צמחי שבלול שלמים של ילודים כמודל במבחנה

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות של הוועדה לרווחת בעלי חיים בקנטון בזל סיטי, שוויץ. עכברי C57BL/6JR לאחר הלידה, חולדות Wistar ועכברים עם מחסור ב-STAT1 (מעורב C57BL/6-129/SvEv)7 בגילאי 3-5 ימים ומשני המינים שימשו לניסויים. 1. ציפוי התאים מרובי הבארות הכינו מדיום תרבות שלם.עבור איבר של צמחי קורטי, הכינו מדיום המכיל מדיום נשר שונה (DMEM) של דולבקו, סרום בקר עוברי 10% (FBS), 25 mM HEPES ו-30 U/mL פניצילין. עבור איברים של צמחי קורטי וחצילי שבלול, הכינו מדיום המכיל DMEM/F12, תוסף N2 1x, B27 1x פחות נוגדי חמצון ו-30 U/mL פניצילין. הכינו תמיסת מלאי של פולי-D-ליזין על ידי הוספת 10 מ”ל מים מתרבית תאים ל-5 מ”ג פולי-D-ליזין במכסה מנוע למינרי. הריכוז הסופי של פולי-D-ליזין הוא 0.5 מ”ג/מ”ל.הערה: Aliquot את פתרון המלאי הנותר, ולאחסן ב -20 ° C.הכן פתרונות עבודה של פולי-D-ליזין על ידי דילול תמיסת המלאי 1:10 במים סטריליים. מצפים תא בעל 8 בארות ב-150 מיקרוליטר/באר של תמיסת עבודה פולי-D-ליזין, ודגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.הערה: אם משתמשים בתא 4 בארות, יש לצפות ב-300 μL/well של תמיסת עבודה פולי-D-ליזין. שאפו את הפתרון על ידי ואקום או פיפטינג. יש לשטוף פעמיים עם 200 μL של מים סטריליים ופעם אחת עם 200 μL של מדיום תרבית מלאה או DMEM. הוסף 150 μL של מדיום תרבית שלם לכל באר.הערה: אם משתמשים בתא 4 בארות, הוסף 250 μL / well של מדיום תרבית שלם. הניחו את התא באינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 למשך 30 דקות לפחות לפני הנחת אקספלנט. 2. דיסקציה של העצם הטמפורלית יש לחטא את שולחן הניתוחים באתנול 70%, ולעקר את כל המכשירים במעקר מיקרוספירה מזכוכית. מניחים צלחת פטרי סטרילית בקוטר 60 מ”מ על דלי המכיל קרח. יוצקים כמה מיליליטרים של מלח חוצץ פוספט 1x (PBS), ושומרים אותו על קרח.הערה: יש להשתמש בפניצילין 30 U/מ”ל ב-1x PBS כדי למנוע זיהום חיידקי. הניחו פד סטרילי על מגש סטרילי וערפו במהירות את ראשו של הגור בעזרת מספריים להפעלה. לטבול את הראש באתנול 70% במשך 5 שניות, אם זיהום הוא אירוע שכיח.הערה: פרוטוקול זה נבדק עבור עכברים וחולדות בגילאי P3-P5. קשה יותר לנתח רקמות שבלול מעכברים וחולדות מבוגרים, והישרדותם של צמחים בתרבית מוגבלת. הניחו את ראש החיה על פד סטרילי. הסר את הלסת התחתונה. הרימו את העור וקילפו אותו בחזרה מהגולגולת. החזיקו את הגולגולת על ידי הנחת המלקחיים בחללי המסלול. חותכים בזהירות את הגולגולת לאורך התפר הסגיטלי, ולאחר מכן חותכים באזור התפר הקורונלי עם להב אזמל חד מבלי לפגוע בשבלול.הערה: הימנע מהפעלת לחץ רב מדי, והימנע מתנועות קדימה ואחורה עם אזמל, שכן הדבר עלול לפגוע בעצם השבלול ובכך בצינור השבלול. בזהירות להסיר את המוח משני חצאי הגולגולת. מעבירים את חצאי הגולגולת לצלחת פטרי בקוטר 60 מ”מ עם PBS קר כקרח מוכן בשלב 2.3. 