Summary

Estandarización de un ensayo citométrico de perlas basado en anticuerpos de yema de huevo

Published: May 19, 2023
doi:

Summary

Este protocolo describe una metodología para la preparación de perlas de látex para ensayos con anticuerpos IgY para la detección de antígenos.

Abstract

Los inmunoensayos son pruebas importantes para la detección de numerosas dianas moleculares. Entre los métodos disponibles en la actualidad, el ensayo citométrico de perlas ha ganado protagonismo en las últimas décadas. Cada microesfera que es leída por el equipo representa un evento de análisis de la capacidad de interacción entre las moléculas bajo prueba. Miles de estos eventos se leen en un solo ensayo, lo que garantiza una alta precisión y reproducibilidad del ensayo. Esta metodología también se puede utilizar en la validación de nuevos insumos, como los anticuerpos IgY, para el diagnóstico de enfermedades. Estos anticuerpos se obtienen a través de la inmunización de pollos con el antígeno de interés y luego la extracción de la inmunoglobulina de la yema de los huevos de los animales; Por lo tanto, este es un método indoloro y altamente productivo para obtener los anticuerpos. Además de una metodología para la validación de alta precisión de la capacidad de reconocimiento de anticuerpos de este ensayo, este artículo también presenta un método para extraer estos anticuerpos, determinar las mejores condiciones de acoplamiento para los anticuerpos y las perlas de látex, y determinar la sensibilidad de la prueba.

Introduction

Entre las técnicas de inmunoensayo destinadas al diagnóstico de enfermedades, el ensayo de perlas citométricas se ha convertido en un enfoque altamente sensible y fiable, ya que permite el análisis de miles de partículas en un solo ensayo1. Esta técnica, además de tener una alta productividad y permitir el uso de volúmenes más pequeños de muestras, también presenta una gran flexibilidad, ya que permite la detección de varias moléculas, como citoquinas, moléculas de adhesión, isotipos de anticuerpos y proteínas 2,3.

Para el desarrollo de estos ensayos se utilizan diferentes partículas, entre ellas las perlas de látex, que son un insumo efectivo y de bajo costo. Estos pueden presentar modificaciones en su superficie, como la presencia de grupos funcionales o proteínas que permiten el acoplamiento covalente o no covalente de ciertas moléculas 3,4,5.

Estos inmunoensayos utilizan componentes como antígenos y anticuerpos para realizar la detección de marcadores de enfermedades y, por lo general, requieren anticuerpos de mamíferos como ratones, conejos y cabras. Esto crea problemas relacionados con cuestiones éticas, ya que la inmunización de los mamíferos generalmente requiere de muchos animales para obtener un buen rendimiento, así como la frecuente realización de procedimientos que conducen al sufrimiento de los animales 6,7. Una alternativa a esto es el uso de anticuerpos IgY aislados de las yemas de huevo de pollos inmunizados, ya que en las yemas se pueden encontrar altas concentraciones de los anticuerpos específicos contra los antígenos inoculados; La producción de un pollo equivale a la producción de 4,3 conejos en el transcurso de un año 6,7.

Por lo tanto, el objetivo de este protocolo es proporcionar un método para evaluar los anticuerpos IgY obtenidos de yemas de huevo de gallina mediante citometría de flujo con perlas de látex. Para ello, proponemos un método de estandarización para un inmunoensayo citométrico de perlas en formato sándwich utilizando perlas de látex. Como modelo, utilizamos anticuerpos IgY dirigidos al antígeno de la proteína II rica en histidina de Plasmodium falciparum (IgY-PfHRP2). Describimos un método para extraer los anticuerpos, discutimos los pasos críticos para definir la concentración de acoplamiento de estos a las perlas de látex y presentamos una evaluación del límite de detección del antígeno. La alta precisión de la citometría de flujo, junto con el bajo costo de las perlas de látex, hacen que esta técnica sea aplicable para el análisis de herramientas de inmunoensayo, como anticuerpos y antígenos. Este método se puede utilizar para la detección de diversos objetivos.

Protocol

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos e instrumentos utilizados en este protocolo. 1. Extracción de IgY de yemas de huevo Higienización de los óvulosSumerja los huevos (recién puestos o hasta 4 días después de la puesta, del linaje Gallus gallus Dekalb White) en una solución diluida al 0,2% de hipoclorito de sodio, enjuague rápidamente con agua corriente y…

Representative Results

La Figura 2 proporciona una representación gráfica del proceso de extracción de anticuerpos IgY mediante acidificación, seguido de la separación mediante ácido caprílico (Figura 2). Figura 2: Representación esquemática de la etapa de extracción de antic…

Discussion

El método de precipitación del anticuerpo IgY mediante la reducción del pH seguido de la separación de lípidos mediante ácido caprílico es eficaz para aislar los anticuerpos totales sin pérdida de funcionalidad. El método aquí propuesto es más sencillo y económico que el reportado por Redwan et al.11, que también utilizaron precipitación por acidificación y ácido caprílico, pero con un protocolo más complejo y laborioso. Este método también presenta ventajas sobre las metodolog…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a la FIOCRUZ (Programa de excelencia en pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane – ILMD/Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA), al Programa de Posgrado en Biotecnología (PPGBIOTEC de la Universidade Federal do Amazonas – UFAM), a la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES) y a la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) por la concesión de las becas. La Figura 2 y la Figura 4 se crearon con biorender.com.

