マルチウェル微小電極アレイにおけるヒト in vitro 神経培養の集束超音波ニューロモジュレーション

要約すると、HiPS細胞から培養したニューロンを使用してin vitro FUSニューロモデュレーションモニタリングを可能にするプロトコルを提示します。HiPS細胞誘導ニューロンを刺激し、それに対応する電気的応答を記録して解析するためのシステム全体のプラットフォームを 図1に示します。本研究では、 図2に示すように、ニューロンのFUS刺激とMEAシステムにおける電気的応答の記録に焦点を当てています。FUSおよびMEAシステムの周辺部品とその接続を 図3に示します。 焦点の特性評価は、ニューロン実験の前に行われ、ウェルの底がFUS焦点で完全に覆われていることを確認します。図4に示すように、サーモクロミックシート上の焦点の可視化は、FUSシステムを評価するために実行する必要があります。焦点スポットの特性評価に続いて、フィルタリング、閾値処理、発火率の計算などの後処理ステップを実行する必要があり、これらを図5と図6にまとめます。これらのステップは、環境からノイズをフィルタリングして有用な信号を取得し、FUSによって引き起こされるニューロン活動の変化に関する洞察を得るために不可欠です。図6A-Bのラスタープロットは、各チャンネルで検出されたスパイクを示しています。ウェルの底全体がFUSトランスデューサの焦点内にあるため、FUSはすべての電極の発火率を変更することが期待されます。この発火率の変化は、図6Cに示す発火率プロットで視覚化されており、選択された刺激パラメータがニューロンの発火率の増加をもたらしたことを示しています。具体的には、FUS前(ベースライン)の発火率は140Hz±116.7Hzであったのに対し、FUS後の発火率は連続波FUSで786Hz±419.4Hzであった。さらに、図6Cは、FUSパラメータを変更する(例えば、連続波の代わりにパルス波FUSを使用する)ことで、発火率の変化の大きさが変わり、ニューロンがベースライン状態に戻るまでの時間が変化することを示しています。低強度焦点式超音波(LIFU)は、特に熱病変を達成することを目的とした高強度焦点式超音波と比較した場合、培養物の著しい温暖化を引き起こさない。臨床的に影響のある温度変化がないことは、理論計算とシミュレーションによって裏付けられています(補足図2)。表1にリストされている実験的FUSパラメータの極端なケースでも、約0.04°Cの最小限の温度上昇しか観察できませんでした。 発火率プロットの使用により、FUSの神経調節効果の定量化が可能になり、興奮性応答と抑制性応答を区別するために使用できます。マルチウェルMEAプレートの大きな利点は、さまざまなニューロンの状態や刺激パラメータをハイスループットで研究するために複数回再利用できることです。 図1:ウェル内のニューロンの集束超音波(FUS)ニューロモデュレーションと、微小電極アレイを使用したニューロン活動の測定のための in vitro プラットフォームの概要。 各電極(赤、緑、青の線)は、1つのウェル内のニューロンの集団から記録します。処理パイプラインは、生のニューロンの電気的記録をニューロンの発火パターンの検出に変換するために実装されます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図2:マルチウェル微小電極アレイ(MEA)によるFUSニューロモデュレーション。 (A)マルチウェルMEAによるFUSニューロモデュレーションのセットアップの概略図。FUSトランスデューサによって生成された音波は、脱気水で満たされたFUSコーンを伝搬し、超音波ゲルを使用して結合されます。パラフィルムは輪ゴムでウェルに固定され、コンタミネーションを防止します。MEAプレートは、ニューロンからMEAシステムに電気的記録を送信します。(B)MEAシステムに含まれるマルチウェルプレート上のFUSトランスデューサの写真。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図3: In vitro プラットフォームのセットアップ。 (A) in vitro プラットフォームセットアップの前面。トランスデューサの電力出力(TPO、左)は、FUSパラメータのプログラムに使用されます。MEAシステム(右)は、FUSトランスデューサによってニューロモジュレートされたウェルプレート内のニューロンからの電気的活動を記録します。(B)マッチングネットワーク(1)からTPOへ、および(2)トランスデューサへの接続を備えた in vitro プラットフォームセットアップの背面。