3. בידוד השבלול למקם את השבלול בעצם הרקתית מתחת למיקרוסקופ. מניחים את המלקחיים בתעלה החצי עגולה העליונה. שחררו את הרקמה שמסביב בין השבלול לעצם הרקתית באמצעות מזרק אינסולין (עכברים) או מלקחיים (חולדות). משכו בזהירות את העצם הטמפורלית מהשבלול, תוך שמירה על השבלול מחובר לפרוזדור עם העצם הטמפורלית. ודא שהשבלול נקי מהרקמה שמסביב לפני שתדחוף את העצם הרקתית הצידה.הערה: הפעלת כוח רב מדי תפגע בצינור השבלול. החזיקו את השבלול במצב קבוע, והשתמשו ביד השנייה כדי להסיר בזהירות את כמוסת השבלול הסחוסית. מכניסים בזהירות את קצות המלקחיים לאזור הקודקוד או בין הסיבובים (נראה כקו לבן), ומסירים את הקפסולה חתיכה אחר פיסה. חשוף את צינור השבלול. מניחים בזהירות את המלקחיים מתחת לשבלול, ומנתקים אותם מאיבר שיווי המשקל ומהעצם הרקתית. מעבירים את השבלול לצלחת חדשה בקוטר 60 מ”מ המכילה PBS קר כקרח. התאימו את ההגדלה של המיקרוסקופ כדי להמחיש טוב יותר את הצמחים. בצע את השלבים הבאים עבור איבר של צמחים קורטי:החזיקו את האיבר בבסיס בעזרת מלקחיים. הסר בעדינות את צינור השבלול על ידי תפיסתו במלקחיים באזור וו הבסיס. שחררו את צינור השבלול מהמודיולוס מבלי לקרוע אותו. בזהירות להסיר את הרצועה הספירלית עם stria vascularis על ידי החזקת האיבר בבסיס ולמשוך אותם משם.הערה: הפרדת רקמות יכולה להיות מושגת גם על ידי החזקת אזור הקודקוד במקום אזור הבסיס. זה יכול להיות שימושי בעת ניתוח איברי חולדה או גורי עכברים מבוגרים יותר (>P5). הסר בזהירות את קרום רייסנר על ידי החזקת האיבר בבסיס ומשיכת אותו חתיכה אחר פיסה.הערה: זהו שלב אופציונלי מכיוון שקרום רייסנר אינו מפריע לרכישת ההדמיה. בצע את השלבים הבאים עבור חצילי שבלול:נתקו את הגנגליון הספירלי מהלמינה הספירלית באמצעות מזרק אינסולין (עכברים) או מלקחיים (חולדות). הרפו בעדינות את המודיולוס במהלך הניתוק.הערה: ניתן לחלק את הצמחים לשני חלקים לטיפול טוב יותר. אחזו באזור הקרס בעזרת מלקחיים. בזהירות להסיר את הרצועה הספירלית עם stria vascularis על ידי משיכתו. הסר בזהירות את קרום רייסנר על ידי החזקת האיבר בבסיס ומשיכת אותו חתיכה אחר פיסה.הערה: שלב זה מומלץ, מכיוון שקרום רייסנר בדרך כלל מתקפל ומכסה את חוטי הנוירון, ולכן עשוי להשפיע על הניסויים. 4. תרבית של צמחי שבלול מעבירים את החצילים מצלחת הפטרי לתאים מרובי הקידוחים. הרימו את החצילים כשתאי השערה פונים כלפי מעלה בעזרת מרית מעבדה. כלול כמה מיקרוליטרים של PBS 1x כדי למנוע מהדגימות להידבק למרית.הערה: צמחים שניזוקו קשות יידבקו למרית. הניחו לצמחים להחליק מהמרית לתוך התא על ידי נפנוף עדין של המרית בתווך. מניחים עציץ אחד לכל באר של מגלשה קאמרית בת 8 בארות.