Explants cochléaires néonatals entiers comme modèle in vitro

Toutes les procédures relatives aux animaux ont été effectuées conformément aux directives et règlements du Comité de protection des animaux du canton de Bâle-Ville, en Suisse. Des souris postnatales C57BL/6JR, des rats Wistar et des souris déficientes en STAT1 (mixtes C57BL/6-129/SvEv)7 âgées de 3 à 5 jours et des deux sexes ont été utilisées pour les expériences. 1. Revêtement des chambres multi-puits Préparer le milieu de culture complet.Pour les explants d’organes de Corti, préparer un milieu contenant du milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco, 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 25 mM HEPES et 30 U/mL de pénicilline. Pour les explants d’organes de Corti et les explants cochléaires, préparez un milieu contenant du DMEM/F12, 1 supplément de N2, 1 x B27 moins d’antioxydants et 30 U/mL de pénicilline. Préparer une solution mère de poly-D-lysine en ajoutant 10 mL d’eau de culture cellulaire à 5 mg de poly-D-lysine dans une hotte laminaire. La concentration finale de poly-D-lysine est de 0,5 mg/mL.REMARQUE : Aliquoter le reste de la solution mère et conserver à −20 °C.Préparer les solutions de travail de poly-D-lysine en diluant la solution mère 1 :10 dans de l’eau stérile. Enduire une chambre à 8 puits de 150 μL/puits de solution de travail de poly-D-lysine et incuber pendant 30 min à température ambiante.REMARQUE : Si une chambre à 4 puits est utilisée, enduire de 300 μL/puits de solution de travail de poly-D-lysine. Aspirer la solution par aspiration ou pipetage. Laver 2 fois avec 200 μL d’eau stérile et une fois avec 200 μL de milieu de culture complet ou DMEM. Ajouter 150 μL de milieu de culture complet dans chaque puits.REMARQUE : Si une chambre à 4 puits est utilisée, ajouter 250 μL/puits de milieu de culture complet. Placez la chambre dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 pendant au moins 30 min avant de placer un explant. 2. Dissection de l’os temporal Désinfectez la table d’opération avec de l’éthanol à 70 % et stérilisez tous les instruments dans un stérilisateur à microsphères en verre. Placez une boîte de Pétri stérile de 60 mm sur un seau contenant de la glace. Versez quelques millilitres de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x et conservez-la sur de la glace.REMARQUE : Utilisez 30 U/mL de pénicilline dans 1x PBS pour éviter la contamination bactérienne. Placez un tampon stérile sur un plateau stérile et décapitez rapidement le chiot avec des ciseaux d’opération. Immergez la tête dans de l’éthanol à 70 % pendant 5 secondes, si la contamination est fréquente.REMARQUE : Ce protocole a été testé sur des souris et des rats âgés de P3 à P5. Les tissus cochléaires sont plus difficiles à disséquer chez les souris et les rats plus âgés, et la survie des explants en culture est limitée. Placez la tête de l’animal sur un tampon stérile. Retirez la mandibule. Soulevez la peau et décollez-la du crâne. Tenez le crâne en plaçant la pince dans les cavités orbitaires. Coupez soigneusement le crâne le long de la suture sagittale, puis coupez dans la zone de suture coronale avec une lame de scalpel tranchante sans endommager la cochlée.REMARQUE : Évitez d’appliquer trop de pression et évitez les mouvements vers l’avant et vers l’arrière avec le scalpel, car cela pourrait endommager l’os cochléaire et, par conséquent, le canal cochléaire. Retirez délicatement le cerveau des deux moitiés du crâne. Transférez les moitiés de crâne dans une boîte de Pétri de 60 mm avec le PBS glacé préparé à l’étape 2.3. 3. Isolement de la cochlée Localisez la cochlée dans l’os temporal au microscope. Placez la pince dans le canal semi-circulaire supérieur. Détachez le tissu environnant entre la cochlée et l’os temporal à l’aide d’une seringue à insuline (souris) ou d’une pince (rats). Retirez délicatement l’os temporal de la cochlée, en gardant la cochlée attachée au vestibule avec l’os temporal. Assurez-vous que la cochlée est libre du tissu environnant avant de pousser l’os temporal de côté.REMARQUE : L’application d’une force trop forte endommagera le canal cochléaire. Tenez la cochlée dans une position fixe et utilisez l’autre main pour retirer délicatement la capsule cochléaire cartilagineuse. Insérez délicatement les pointes