФ = УФ-двухфотонная возбужденная флуоресценция; SHG = генерация второй гармоники. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Дополнительный рисунок S1: Открытие файлов изображений в MARCO Polo. Файлы изображений можно открыть в графическом интерфейсе MARCO Polo, перейдя в раздел Импорт | Вкладка «Изображения» вверху (a). Обратите внимание, что файлы также могут быть переданы с помощью инструмента From FTP непосредственно в MARCO Polo (a) или могут быть переданы через FileZilla, как описано в шаге протокола 7.2. Чтобы импортировать файлы, которые уже были загружены, выберите «Изображения» | Из архива/каталога Rar. В появившемся всплывающем окне выберите «Обзор папки » (b) и перейдите в каталог файлов, в котором сохранены файлы изображений пластин. Как только файлы окажутся в окне «Выбранные пути » (c), выделите файл и нажмите « Импорт запусков » (d). Графический интерфейс MARCO Polo определит правильные метаданные файла коктейля для импорта вместе с изображениями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Метод описывает высокопроизводительный конвейер для скрининга кристаллизации белка, который требует всего 500 мкл образца для 1,536 отдельных экспериментов по кристаллизации в формате микропартии под маслом. Трубопровод опирается на робототехнику для работы с жидкостями, чтобы быстро и воспроизводимо помочь экспериментальной установке, а также на ресурс для анализа вычислительных изображений MARCO Polo, который настроен для анализа изображений пластин из 1,536 лунок с использованием алгоритма MARCO для идентификации и изоляции попаданий кристаллов.

Небольшой объем отдельных капель для просеивания (всего 400 нл при соотношении образец к коктейлю 1:1) означает, что для выявления положительных условий кристаллизации требуются чрезвычайно малые объемы образцов. Эти небольшие размеры капель обязательно дают маленькие кристаллы, которые не могут быть выловлены с помощью традиционной петли. Были разработаны методы сбора урожая с 1 536 пластин37; Кроме того, пластины с кристаллами использовались непосредственно в синхротронных источниках для сбора данных in situ 38. Если бы был разработан надежный метод сбора этих кристаллов, достижения в области синхротронной технологии и микросфокусированных пучков позволили бы получить полезные наборы данных. Кроме того, полученные кристаллы потенциально могут быть использованы в качестве семян для оптимизации.

Визуализация SONICC явно выгодна для идентификации как небольших кристаллов белка, так и кристаллов белка, скрытых под осадком. Несмотря на эти преимущества, не все типы образцов поддаются визуализации SHG и UV-TPEF. Например, белки с небольшим количеством или без ароматических остатков триптофана будут показывать неоднозначный сигнал УФ-TPEF. Кроме того, кристаллы в определенных пространственных группах, включая центросимметричные группы или точечную группу 432, не будут обнаружены при визуализации SHG. Образцы с флуорофорами иногда мешают сигналу SHG, что приводит к отмене сигнала или увеличению интенсивности, а это означает, что для металлосодержащих белков и белков, содержащих флуоресцентные фрагменты, требуется тщательная интерпретация сигналов SHG. Однако во многих случаях можно рационализировать отсутствие сигнала SHG или UV-TPEF, и отсутствие этих сигналов не обязательно должно исключать присутствие кристалла белка.

Формат микропартии под маслом представляет собой альтернативу более распространенному методу диффузии пара, используемому для высокопроизводительной кристаллографии. Важно отметить, что формат кристаллизации влияет на идентификациюпопадания 39, что дает обоснование для использования различных форматов кристаллизации для высокопроизводительного скрининга. Автоматизированная визуализация и методы с поддержкой SONICC помогают быстро идентифицировать кристаллы белка в течение 6-недельного экспериментального курса. Наконец, графический интерфейс MARCO Polo позволяет пользователям быстро анализировать изображения из 1 536 условий, чтобы определить перспективные скважины для оптимизации. Возможности Центра HTX, в том числе высокопроизводительная экспериментальная установка с поддержкой робототехники в сочетании с современными инструментами визуализации и вычислительными инструментами для анализа, вносят значительный вклад в сообщество структурной биологии, позволяя исследователям эффективно устранять основное узкое место в структурной работе на основе кристаллов: поиск условий кристаллизации.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы выразить благодарность нашим пользователям за то, что они доверили нам свои драгоценные образцы для скрининга кристаллов, а также за предоставление критических отзывов и запросов, которые помогли нам усовершенствовать и развить наши ресурсы, чтобы лучше служить сообществу структурной биологии. Мы также хотели бы выразить признательность Итану Холлеману, доктору Лизе Киф и доктору Эрике Дугид, которые руководили разработкой графического интерфейса MARCO Polo. Мы хотели бы поблагодарить коллег из HWI за их поддержку и предложения, особенно доктора Диану К.Ф. Монтейро. Мы признаем финансовую поддержку со стороны Национального института здравоохранения, R24GM141256.