הערה: אם החציל נדבק למרית, החזיקו את המרית בתווך, והשתמשו במלקחיים כדי לנתק את החצילים. הניחו תמיד את המלקחיים בגבול הפנימי של החציל (הרחק מתאי השערה). בדקו במיקרוסקופ שהצמחים הועברו בכיוון הנכון והוצבו במרכז הבארות.הערה: עציצים בעלי כיוון שגוי עם תאי שיער הפונים כלפי מטה נוטים להראות צורת U כלפי מעלה לרוחבם. תקנו את הכיוון שלהם על ידי הזזת העציצים לפינות התאים (יש יותר מדיום) וכוונו אותם לסיבוב. מוציאים 80 μL של המדיום באמצעות פיפטה 100 μL, ומשליכים אותו. בדוק תחת המיקרוסקופ אם תאי השערה ותאי העצב של גנגליון ספירלי גלויים. במידת הצורך, השתמש במלקחיים כדי לדחוף בעדינות חלק מהרקמה החופפת. הסר את שאר המדיום, והמתן ~ 10 שניות. פיפט את הגב הבינוני. הוסיפו טיפה אחת או שתיים של המדיום ליד החציל ואת שאר התווך במרחק מה מהאקספלנט כדי למנוע מהחציל להתנתק.הערה: גם אם הצמחים מחוברים לתאים, תמיד יש להוסיף את המדיום תחילה על ידי פיפטוף טיפה אחת או שתיים ליד העציצים. בדרך זו, הצמחים לא יורמו כאשר המדיה השלמה הנותרת מתווספת. מחזירים את התא לאינקובטור, ודגרים במשך שעתיים כדי לאפשר לאיברים להתחבר היטב לתחתית החדר. מוציאים את המדיום, ומוסיפים בזהירות 300 μL של מדיום שלם טרי שחומם מראש באמצעות פיפטה 100 μL או 200 μL. אין להשתמש פיפטה 1 מ”ל.הערה: אם יש צורך בטיפול מקדים, לאחר שעתיים של התקשרות, הוסף 300 μL של מדיום שלם המכיל את החומר המעניין. אם משתמשים בתא 4 בארות, השתמש עד 500 μL / באר. להחזיר את התאים לאינקובטור. 5. בדיקה של סוכני ototoxic השאירו את הצמחים למשך הלילה כדי להסתגל לתנאי התרבית ולהתאושש. הכינו ריכוזים שונים של חומרים אוטוטוקסיים כדי למצוא את הריכוז המתאים כדי לבסס מודל אוטוטוקסי עם כ -50% נשירת תאי שיער. יש להשתמש בין 50 מיקרומטר ל-250 מיקרומטר עבור גנטמיצין ובין 40 מיקרומטר ל-320 מיקרומטר עבור ציספלטין. הכינו את תמיסות הציספלטין טריות, והגנו עליהן מפני אור. הסר את המדיום, בזהירות להוסיף 300 μL של מדיום המכיל את התרופה ototoxic הרצוי. לדגור את explants עם gentamicin ו cisplatin ב 37 ° C במשך 24 שעות עד 48 שעות כדי לקבוע את הישרדות תאי השיער.הערה: ריכוזי התרופות וזמן החשיפה נבחרים בהתאם למטרת המחקר. שימור הצמחים נבדק כאן עד 72 שעות. אין להשתמש בסרום אם אתם מתכננים לבצע תרבית ארוכת טווח. עקבו אחר הסעיף הבא כדי להכתים את תאי השבלול. 6. קיבוע ו immunofluorescence השליכו את המדיום בסוף הניסוי, ושטפו מיד את הצמחים עם 200 מיקרוליטר של PBS 1x שחומם מראש. תקן את הצמחים עם 200 μL של 4% paraformaldehyde (PFA) במשך 15 דקות תחת מכסה אדים כימי.זהירות: PFA הוא כימיקל מסוכן; קרא את גיליון נתוני בטיחות החומרים (MSDS) לפני שתעבוד עם PFA בפעם הראשונה. לשטוף את explants פעמיים עם 200 μL של 1x PBS. אחסנו את הצמחים ב-1x PBS בטמפרטורה של 4°C למקרה שיהיה צורך לדחות את הליכי הצביעה. הכינו את תמיסת החדירה המורכבת מ-1x PBS ו-1%-5% Triton-X100. השליכו את 1x PBS, הוסיפו 200 מיקרוליטר של תמיסת חלחול ודגרו על הצמחים במשך 15 דקות. הכן פתרון חסימה.