Materials

Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF 488A antibody produced in donkey Sigma-Aldrich SAB4600031
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab′)2 Sigma-Aldrich SAB4600388
BD FACSCanto II BD Biosciences BF-FACSC2
BD FACSDiva CS&T research beads (CS&T research beads) BD Biosciences 655050
BD FACSDiva software 7.0 BD Biosciences 655677
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad #5000006
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4503
Caprilic acid Sigma-Aldrich O3907
Centrifuge 5702 R Eppendorf Z606936
Chloride 37% acid molecular grade NEON 02618 NEON
CML latex, 4% w/v Invitrogen C37253
Megafuge 8R Thermo Scientific TS-HM8R
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC) Sigma-Aldrich E7750-1G
N-Hydroxysuccinimide (NHS) Sigma-Aldrich 130672-25G
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich 1003335620
Sodium hydroxide Acs Cientifica P.10.0594.024.00.27
Sodium hypochlorite Acs Cientifica R09211000
Thermo Mixer Heat/Cool KASVI K80-120R

References

  1. Salzer, U., Sack, U., Fuchs, I. Flow cytometry in the diagnosis and follow up of human primary immunodeficiencies. Electronic Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory. 30 (4), 407 (2019).
  2. de Figueiredo, A. M., Glória, J. C., Chaves, Y. O., Neves, W. L. L., Mariúba, L. A. M. Diagnostic applications of microsphere-based flow cytometry: A review. Experimental Biology and Medicine. 247 (20), 1852-1861 (2022).
  3. Morgan, E., et al. Cytometric bead array: A multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clinical Immunology. 110 (3), 252-266 (2004).
  4. Graham, H., Chandler, D. J., Dunbar, S. A. The genesis and evolution of bead-based multiplexing. Methods. 158, 2-11 (2019).
  5. Kellar, K. Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays. Experimental Hematology. 30 (11), 1227-1237 (2002).
  6. Schade, R., et al. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): A review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine. ATLA Alternatives to Laboratory Animals. 33 (2), 129-154 (2005).
  7. Xu, Y., et al. Application of chicken egg yolk immunoglobulins in the control of terrestrial and aquatic animal diseases: A review. Biotechnology Advances. 29 (6), 860-868 (2011).
  8. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  9. Sousa, L. P., et al. A novel polyclonal antibody-based sandwich ELISA for detection of Plasmodium vivax developed from two lactate dehydrogenase protein segments. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 49 (2014).
  10. Klimentzou, P., et al. Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly immunogenic polypeptide prothymosin alpha. Peptides. 27 (1), 183-193 (2006).
  11. Redwan, E. M., Aljadawi, A. A., Uversky, V. N. Simple and efficient protocol for immunoglobulin Y purification from chicken egg yolk. Poultry Science. 100 (3), 100956 (2021).
  12. Lee, H. Y., Abeyrathne, E. D. N. S., Choi, I., Suh, J. W., Ahn, D. U. K. Sequential separation of immunoglobulin Y and phosvitin from chicken egg yolk without using organic solvents. Poultry Science. 93 (10), 2668-2677 (2014).
  13. Pauly, D., Chacana, P., Calzado, E., Brembs, B., Schade, R. IgY Technology: Extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation. Journal of Visualized Experiments. (51), e3084 (2011).
  14. Chang, H. M., Lu, T. C., Chen, C. C., Tu, Y. Y., Hwang, J. Y. Isolation of immunoglobulin from egg yolk by anionic polysaccharides. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48 (4), 995-999 (2000).
  15. Ko, K. Y., Ahn, D. U. Preparation of immunoglobulin Y from egg yolk using ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography. Poultry Science. 86 (2), 400-407 (2007).
  16. Polson, A. Isolation of IgY from the yolks of eggs by a chloroform polyethylene glycol procedure. Immunological Communications. 19 (3), 253-258 (1990).
  17. Simonova, M. A., et al. xMAP-based analysis of three most prevalent staphylococcal toxins in Staphylococcus aureus cultures. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (25), 6447-6452 (2014).
  18. Sharma, P., et al. A multiplex assay for detection of staphylococcal and streptococcal exotoxins. PLoS One. 10 (8), e0135986 (2015).
  19. Merbah, M., et al. Standardization of a cytometric p24-capture bead-assay for the detection of main HIV-subtypes. Journal of Virological Methods. 230, 45-52 (2016).

Play Video

Cite This Article
Corrêa Glória, J., Oliveira Chaves, Y., Marques de Figueiredo, A., Coutinho de Souza, C., Duarte da Silva, E. R., Lopes Batista, J. C., Nogueira, P. A., Morais Mariúba, L. A. Standardization of a Cytometric Bead Assay Based on Egg-Yolk Antibodies. J. Vis. Exp. (195), e65123, doi:10.3791/65123 (2023).

View Video