Ganze neonatale Cochlea-Explantate als In-vitro-Modell
Summary
Das aktuelle Protokoll aktualisiert frühere Protokolle und enthält relativ einfache Ansätze für die Kultivierung hochwertiger Cochlea-Explantate. Dies ermöglicht eine zuverlässige Datenerfassung und hochauflösende Bildgebung in lebenden und fixierten Zellen. Dieses Protokoll unterstützt den anhaltenden Trend zur Untersuchung von Innenohrzellen.
Abstract
Unbehandelter Hörverlust verursacht erhebliche Kosten für das globale Gesundheitssystem und beeinträchtigt die Lebensqualität des Einzelnen. Die Schallempfindungsschwerhörigkeit ist gekennzeichnet durch den kumulativen und irreversiblen Verlust von sensorischen Haarzellen und Hörnerven in der Cochlea. Vollständige und vitale Cochlea-Explantaten sind eines der grundlegenden Werkzeuge in der Hörforschung, um Haarzellverlust zu erkennen und die molekularen Mechanismen der Innenohrzellen zu charakterisieren. Vor vielen Jahren wurde ein Protokoll für die Cochlea-Isolierung von Neugeborenen entwickelt, das zwar im Laufe der Zeit modifiziert wurde, aber immer noch Verbesserungspotenzial birgt.
In dieser Arbeit wird ein optimiertes Protokoll für die Isolierung und Kultivierung ganzer neonataler Cochlea-Explantate in Multi-Well-Kulturkammern vorgestellt, das die Untersuchung von Haarzellen und Spiralganglien-Neuronenzellen entlang der gesamten Länge der Cochlea ermöglicht. Das Protokoll wurde mit Cochlea-Explantaten von Mäusen und Ratten getestet. Gesunde Cochlea-Explantaten wurden gewonnen, um die Interaktion zwischen Haarzellen, Spiralganglien-Neuronenzellen und den umgebenden Stützzellen zu untersuchen.
Einer der Hauptvorteile dieser Methode besteht darin, dass sie die Organkulturschritte vereinfacht, ohne die Qualität der Explantaten zu beeinträchtigen. Alle drei Windungen des Corti-Organs sind am Boden der Kammer befestigt, was In-vitro-Experimente und die umfassende Analyse der Explantaten erleichtert. Wir stellen einige Beispiele für Cochlea-Bilder aus verschiedenen Experimenten mit lebenden und fixierten Explantaten zur Verfügung, die zeigen, dass die Explantate ihre Struktur trotz Exposition gegenüber ototoxischen Medikamenten beibehalten. Dieses optimierte Protokoll kann für die integrative Analyse der Cochlea von Säugetieren eingesetzt werden.
Introduction
Die meisten Fälle von Schallempfindungsschwerhörigkeit sind auf die Degeneration von sensorischen Haarzellen, Hörnervenzellen und/oder Hörsynapsen zurückzuführen1. Dieser degenerative Prozess in den Sinneszellen ist fortschreitend und in der Regel irreversibel, was zu einem Hörverlust führt2. Daher sind Informationen über die Lebensfähigkeit von Sinneszellen und Veränderungen der Signalwege unter Stressbedingungen von entscheidender Bedeutung, um die Zellen vor Schäden und damit vor Verlust zu schützen. Die Untersuchung von Cochlea-Explantaten in Kultur ermöglicht die Rekapitulation des Gewebekomplexes und die Aufrechterhaltung eines normalen Zell-Zell-Netzwerks, was eine bessere Beschreibung der Signalprozesse ermöglicht. Um experimentelle Modelle der Ototoxizität zu etablieren, wurden häufig das Antibiotikum Gentamicin und das Chemotherapeutikum Cisplatin verwendet, da von ihnen ototoxische Nebenwirkungen bekannt sind3.