עבור איבר של צמחים קורטי, להכין פתרון חוסם המורכב 1x PBS, 10% סרום עיזים רגיל (NGS, עבור נוגדנים משניים עז, או סרום אחר מאותו מין כמו נוגדנים משניים). לחלופין, יש להשתמש באלבומין בסרום בקר (BSA) עם 1%-5% אם התאים מוכתמים רק בפלואידין. עבור חצילי שבלול, הכינו תמיסת חסימה המורכבת מ-1x PBS, 10% NGS ומקטע Fab (מקטע Fab עז-אנטי-עכבר IgG H+L, דילול 1:200) אם אתם משתמשים בנוגדנים ראשוניים של עכבר (למשל, עכבר אנטי-TuJ1) כדי להכתים את תאי הגנגליון הספירלי. מוסיפים 200 μL של תמיסת חסימה, ודגרים על הצמחים למשך שעה אחת. בטל את פתרון החסימה. לצמחים המודגרים עם מקטע Fab, מוסיפים 200 μL של 4% PFA, ודגרים במשך 5 דקות. שטפו את העציצים עם 1x PBS במשך 5 דקות. הכינו תמיסת נוגדנים המורכבת מ-1x PBS, 5% NGS ו-0.1%-0.25% Triton-X100. לדלל את הנוגדן העיקרי בתמיסת נוגדנים – MYO7A (ab3481 בדילול של 1:500 או MYO7A 138-1 בשעה 1:100) – כדי לסמן את תאי השערה ו- TuJ1 (1:400) כדי לתייג את נוירוני הגנגליון הספירליים.הערה: אם תאי השערה מסומנים רק עם פאלואדין, לדלל את הפלואידין בשעה 1:150 ב-1x PBS, לדגור במשך 40 דקות עד שעה אחת בטמפרטורת החדר, ולהמשיך לשלב 6.22. כלול בקרה על הקישור הלא ספציפי של הנוגדן המשני על ידי השמטת הנוגדן הראשוני. מוסיפים 170 μL של תמיסת הנוגדנים עם הנוגדן הראשוני לבאר המתאימה, ודגרים לילה ב 4 מעלות צלזיוס עם רעד עדין (40-60 סל”ד). לשטוף את explants 4x במשך 5 דקות כל אחד עם 1x PBS. יש לדלל את הנוגדן המשני בתמיסת נוגדנים (לדוגמה, עז נגד ארנב Alexa Fluor 488 או עז נגד עכבר Alexa Fluor 568 IgG בדילול של 1:500). מוסיפים 170 μL של תמיסת הנוגדנים עם הנוגדן המשני, ודגרים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.הערה: משלב זה ואילך, הגנו על הצמחים מפני חשיפה ממושכת לאור. לשטוף את explants 2x במשך 5 דקות כל אחד עם 1x PBS. המשך לשלב הבא עבור תיוג כפול רציף של explants. יש לדגור עם נוגדן עיקרי שני (למשל, MYO7A לתאי שיער) למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם רעידות עדינות (40-60 סל”ד). לחלופין, דגרו עם פלואדין (1:150) במשך 40 דקות עד שעה בטמפרטורת החדר, והמשיכו לשלב 6.22.הערה: בצע תיוג רציף אם הנוגדנים העיקריים הם מאותו מין מארח. בצע תיוג phalloidin בסוף עבור immunofluorescence multiplex. לשטוף את explants 4x במשך 5 דקות כל אחד עם 1x PBS. יש לדלל את הנוגדן המשני בתמיסת נוגדנים (לדוגמה, עז נגד ארנב Alexa Fluor 488 או עז נגד עכבר Alexa Fluor 568 IgG בדילול של 1:500). מוסיפים 170 μL של הנוגדן המשני, ודגרים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לשטוף את explants 2x במשך 5 דקות כל אחד עם 1x PBS. הכינו תמיסת מלאי DAPI של 1 מ”ג/מ”ל, ואחסנו בטמפרטורה של -20°C. דלל את תמיסת מלאי DAPI ביחס 1:10 להכנת תמיסות עבודה של 0.1 מ”ג/מ”ל, ואחסן בטמפרטורה של 4°C.