(3)MEAシステムからTPOへの接続により、データ収集が同期されます。(4)データ転送のためのMEAシステムからコンピューターへの接続。(5)MEAシステムへの電源接続。(6)FUSシステムへの電源接続。(7)超音波処理ボタン。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図4:FUSトランスデューサの特性評価。 (a)振幅システム15によって測定された表1に詳述されたFUSパラメータを用いた焦点の圧力マップ。(B)図3に示す実験セットアップを使用して、ウェルの底に置かれたサーモクロミックシートの超音波処理前および超音波処理後。サーモクロミックシートは温度変化に反応して色が変化するため、ニューロンの位置で刺激が成功したことを視覚的に確認することができます。30W/cm2の最大空間ピークパルス平均強度(ISPPA)および3分間の連続超音波処理を調整して、局所温度を大幅に変化させ、そのような焦点をよりよく視覚化した。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図5:処理パイプライン ステップ1:生の電気録音は、N = 16チャンネルからキャプチャされます。以降の手順では、チャネル 16 (赤で囲まれた部分) を使用したプロセスを示します。ステップ2:各チャンネルにバターワースバンドパスフィルタ(5 Hz〜3 kHzバンドパス)を適用し、その後にガウスフィルタ(σ = 3)を適用します。閾値は、超音波処理の開始を中心とする2秒のウィンドウ内の信号の標準偏差の5倍として設定される。ステップ3:スレッショルドを上回ったり下回ったりする信号は、スパイクとして特徴付けられます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図6:ラスターと発火率のプロット。 (A)超音波処理時間の関数として各チャネルで検出されたスパイクのラスタープロット。FUS刺激の時間は、赤い線で注釈が付けられています。(B)比較のために、異なるFUS設定の下でのニューロンのラスタープロット。(C)発火速度は、50msのスライディングウィンドウを使用して計算しました。FUSニューロモデュレーション前と後の平均発火率は、それぞれ140Hzと786Hzでした。パルスFUSでは、平均発火速度は230Hzと540Hzでした。活性化が短く、速度変化が少ないことが、この一連のさまざまなFUS刺激によって誘発されることが観察されました。発火率を計算するプロセスは、 補足図1に詳述されています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 パラメーター 価値 最大出力/チャンネル 1.200ワット P実際 0.749 W /チャネル。 私はSPPAの 10.79 W/cm2 私はSPTAの 0.05 W/cm2 バースト長(Burst Length) 0.100ミリ秒 周波数 250.00 kHzの 焦点 39.800ミリメートル 時代 20.000ミリ秒 タイマー 60.000秒 表1: 図4に示す研究のためにTPOに設定された集束超音波(FUS)パラメータ。 補足図1:ラスタープロットから発火率への処理。 ステップ1:すべてのチャネルのスパイクをカウントして、特定のスライディングウィンドウ内のカウント数を取得します。注: ここでは、説明しやすいように、より大きなスライディング ウィンドウ(0.1 秒に設定)を選択しました。ステップ2:ウィンドウ長あたりのスパイクを毎秒のスパイクに変換します(たとえば、ここでは、カウントに10を掛けてヘルツ[Hz]に変換し、次に1,000で割ってキロヘルツ[kHz]単位の値を取得します)。ステップ3:結果として取得された発火率曲線。オープンソースのツールキットとサンプルデータは、GitHub(https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod)で入手できます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足図2:LIFU16のK波シミュレーション結果温度プロファイル。図4に示した音響インテンシティマップに基づき、表1に挙げた実験的FUSパラメータの極端なケースを用いて、K波シミュレーションの結果は、焦点ゾーン(半径:2mm)の中心領域内で最大0.04°Cの温度上昇を示唆しています。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。