In-vitro-Kultursysteme von Cochlea-Explantaten wurden im Laufe der Zeit entwickelt und modifiziert. Eine Beschreibung des schrittweisen Protokolls für die Kultivierung ganzer Cochlea-Explantate fehlt jedoch häufig in mehreren Publikationen. Eines der ersten Videoprotokolle für die Primärkultur des murinen Organs von Corti wurde von Parker et al. veröffentlicht, in dem die Autoren die Schritte zur Isolierung des sensorischen Epithels, zur Kultivierung auf Glasdeckgläsern und zur Elektroporation von Explantaten für Transfektionsexperimente beschrieben4. Zuvor wurde auch ein weiteres Protokoll mit Deckgläsern aus Glas veröffentlicht, in dem die Organisation der Zellstruktur im Innenohr berücksichtigt wurde5. Es wurde über ein alternatives Protokoll mit Millicell-Membran für die Kultur von Mausexplantaten des Corti-Organs und des vestibulären Organs berichtet6. Diese Videoberichte haben zur Verbesserung der Methode beigetragen, aber es gibt immer noch Herausforderungen, die gelöst werden müssen. Um eine Reihe von Problemen zu lösen, die sich aus der Verwendung von Deckgläsern und Einsätzen aus Glas ergeben, zielt das vorliegende Protokoll darauf ab, die Organkulturschritte zu rationalisieren und qualitativ hochwertige Organe zu kultivieren, um zuverlässige Daten zu erhalten. Dies wird erreicht, indem die direkte Handhabung des Organs während der experimentellen Verfahren minimiert und der Organtransfer vermieden wird, bevor hochauflösende Bilder der lebenden und fixierten Zellen erhalten werden.
Das vorliegende Protokoll aktualisiert bereits veröffentlichte In-vitro-Kultursysteme und führt mehrere Optimierungen bei der Isolierung des Corti-Organs und dem Transfer in die Kulturkammern sowie die Integration einer neuen Objektträgerkammer ein, um die Kulturbedingungen und die weitere Analyse zu verbessern. Dieses optimierte Protokoll reduziert das Risiko einer Beschädigung des Organs, die bei der Verwendung von Deckgläsern während des Medienwechsels oder während der Übertragung des Organs aus Deckgläsern oder Membranen zur weiteren Analyse auftreten kann 4,5,6. Die Deckgläser aus Glas haben einen besseren Reflexionsindex als die aus Kunststoff; Sie sind jedoch zerbrechlich und können leichter brechen. Die hier verwendeten Multiwell-Kammern sind auf einem Objektträger befestigt, die sich gut für die Organkultur und für die hochauflösende Bildgebung eignen. Der Transfer der isolierten Organe erfolgt mit einem Spatel, der es ermöglicht, das Organ in die richtige Ausrichtung zu bringen und in die Kammer zu schieben, anstatt wie zuvor empfohlen mit einer Pipette Kraft auszuüben 4,5,6.
Die Poly-D-Lysin-beschichteten Multi-Well-Kammern, die ausreichend Medium enthalten sollten, erleichtern den Organtransfer und die korrekte Positionierung der Explantate ohne Adhäsionsdruck und unter Vermeidung von Organüberlappungen, wie bereits erwähnt6. Darüber hinaus werden zufällige Organüberlappungen und ungleichmäßige Strukturen mit einem konfokalen Z-Stapel aufgelöst. Dieses Protokoll wurde für verschiedene Anwendungen optimiert, wie z. B. Explantate von Mäusen und Ratten, Explantaten des Corti- und Cochlea-Organs, Kultur in serumhaltigem und serumfreiem Medium, ototoxische Bewertungen und allgemeine Arzneimittelansprechexperimente. Die Cochlea-Explantaten werden in Kammern mit einem Deckglasboden montiert und inkubiert, was die Haftung der Cochlea-Explantate an den Kammern erleichtert, um eine optimale Handhabung während der In-vitro-Experimente , die Nachbearbeitung der Explantate und die Abbildung von lebenden und fixierten Cochlea-Explantaten zu ermöglichen. Die Visualisierung der gesamten Länge des Corti-Organs und die Quantifizierung der Haarzellen werden optimiert. Darüber hinaus sind die Beurteilungen der Stützzellen, Spiralganglien-Neuronenzellen und Neuriten genau. Daher kann dieses Protokoll für eine umfassende Analyse von Cochlea-Zellen von Säugetieren verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Zweck der Aktualisierung dieses Protokolls bestand darin, die Schritte von der Isolierung der Explantate bis zur Bildgebung der lebenden und fixierten Cochlea-Zellen zu rationalisieren. Wir haben einige Schritte während der Isolierung verbessert und einige innovative Werkzeuge eingeführt, mit dem Ziel, ein effizientes und reibungslos funktionierendes Protokoll zu etablieren, um qualitativ hochwertige Explantaten zu erhalten. Bei dem beschriebenen Verfahren handelt es sich um ein optimiertes Protokoll aus früheren Berichten 4,5. Darüber hinaus fehlt in einigen aktuellen Studien ein schrittweise aktualisiertes Protokoll. Mit vereinfachten Explantatkulturschritten bietet dieses Protokoll die einfache Handhabung gut erhaltener Explantate, was für reproduzierbare Daten unerlässlich ist. Die Einführung von Multi-Well-Kammern mit einem Polymer-Deckglas für Innenohr-Explantaten verbessert die Organbefestigung und die Erhaltung intakter Explantate. Hier stellen wir einige Beispiele von Experimenten unter Stressbedingungen vor, um zu zeigen, dass die Organe in Kultur ihre zelluläre Organisation trotz des Verlustes von Haarzellen und der Schädigung der Neuriten beibehalten.