Materials

1536 Well Imp@ct LBR LoBase Greiner Bio-One 790 801
Acetic acid Hampton Research HR2-853
AlumaSeal II Sealing Film Hampton Research HR8-069
Ammonium bromide Molecular Dimensions MD2-100-247
Ammonium chloride Hampton Research HR2-691
Ammonium hydroxide Hampton Research HR2-855
Ammonium nitrate Hampton Research HR2-665
Ammonium phosphate dibasic Hampton Research HR2-629
Ammonium phosphate monobasic Hampton Research HR2-555
Ammonium sulfate Hampton Research HR2-541
Ammonium thiocyanate Molecular Dimensions MD2-100-301
Bicine pH 9.0 Hampton Research HR2-723
Bis-tris propane pH 7.0 Hampton Research HR2-993-08
Calcium acetate Hampton Research HR2-567
Calcium chloride dihydrate Hampton Research HR2-557
CAPS pH 10.0 Rigaku Reagents none given
ClearSeal Film Hampton Research HR4-521
Cobalt sulfate heptahydrate Molecular Dimensions MD2-100-42
Crystal Screen HT screen Hampton Research HR2-130
Formulator Formulatrix
Glycerol Hampton Research HR2-623
Gryphon liquid handling robot Art Robbins Instruments
HEPES pH 7.0 Hampton Research HR2-902-03
HEPES pH 7.5 Hampton Research HR2-902-08
HWI HTX Center sample submission form https://hwi.buffalo.edu/high-throughput-crystallization-screening-center-sample-submission-form/    
Hydrochloric acid Hampton Research HR2-581
Index HT screen Hampton Research HR2-134
Ionic Liquid screen Hampton Research HR2-214
Lithium bromide Molecular Dimensions MD2-100-312
Lithium chloride Hampton Research HR2-631
Lithium sulfate monohydrate Hampton Research HR2-545
Magnesium acetate tetrahydrate Hampton Research HR2-561
Magnesium chloride hexahydrate Hampton Research HR2-559
Magnesium nitrate hexahydrate Hampton Research HR2-657
Magnesium sulfate heptahydrate Hampton Research HR2-821
Manganese chloride tetrahydrate Millipore Sigma 63535-50G
Manganese sulfate monohydrate Molecular Dimensions MD2-100-310
MARCO Polo GUI download https://hauptman-woodward.github.io/Marco_Polo/
Matrix Platemate 2 x 3 liquid handling robot Thermo Scientific
MES pH 6.0 Hampton Research HR2-943-09
Mosquito liquid handling robot SPTLabtech
Paraffin Oil/White Mineral Oil Saybolt Viscosity 340-365 at 100 °F  Sigma Aldrich PX0045-3
PEG 1000 Hampton Research HR2-523
PEG 2000 Hampton Research HR2-592
PEG 20000 Hampton Research HR2-609
PEG 3350 Hampton Research HR2-527
PEG 400 Hampton Research HR2-603
PEG 4000 Hampton Research HR2-529
PEG 6000 Hampton Research HR2-533
PEG 8000 Hampton Research HR2-535
PEG/Ion HT screen Hampton Research HR2-139
PEGRx HT screen Hampton Research HR2-086
Plate reservations htslab@hwi.buffalo.edu
Potassium acetate Hampton Research HR2-671
Potassium bromide Hampton Research HR2-779
Potassium carbonate Molecular Dimensions MD2-100-311
Potassium chloride Hampton Research HR2-649
Potassium nitrate Hampton Research HR2-663
Potassium phosphate dibasic Hampton Research HR2-635
Potassium phosphate-monobasic Hampton Research HR2-553
Potassium phosphate-tribasic Molecular Dimensions MD2-100-309
Potassium thiocyanate Hampton Research HR2-695
Rock Imager 1000 with SONICC Formulatrix
Rock Imager 54 Formulatrix
Rubidium chloride Millipore Sigma R2252-10G
SaltRx HT screen Hampton Research HR2-136
Silver Bullets screen Hampton Research HR2-096
Slice pH screen Hampton Research HR2-070
Sodium acetate pH 5.0 Hampton Research HR2-933-15
Sodium bromide Hampton Research HR2-699
Sodium chloride Hampton Research HR2-637
Sodium citrate pH 4.2 Hampton Research HR2-935-01
Sodium citrate pH 5.6 Hampton Research HR2-735
Sodium hydroxide Hampton Research HR2-583
Sodium molybdate dihydrate Molecular Dimensions MD2-100-207
Sodium nitrate Hampton Research HR2-661
Sodium phosphate monobasic Hampton Research HR2-551
Sodium thiosulfate pentahydrate Molecular Dimensions MD-100-307
StockOptions Polymer screen Hampton Research HR2-227
Tacsimate pH 7 Hampton Research HR2-755
TAPS pH 9.0 bioWORLD 40121071
Tris pH 8 Hampton Research HR2-900-11