הערה: דלג על שלב 23 ועבור לשלב 26 אם נעשה שימוש באמצעי ההרכבה המכיל DAPI. דללו את פתרון העבודה של DAPI ביחס של 1:100 ב-PBS אחד, ודגרו על הצמחים עם 200 מיקרוליטר של תמיסת DAPI למשך 5 דקות. לשטוף את explants 2x במשך 5 דקות כל אחד עם 1x PBS. הסר את 1x PBS ככל האפשר כדי לאפשר לתחתית התא להתייבש. אל תתנו לחציל להתייבש. המתן 2-5 שניות, והוסף טיפה אחת של אמצעי הרכבה ישירות על explant.הערה: אמצעי ההרכבה על העציץ יישאר במקומו עקב מתח פני השטח. ניתן להשתמש באמצעי הרכבה הקשחה. אחסנו את התאים בטמפרטורה של 4°C עד להדמיה. 7. Immunofluorescence של תאים חיים מ explants השתמשו בצמחים המבודדים לאחר דגירה של לילה. הסר את המדיום, ובזהירות להוסיף 300 μL של מדיום המכיל 125 μM cisplatin. דגרו על הצמחים במשך 18 שעות כדי למדוד את תחמוצת העל המיטוכונדריאלית בצמחים החיים. השליכו את המדיום בסוף החשיפה לתרופה. הוסף 300 μL של בדיקה חדירה כדי לזהות את ROS התא (למשל, 250 ננומטר של מיטו-הידרואתידין) ו / או קספאז-3 (למשל, 2 מיקרומטר פפטיד DEVD מצומד לצבע קושר חומצת גרעין). יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות. שטפו את החצילים פעמיים בעדינות עם 200 מיקרוליטר של תמיסת מלח מאוזנת חמה של האנק (HBSS) או חיץ אפרופיט. דמיינו את התאים תוך שעתיים עם עירור פלואורסצנטי ב-400 ננומטר וזיהוי פליטה ב-590 ננומטר. השליכו את המדיום בסוף הניסוי, ושטפו מיד את הצמחים עם 200 מיקרוליטר של PBS 1x שחומם מראש. תקנו את החצילים, והכתימו את תאי השבלול כמתואר לעיל. 8. הדמיה על ידי הדמיה קונפוקלית דמיינו את העציצים באמצעות מיקרוסקופ המצויד ביחידה קונפוקלית של דיסק מסתובב או במיקרוסקופ קונפוקלי המצויד ביחידה קונפוקלית סורקת נקודתית. קבל את התמונות באמצעות דיסק מסתובב עם מטרת אוויר 20x (צמצם מספרי: 0.75) לספירת תאים. לחלופין, רכשו את התמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק נקודתי עם מטרת אוויר 40x (צמצם מספרי: 0.95) או מטרת שמן 100x (צמצם מספרי: 1.45) כדי לדמיין ולספור את הסינפסות או לדמיין את הסטריאוציליה.הערה: התאם את עוצמת הלייזר ואת זמן החשיפה לכל ערוץ כדי למנוע רוויית יתר ותת-רוויה של התמונות. החל את אותן הגדרות על כל הצמחים של אותו ניסוי. הגדר את המיקרוסקופ כדי ללכוד תמונה תלת-ממדית של כל השבלול באמצעות אובייקט אוויר 20x, ערימת Z וכלי תפירה אוטומטיים. השתמש 3 x 3 שדות סמוכים עם חפיפה של 15% עבור צמחים עכבר ו 4 x 4 שדות סמוכים עבור explants חולדות להיות תפורים יחד. התאימו את התמונות באמצעות תוכנת המיקרוסקופ או תוכנת הקוד הפתוח החינמיתFIJI 8.הערה: Deconvolution, טכניקת עיבוד תמונה, ניתנת ליישום על תמונות קונפוקליות כדי לחדד את הניגודיות והרזולוציה 9-11.