Eine der Herausforderungen bei der Kultivierung von Innenohrorganen besteht darin, die Ablösung und das Aufschwimmen der Organe zu vermeiden, da dies die Integrität der Explantate, das Ansprechen auf die Behandlung und die nachfolgenden Untersuchungen beeinträchtigt. Zuvor wurden Explantaten auf Glasdeckgläsern 4,5 kultiviert. Obwohl die Kultur auf Glasoberflächen eine gute Alternative zu sein scheint, ist die Beschichtung des Glases zeitaufwändig, und die Deckgläser selbst sind zerbrechlich und empfindlich. Ein alternatives Protokoll mit Millicell-Zellkultur-Inserts versucht, dieses Problem zu lösen6. Das Schneiden und Übertragen der Membran mit den Explantaten scheint jedoch ein heikler Schritt in diesem Protokoll zu sein. Darüber hinaus können die Explantate während der Montage und Versiegelung des Deckglases beschädigt werden. In unserem vorgeschlagenen Ansatz ist nach dem Transfer der Explantaten in die mit Poly-D-Lysin beschichteten Kammern und der richtigen Position kein weiterer Transfer oder Abdecken mit Deckgläsern erforderlich. Ein weiterer Vorteil dieses Protokolls ist die Verwendung von Kammern mit einem dünnen, gasdurchlässigen Polymer-Deckglas, das optimale Kulturbedingungen für die Organexplantate bietet. Dieses Polymer hat eine glasähnliche optische Qualität und eignet sich daher für die Zellbildgebung in der hochauflösenden Mikroskopie.
Die Zugabe von Serum zum Medium wird in den meisten Protokollen für Zell- und Gewebekulturen verwendet, einschließlich der Kultur von Innenohrexplantaten mit 1%-10% FBS 4,5,6,16. Das Vorhandensein von Serum beeinflusst die Kulturbedingungen der Experimente; Daher wird in bestimmten Situationen die Kultur ohne Serum bevorzugt. Das Fehlen von Serum in der Kultur der Cochlea-Explantate wurde entweder durch die Zugabe von N2 zu DMEM oder durch die Zugabe von N2 zu Neurobasal-A-Medium 5,6 ersetzt. In diesem Zusammenhang haben wir die Kulturbedingungen der Explantate mit und ohne Serum getestet. Unter beiden Bedingungen waren die Innenohrzellen vital und reagierten auf ototoxische Bedingungen. Wir haben diese Bedingungen 72 Stunden lang getestet, aber die Explantate können noch länger in Kultur gehalten werden, insbesondere wenn sie mit serumfreiem Medium zusammen mit N2, B27 und Wachstumsfaktoren inkubiert werden, wie in anderen Studien vorgeschlagen 5,16.
Neben den allgemeinen kritischen Schritten bei der Isolierung von Innenohrexplantaten, wie z.B. der Dauer der Organisolierung und des verwendeten Antibiotikums, gibt es auch einige kritische Schritte in diesem Protokoll, die jedoch überschaubar sind. Einer der kritischen Schritte bei dieser Methode bezieht sich auf das Volumen des Mediums, das nach dem Einsetzen des Organs in der Kammer verbleibt. Dies wurde optimiert, um die Explantaten am Leben zu erhalten und an der Unterseite zu befestigen. Ein weiterer kritischer Schritt bezieht sich auf die Inkubationszeit, die erforderlich ist, damit sich die Explantaten am Boden der Kammer anheften können. Inkubationszeiten von mehr als 2 h mit wenigen Mikrolitern Medium können die Gesundheit der Explantate beeinträchtigen. Kürzere Inkubationszeiten, wie z.B. 1 h, können ebenfalls verwendet werden, solange darauf geachtet wird, dass sich die Explantaten nicht ablösen. Ein weiterer wichtiger Aspekt sind die Rückstände von Poly-D-Lysin. Die Waschschritte von Poly-D-Lysin sollten strikt eingehalten werden, da Rückstände des Bromidsalzes von Poly-D-Lysin für die Zellen giftig sein können. Nachdem die Waschschritte genau befolgt wurden, erleichtert die Beschichtung mit Poly-D-Lysin die reibungslose Haftung der Explantate an den Kammern, so dass die Position korrigiert werden kann, bevor sie fest am Boden der Kammer haften.