Tris pH 8.5 Hampton Research HR2-725
ViaFLO 384 Integra
ViaFLO 384 384 channel pipettor head (0.5-12.5µL) Integra
ViaFLO 384 96 channel pipettor head (300µL) Integra
Zinc acetate dihydrate Hampton Research HR2-563
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. PDB data distribution by experimental method and molecular type. RCSB Protein Data Bank Available from: https://www.rcsb.org/stats/summary (2022)
  2. Maveyraud, L., Mourey, L. Protein X-ray crystallography and drug discovery. Molecules. 25 (5), 1030 (2020).
  3. Dupeux, F., Röwer, M., Seroul, G., Blot, D., Márquez, J. A. A thermal stability assay can help to estimate the crystallization likelihood of biological samples. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (11), 915-919 (2011).
  4. Elbasir, A., et al. DeepCrystal: A deep learning framework for sequence-based protein crystallization prediction. Bioinformatics. 35 (13), 2216-2225 (2019).
  5. Zucker, F. H., et al. Prediction of protein crystallization outcome using a hybrid method. Journal of Structural Biology. 171 (1), 64-73 (2010).
  6. George, A., Wilson, W. W. Predicting protein crystallization from a dilute solution property. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 50 (4), 361-365 (1994).
  7. Jia, Y., Liu, X. -. Y. From surface self-assembly to crystallization: prediction of protein crystallization conditions. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (13), 6949-6955 (2006).
  8. Slabinski, L., et al. XtalPred: A web server for prediction of protein crystallizability. Bioinformatics. 23 (24), 3403-3405 (2007).
  9. Abrahams, G. J., Newman, J. BLASTing away preconceptions in crystallization trials. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 75 (3), 184-192 (2019).
  10. Rosa, N., et al. Tools to ease the choice and design of protein crystallisation experiments. Crystals. 10 (2), 95 (2020).
  11. Newman, J., et al. On the need for an international effort to capture, share and use crystallization screening data. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 68 (3), 253-258 (2012).
  12. Lynch, M. L., Dudek, M. F., Bowman, S. E. A searchable database of crystallization cocktails in the PDB: analyzing the chemical condition space. Patterns. 1 (4), 100024 (2020).
  13. Jancarik, J., Kim, S. -. H. Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins. Journal of Applied Crystallography. 24 (4), 409-411 (1991).
  14. Carter, C. W. Efficient factorial designs and the analysis of macromolecular crystal growth conditions. Methods. 1 (1), 12-24 (1990).
  15. McPherson, A., Cudney, B. Searching for silver bullets: An alternative strategy for crystallizing macromolecules. Journal of Structural Biology. 156 (3), 387-406 (2006).
  16. McPherson, A., Nguyen, C., Cudney, R., Larson, S. The role of small molecule additives and chemical modification in protein crystallization. Crystal Growth & Design. 11 (5), 1469-1474 (2011).
  17. Luft, J. R., DeTitta, G. T. A method to produce microseed stock for use in the crystallization of biological macromolecules. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 55 (5), 988-993 (1999).
  18. Thakur, A. S., et al. Improved success of sparse matrix protein crystallization screening with heterogeneous nucleating agents. PLoS One. 2 (10), 1091 (2007).
  19. Chayen, N. E., Stewart, P. D. S., Blow, D. M. Microbatch crystallization under oil-a new technique allowing many small-volume crystallization trials. Journal of Crystal Growth. 122 (1-4), 176-180 (1992).
  20. Luft, J. R., et al. A deliberate approach to screening for initial crystallization conditions of biological macromolecules. Journal of Structural Biology. 142 (1), 170-179 (2003).
  21. Luft, J. R., Snell, E. H., DeTitta, G. T. Lessons from high-throughput protein crystallization screening: 10 years of practical experience. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (5), 465-480 (2011).