de la pince dans la région de l’apex ou entre les spires (visibles sous forme de ligne blanche) et retirez la capsule morceau par morceau. Exposer le canal cochléaire. Placez délicatement la pince sous la cochlée et détachez-la de l’organe vestibulaire et de l’os temporal. Transférez la cochlée dans une nouvelle boîte de 60 mm contenant du PBS glacé. Ajustez le grossissement du microscope pour mieux visualiser les explants. Suivez les étapes suivantes pour les explants d’organes de Corti :Tenez l’organe à la base avec des pinces. Retirez délicatement le canal cochléaire en le saisissant avec une pince au niveau de la région du crochet basal. Déroulez le canal cochléaire du modiolus sans le déchirer. Retirez délicatement le ligament spiral avec la strie vasculaire en tenant l’organe à la base et en les éloignant.REMARQUE : La séparation des tissus peut également être réalisée en tenant la région apex au lieu de la région de base. Cela peut être utile lors de la dissection d’organes de rats ou de souriceaux plus âgés (>P5). Retirez délicatement la membrane de Reissner en tenant l’organe à la base et en le retirant morceau par morceau.REMARQUE : Il s’agit d’une étape facultative car la membrane de Reissner n’interfère pas avec l’acquisition de l’imagerie. Suivez les étapes suivantes pour les explants cochléaires :Détachez le ganglion spiralé de la lame spirale osseuse à l’aide d’une seringue à insuline (souris) ou d’une pince (rats). Déroulez doucement le modiolus pendant le détachement.REMARQUE : Les explants peuvent être divisés en deux morceaux pour une meilleure manipulation. Saisissez la région du crochet avec une pince. Retirez délicatement le ligament spiral avec la strie vasculaire en le tirant. Retirez délicatement la membrane de Reissner en tenant l’organe à la base et en le retirant morceau par morceau.REMARQUE : Cette étape est recommandée, car la membrane de Reissner se plie et recouvre généralement les filaments neuronaux et, par conséquent, peut affecter les expériences. 4. Culture d’explants cochléaires Transférez les explants de la boîte de Pétri dans les chambres à plusieurs puits. Soulevez les explants avec les cellules ciliées vers le haut à l’aide d’une spatule de laboratoire. Incluez quelques microlitres de 1x PBS pour éviter que les échantillons ne collent à la spatule.REMARQUE : Les explants gravement endommagés colleront à la spatule. Laissez les explants glisser de la spatule dans la chambre en agitant doucement la spatule dans le milieu. Placez un explant par puits d’une lame de chambre à 8 puits.REMARQUE : Si l’explant colle à la spatule, tenez la spatule dans le milieu et utilisez la pince pour détacher les explants. Placez toujours la pince sur le bord intérieur de l’explant (loin des cellules ciliées). Vérifier au microscope que les explants ont été transférés dans la bonne orientation et placés au centre des puits.REMARQUE : Les explants mal orientés avec les cellules ciliées tournées vers le bas ont tendance à montrer une forme de U vers le haut sur leur largeur. Corrigez leur orientation en déplaçant les explants vers les coins des chambres (plus de milieu est disponible) et dirigez-les vers la rotation. Retirez 80 μL du milieu à l’aide d’une pipette de 100 μL et jetez-le. Vérifiez au microscope si les cellules ciliées et les cellules neuronales ganglionnaires spirales sont visibles. Si nécessaire, utilisez une pince pour écarter doucement certains tissus qui se chevauchent. Retirez le reste du milieu et attendez ~10 s. Pipeter le dos moyen. Ajouter une ou deux gouttes de milieu à côté de l’explant et le reste du milieu à une certaine distance de l’explant pour éviter que l’explant ne se détache.REMARQUE : Même si les explants sont fixés aux chambres, le milieu doit toujours être ajouté en premier en pipetant une à deux gouttes à côté des explants. De cette façon, les explants ne seront pas soulevés lorsque le milieu complet restant sera ajouté. Remettez la chambre dans l’incubateur et incubez pendant 2 h pour permettre aux organes de se fixer fermement au fond de la chambre. Retirez le milieu et ajoutez délicatement 300 μL de milieu complet frais préchauffé à l’aide d’une pipette de 100 μL ou de 200 μL. N’utilisez pas de pipette de 1 ml.REMARQUE : Si un prétraitement est souhaité, après 2 h de fixation, ajouter 300 μL de milieu complet contenant la substance d’intérêt. Si une chambre à 4 puits est utilisée, utilisez jusqu’à 500 μL/puits. Remettez les chambres dans l’incubateur. 