Eine der Einschränkungen dieser Methode ist die Abbildung von Zellen mit aufrechter Mikroskopie. Dies könnte ein wichtiges Thema für Labore mit inversen Mikroskopen sein. Objektträger mit herausnehmbaren Silikonkammern können für die aufrechte und inverse Mikroskopie verwendet werden; Unsere Beschichtungsbedingungen mit Poly-D-Lysin müssen jedoch zuerst getestet werden. Eine weitere Einschränkung ist die Lagerung der Kammern, da die Einsätze nicht herausnehmbar sind und die Gesamthöhe einer Kammer mit Deckel fast 11 mm beträgt, verglichen mit der Höhe von 1 mm eines Standard-Objektträgers. Die 8-Well-Kammer benötigt jedoch weniger Platz als die 4-Well-Platten, die vor16 vorgeschlagen wurden.
Wir präsentieren hier Bilder, die mit zwei Mikroskopen aufgenommen wurden. Während das konfokale Punkt-Scanning-Mikroskop aufgrund seines dünnen optischen Querschnitts hochauflösende Bilder von Geweben liefert, bietet das konfokale Spinning-Disk-Mikroskop eine schnellere Abbildungszeit bei guter Auflösung. Die Stereozilien der inneren Haarzellen (IHCs) und der äußeren Haarzellen (OHCs) werden mittels konfokaler Mikroskopie sichtbar gemacht. Da die Stereozilien von IHCs größer sind als die von OHCs, wurden sie in dieser Arbeit wiederholt und gut visualisiert. Bei OHC-Stereozilien können andere alternative Mikroskope die Visualisierung verbessern, wie z. B. die Super-Resolution-Mikroskopie (SRM). Die mit dem Spinning-Disk-Mikroskop aufgenommenen Explantatbilder sind ausreichend für die einfache Integration der automatisierten Haarzellzählung unter Verwendung eines Deep-Learning-Ansatzes12. Darüber hinaus ist die kurze Aufnahmezeit wichtig für Experimente mit lebenden Zellen und Geweben. Darüber hinaus ist dieses Protokoll nicht auf neonatale Cochlea-Explantate beschränkt. Mit einigen Optimierungen können auch andere Explantaten wie vestibuläre Organe oder embryonales Gewebe kultiviert werden.
Die Quantifizierung von Cochlea-Zellen, wie Haarzellen und Neuronen, in vitro ist wichtig für die Beurteilung der Zelllebensfähigkeit und damit des Prozentsatzes der beschädigten oder verlorenen Zellen. Untersuchungen von Signalwegen und Zellfunktionen helfen, die Mechanismen von Tod und Überleben aufzudecken. Untersuchungen von embryonalem und neonatalem Cochlea-Gewebe sind nützlich, um die Entwicklungsstadien der Cochlea zu untersuchen. Daher wird dieses Protokoll dazu beitragen, In-vitro-Studien von Innenohr-Explantaten zu optimieren, z. B. um ototoxische Modelle zu erstellen, Entwicklungsstadien zu untersuchen, Signalwege zu bewerten und Wirkstoff-Screening-Studien durchzuführen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken der Animal Facility des Departements Biomedizin der Universität Basel für ihre Unterstützung bei der Tierpflege, den Microscopy Core Facilities sowie dem Informatikdienst des Departements Biomedizin für ihre technische Unterstützung und dem Schweizerischen Nationalfonds (SNF) für die finanzielle Unterstützung (MD-PhD-Stipendium an M.C., Förderkennzeichen 323530_191222).