  22. Lynch, M. L., Snell, M. E., Potter, S. A., Snell, E. H., Bowman, S. E. 20 years of crystal hits: Progress and promise in ultrahigh-throughput crystallization screening. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. , (2023).
  23. Segelke, B. W. Efficiency analysis of sampling protocols used in protein crystallization screening. Journal of Crystal Growth. 232 (1-4), 553-562 (2001).
  24. Luft, J. R., Newman, J., Snell, E. H. Crystallization screening: the influence of history on current practice. Acta Crystallographica Section F. 70 (7), 835-853 (2014).
  25. Mlynek, G., Kostan, J., Leeb, S., Djinovic-Carugo, K. Tailored suits fit better: Customized protein crystallization screens. Crystal Growth & Design. 20 (2), 984-994 (2019).
  26. Mueller-Dieckmann, J. The open-access high-throughput crystallization facility at EMBL Hamburg. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 62 (12), 1446-1452 (2006).
  27. Weber, P., et al. High-throughput crystallization pipeline at the crystallography core facility of the Institut Pasteur. Molecules. 24 (24), 4451 (2019).
  28. Lin, Y. What’s happened over the last five years with high-throughput protein crystallization screening. Expert Opinion on Drug Discovery. 13 (8), 691-695 (2018).
  29. Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55 (4), 379-386 (2011).
  30. Madden, J. T., DeWalt, E. L., Simpson, G. J. Two-photon excited UV fluorescence for protein crystal detection. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (10), 839-846 (2011).
  31. Fleming, A. M., et al. Second harmonic generation interrogation of the endonuclease APE1 binding interaction with G-quadruplex DNA. Analytical Chemistry. 94 (43), 15027-15032 (2022).
  32. Bruno, A. E., et al. Classification of crystallization outcomes using deep convolutional neural networks. PLoS One. 13 (6), 0198883 (2018).
  33. Holleman, E. T., Duguid, E., Keefe, L. J., Bowman, S. E. Polo: An open-source graphical user interface for crystallization screening. Journal of Applied Crystallography. 54 (2), 673-679 (2021).
  34. Niesen, F. H., et al. An approach to quality management in structural biology: Biophysical selection of proteins for successful crystallization. Journal of Structural Biology. 162 (3), 451-459 (2008).
  35. Padayatti, P., Palczewska, G., Sun, W., Palczewski, K., Salom, D. Imaging of protein crystals with two-photon microscopy. Biochemistry. 51 (8), 1625-1637 (2012).
  36. Haupert, L. M., DeWalt, E. L., Simpson, G. J. Modeling the SHG activities of diverse protein crystals. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (11), 1513-1521 (2012).
  37. Luft, J. R., Grant, T. D., Wolfley, J. R., Snell, E. H. A new view on crystal harvesting. Journal of Applied Crystallography. 47 (3), 1158-1161 (2014).
  38. Bruno, A. E., Soares, A. S., Owen, R. L., Snell, E. H. The use of haptic interfaces and web services in crystallography: An application for a ‘screen to beam’ interface. Journal of Applied Crystallography. 49 (6), 2082-2090 (2016).
  39. Baldock, P., Mills, V., Stewart, P. S. A comparison of microbatch and vapour diffusion for initial screening of crystallization conditions. Journal of Crystal Growth. 168 (1-4), 170-174 (1996).

Tags

High-throughput ScreeningProtein CrystallographyCrystal HitsStructural BiologyComputational Structure PredictionMicro EDSerial CrystallographyAdvanced ImagingUVTBFSHGMarco AlgorithmCrystallization CocktailNon-linear Optical MethodsX-ray Crystallography1536-well Microbatch-under-oil PlateAutomated High-throughputState-of-the-art Imaging

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Budziszewski, G. R., Snell, M. E., Wright, T. R., Lynch, M. L., Bowman, S. E. J. High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography. J. Vis. Exp. (193), e65211, doi:10.3791/65211 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image