5. Test des agents ototoxiques Laissez les explants toute la nuit pour qu’ils s’adaptent aux conditions de culture et qu’ils se rétablissent. Préparez différentes concentrations d’agents ototoxiques pour trouver la concentration appropriée afin d’établir un modèle ototoxique avec une perte de cellules ciliées d’environ 50 %. Utiliser entre 50 μM et 250 μM pour la gentamicine et entre 40 μM et 320 μM pour le cisplatine. Préparez les solutions de cisplatine fraîches et protégez-les de la lumière. Retirez le milieu et ajoutez délicatement 300 μL de milieu contenant le médicament ototoxique souhaité. Incuber les explants avec de la gentamicine et du cisplatine à 37 °C pendant 24 h à 48 h pour déterminer la survie des cellules ciliées.REMARQUE : Les concentrations de médicament et la durée d’exposition sont choisies en fonction de l’objectif de l’étude. La conservation des explants a été testée ici jusqu’à 72 h. N’utilisez pas de sérum si vous prévoyez d’effectuer une culture à long terme. Suivez la section suivante pour colorer les cellules cochléaires. 6. Fixation et immunofluorescence Jetez le milieu à la fin de l’expérience et lavez immédiatement les explants avec 200 μL de PBS 1x préchauffé. Fixez les explants avec 200 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % pendant 15 min sous une hotte chimique.ATTENTION : Le PFA est un produit chimique dangereux ; lire la fiche signalétique (FDS) avant de travailler avec PFA pour la première fois. Lavez les explants deux fois avec 200 μL de 1x PBS. Conservez les explants dans 1x PBS à 4 °C au cas où les procédures de coloration devraient être reportées. Préparez la solution de perméabilisation composée de 1x PBS et de 1%-5% de Triton-X100. Jeter le 1x PBS, ajouter 200 μL de solution de perméabilisation et incuber les explants pendant 15 min. Préparez la solution de blocage.Pour les explants d’organes de Corti, préparer une solution bloquante composée de 1x PBS, de 10% de sérum de chèvre normal (NGS, pour les anticorps secondaires de chèvre, ou d’un autre sérum de la même espèce que les anticorps secondaires). Vous pouvez également utiliser de l’albumine sérique bovine (BSA) à 1 % à 5 % si les cellules sont colorées uniquement avec de la phalloïdine. Pour les explants cochléaires, préparer une solution bloquante composée de 1 x PBS, de 10 % de NGS et d’un fragment Fab (fragment Fab d’IgG H+L de chèvre anti-souris, dilution de 1 :200) si vous utilisez des anticorps primaires de souris (par exemple, anti-TuJ1 de souris) pour colorer les cellules ganglionnaires spirales. Ajouter 200 μL de solution de blocage et incuber les explants pendant 1 h. Jetez la solution bloquante. Aux explants incubés avec Fab fragment, ajouter 200 μL de PFA à 4 % et incuber pendant 5 min. Lavez les explants avec 1x PBS pendant 5 min. Préparez une solution d’anticorps composée de 1 PBS, de 5 % de NGS et de 0,1 % à 0,25 % de Triton-X100. Diluer l’anticorps primaire dans une solution d’anticorps – MYO7A (ab3481 à une dilution de 1 :500 ou MYO7A 138-1 à 1 :100) – pour marquer les cellules ciliées et TuJ1 (1 :400) pour marquer les neurones ganglionnaires spiralés.REMARQUE : Si les cellules ciliées ne sont marquées qu’avec de la phalloïdine, diluez la phalloïdine à 1 :150 dans 1x PBS, incubez pendant 40 min à 1 h à température ambiante et passez à l’étape 6.22. Inclure un contrôle pour la liaison non spécifique de l’anticorps secondaire en omettant l’anticorps primaire. Ajouter 170 μL de la solution d’anticorps avec l’anticorps primaire dans le puits correspondant et incuber pendant une nuit à 4 °C en agitant doucement (40-60 tr/min). Lavez les explants 4 fois pendant 5 min chacun avec 1 PBS. Diluer l’anticorps secondaire dans une solution d’anticorps (par exemple, Alexa Fluor 488 anti-lapin de chèvre ou Alexa Fluor 568 IgG anti-souris de chèvre à une dilution de 1 :500). Ajouter 170 μL de la solution d’anticorps avec l’anticorps secondaire, et incuber pendant 1 h à température ambiante.REMARQUE : À partir de cette étape, protégez les explants d’une exposition prolongée à la lumière. Lavez les explants 2x pendant 5 min chacun avec 1x