Materials
| 15 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube 17 x 120 mm style | FALCON | 352096 | |
| 45° Angled Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm style | FALCON | 352070 | |
| Antifade Mounting Medium | VECTASHIELD | H-1000 | |
| Alexa Fluor 568 phalloidin | Thermofisher | 2151755 | |
| Anti-beta III Tubulin antibody [TUJ-1] | Abcam | ab14545 | |
| Antifade Mounting Medium With DAPI | VECTASHIELD | H-1200 | |
| Anti-myosin VII rabbit polyclonal | Abcam | ab3481 | |
| B-27 Supplement (50x), minus antioxidants | Thermofisher | 10889038 | |
| CARBON STEEL surgical blades 23 | Swann Moiton | 210 | |
| CellEvent™ Caspase-3/7 Green Detection Reagent | Thermofisher | C10723 | |
| DMEM/F-12/(1:1)(1x) + GlutaMAX | Thermofisher | 31331028 | |
| Double spatulas, one curved end | VWR | RSGA038.150 | |
| Ethyl alcohol 70% V/V 1,000 mL | bichsel | 160 0 106 00 | |
| Fetal Bovine Serum, certified | Thermofisher | 16000036 | |
| Fixative Solution 4% paraformaldehyde prepared in PBS | Thermofisher | 201255309/201255305 | |
| High Intensity Cold Halogen Light Source | Intralux® | 5100 | |
| Huygens Professional version 21.10 | Scientific Volume Imaging | ||
| ibidi µ-Slide 8 well | ibidi | 80826 | |
| microscope | LEICA | M80 | |
| microscope | LEICA | MS5 | |
| MitoSOX™ Red Mitochondrial Superoxide Indicator, for live-cell imaging | Thermofisher | M36008 | |
| N2 supplement (100x) | Thermofisher | 17502048 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope with a Yokogawa CSU-W1 spinning disk confocal unit, and a Photometrics Prime 95B camera. | NIKON | ||
| Nikon Eclipse Ti microscope with an A1 point-scanning confocal unit | NIKON | ||
| Operating scissors | Fine Science Tools | 14005-16 | |
| Operating scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Operating tweezers | Fine Science Tools | 11008-15 | |
| PBS pH 7.2 (1x), 500mL | Thermofisher | 20012-019 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| POLY-D-LYSINE HYDROBROMIDE MOL WT GT 30 | Sigma-Aldrich | P7405 | |
| Scalpel Handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Steri 250 Second sterilizer | Simon Keller AG | 031100 | |
| Sterilizer, desiccant pellets | Simon Keller AG | 31120 | |
| Tissue Culture Dish 60 x 15 mm | FALCON | 353802 | |
| Tissue Culture Dish 60 x 15 mm | FALCON | 353004 | |
| Trito X-100 | Sigma | T9284 | |
| Unconventional myosin-VIIa | Developmental Studies Hybridoma Bank | 138-1s | |
| WFI for Cell Culture[-]Antimicrobial, 500 mL | Thermofisher | A12873-01 |
References
- Mukherjea, D., et al. The design and screening of drugs to prevent acquired sensorineural hearing loss. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (5), 491-505 (2011).
- Takeda, H., Dondzillo, A., Randall, J. A., Gubbels, S. P. Challenges in cell-based therapies for the treatment of hearing loss. Trends in Neurosciences. 41 (11), 823-837 (2018).
- Schacht, J., Talaska, A. E., Rybak, L. P. Cisplatin and aminoglycoside antibiotics: Hearing loss and its prevention. The Anatomical Record. 295 (11), 1837-1850 (2012).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. Journal of Visualized Experiments. (36), e1685 (2010).
- Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Durbin, J. E., Hackenmiller, R., Simon, M. C., Levy, D. E. Targeted disruption of the mouse Stat1 gene results in compromised innate immunity to viral disease. Cell. 84 (3), 443-450 (1996).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Etournay, R., et al. Cochlear outer hair cells undergo an apical circumference remodeling constrained by the hair bundle shape. Development. 137 (8), 1373-1383 (2010).
- MacDonald, G. H., Rubel, E. W. Three-dimensional imaging of the intact mouse cochlea by fluorescent laser scanning confocal microscopy. Hearing Research. 243 (1-2), 1-10 (2008).
- Sibarita, J. B. Deconvolution microscopy. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 201-243 (2005).
- Cortada, M., Sauteur, L., Lanz, M., Levano, S., Bodmer, D. A deep learning approach to quantify auditory hair cells. Hearing Research. 409, 108317 (2021).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Ershov, D., et al. TrackMate 7: Integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nature Methods. 19 (7), 829-832 (2022).
- Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: A generalist algorithm for cellular segmentation. Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).
- Zhang, L. W., Cang, X. H., Chen, Y., Guan, M. X. In vitro culture of mammalian inner ear hair cells. Journal of Zhejiang University of Science B. 20 (2), 170-179 (2019).