PBS. Passez à l’étape suivante pour le double étiquetage séquentiel des explants. Incuber avec un deuxième anticorps primaire d’intérêt (p. ex., MYO7A pour les cellules ciliées) pendant la nuit à 4 °C en agitant doucement (40-60 tr/min). Vous pouvez également incuber avec de la phalloïdine (1 :150) pendant 40 min à 1 h à température ambiante et passer à l’étape 6.22.REMARQUE : Effectuer un marquage séquentiel si les anticorps primaires proviennent de la même espèce hôte. Effectuez un marquage de la phalloïdine à la fin pour l’immunofluorescence multiplex. Lavez les explants 4 fois pendant 5 min chacun avec 1 PBS. Diluer l’anticorps secondaire dans une solution d’anticorps (par exemple, Alexa Fluor 488 anti-lapin de chèvre ou Alexa Fluor 568 IgG anti-souris de chèvre à une dilution de 1 :500). Ajouter 170 μL de l’anticorps secondaire et incuber pendant 1 h à température ambiante. Lavez les explants 2x pendant 5 min chacun avec 1x PBS. Préparer une solution mère DAPI de 1 mg/mL et conserver à −20 °C. Diluer la solution mère DAPI 1 :10 pour préparer des solutions de travail de 0,1 mg/mL et conserver à 4 °C.REMARQUE : Ignorez l’étape 23 et passez à l’étape 26 si le support de montage contenant DAPI est utilisé. Diluer la solution de travail DAPI 1 :100 dans 1x PBS et incuber les explants avec 200 μL de solution DAPI pendant 5 min. Lavez les explants 2x pendant 5 min chacun avec 1x PBS. Retirez le 1x PBS autant que possible pour permettre au fond de la chambre de sécher. Ne laissez pas sécher l’explant. Attendez 2 à 5 s et ajoutez une goutte de produit de montage directement sur l’explant.REMARQUE : Le milieu de montage sur l’explant restera en place en raison de la tension superficielle. Un support de montage durcissant peut être utilisé. Conservez les chambres à 4 °C jusqu’à l’imagerie. 7. Immunofluorescence de cellules vivantes provenant d’explants Utilisez les explants isolés après une nuit d’incubation. Retirer le milieu et ajouter délicatement 300 μL de milieu contenant 125 μM de cisplatine. Incuber les explants pendant 18 h pour mesurer le superoxyde mitochondrial dans les explants vivants. Jetez le milieu à la fin de l’exposition au médicament. Ajouter 300 μL d’une sonde perméable pour détecter les ROS cellulaires (p. ex., 250 nM de mito-hydroéthidine) et/ou la caspase-3 (p. ex., 2 μM de peptide DEVD conjugué à un colorant de liaison aux acides nucléiques). Incuber à 37 °C pendant 30 min. Lavez délicatement les explants deux fois avec 200 μL de solution saline équilibrée de Hank’s (HBSS) tiède ou un tampon approprié. Imagez les cellules en moins de 2 h avec une excitation de fluorescence à 400 nm et une détection d’émission à 590 nm. Jetez le milieu à la fin de l’expérience et lavez immédiatement les explants avec 200 μL de PBS 1x préchauffé. Fixez les explants et colorez les cellules cochléaires comme décrit ci-dessus. 8. Visualisation par imagerie confocale Imagez les explants à l’aide d’un microscope équipé d’une unité confocale à disque rotatif ou d’un microscope confocal équipé d’une unité confocale à balayage ponctuel. Acquérez les images à l’aide d’un disque rotatif avec un objectif d’air 20x (ouverture numérique : 0,75) pour le comptage des cellules. Vous pouvez également acquérir les images à l’aide d’un microscope confocal à balayage ponctuel avec un objectif à air 40x (ouverture numérique : 0,95) ou un objectif à huile 100x (ouverture numérique : 1,45) pour visualiser et compter les synapses ou imager les stéréocils.REMARQUE : Ajustez l’intensité du laser et le temps d’exposition pour chaque canal afin d’éviter la sursaturation et la sous-saturation des images. Appliquez les mêmes paramètres à tous les explants d’une même expérience. Configurez le microscope pour capturer une image 3D de l’ensemble de l’explant cochléaire à l’aide d’un objectif pneumatique 20x, d’une pile z et d’outils d’assemblage automatique. Utilisez 3 x 3 champs adjacents avec un chevauchement de 15 % pour les explants de souris et 4 x 4 champs adjacents pour les explants de rats à coudre ensemble. Ajustez les images à l’aide du logiciel du microscope ou du logiciel gratuit et open-source FIJI8.REMARQUE : La déconvolution, une technique de traitement d’image, peut être appliquée aux images confocaux pour améliorer leur contraste et leur résolution 9-11.