التعديل العصبي بالموجات فوق الصوتية المركزة للثقافات العصبية البشرية في المختبر في صفائف الأقطاب الكهربائية الدقيقة متعددة الآبار
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لاستخدام نظام عالي الإنتاجية يتيح مراقبة وقياس التأثيرات العصبية للموجات فوق الصوتية المركزة على الخلايا العصبية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (HiPSC).
Abstract
تم إثبات التأثيرات العصبية للموجات فوق الصوتية المركزة (FUS) في النماذج الحيوانية ، وتم استخدام FUS بنجاح لعلاج اضطرابات الحركة والنفسية لدى البشر. ومع ذلك ، على الرغم من نجاح FUS ، فإن الآلية الكامنة وراء آثاره على الخلايا العصبية لا تزال غير مفهومة بشكل جيد ، مما يجعل تحسين العلاج عن طريق ضبط معلمات FUS أمرا صعبا. لمعالجة هذه الفجوة في المعرفة ، درسنا الخلايا العصبية البشرية في المختبر باستخدام الخلايا العصبية المستزرعة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (HiPSCs). يسمح استخدام HiPSCs بدراسة السلوكيات العصبية الخاصة بالإنسان في كل من الحالات الفسيولوجية والمرضية. يقدم هذا التقرير بروتوكولا لاستخدام نظام عالي الإنتاجية يتيح مراقبة وقياس التأثيرات العصبية ل FUS على الخلايا العصبية HiPSC. من خلال تغيير معلمات FUS والتلاعب بالخلايا العصبية HiPSC من خلال التعديلات الصيدلانية والجينية ، يمكن للباحثين تقييم الاستجابات العصبية وتوضيح التأثيرات العصبية ل FUS على الخلايا العصبية HiPSC. يمكن أن يكون لهذا البحث آثار كبيرة على تطوير علاجات آمنة وفعالة قائمة على FUS لمجموعة من الاضطرابات العصبية والنفسية.
Introduction
الموجات فوق الصوتية المركزة (FUS) هي طريقة تعديل عصبي واعدة تتيح التحفيز غير الباضع على أعماق السنتيمتر بدقة أقل منالمليمتر 1،2،3. على الرغم من نقاط القوة هذه ، فإن التأثير السريري ل FUS محدود ، ويرجع ذلك جزئيا إلى نقص المعرفة فيما يتعلق بآلية عمله. بدون أساس نظري متين ، يواجه الباحثون والأطباء صعوبات في تصميم العلاج لتلبية الاحتياجات المحددة للمرضى الفرديين في ظل ظروف مختلفة. تشير نظرية بارزة اقترحها Yoo et al.4 إلى أن القنوات الأيونية الحساسة ميكانيكيا هي المسؤولة عن تنشيط الخلايا العصبية. ومع ذلك ، فشلت هذه النظرية في تفسير تنشيط FUS في الخلايا العصبية في الدماغ البشري ، والتي تفتقر إلى هذه القنوات5. يحد هذا الغموض من استخدام FUS في العيادة ، لأنه يحول دون ضبط معلمات FUS لتحسين نتائج العلاج.
استخدمت الدراسات السابقة ذات الصلة مجموعة من الأساليب للتحقيق في الآليات الفسيولوجية التي تقوم عليها FUS وتحديد معلمات التحفيز المثلى. تتضمن الخطوة الحاسمة في هذه العملية مراقبة الاستجابات العصبية كتغذية مرتدة ، والتي يمكن تحقيقها من خلال الطرق التي تتضمن مراقبة البوابة الأيونية ، مثل التصوير بأيون الكالسيوم4 ، والتصوير البصري1 ، والتسجيل الفيزيولوجي الكهربي خارج الجسم الحي (على سبيل المثال ، تخطيط كهربية العضل6 أو الفيزيولوجيا الكهربية للأعصابالجلدية 7). ومع ذلك ، فإن معظم هذه الدراسات تستخدم الخلايا العصبية غير البشرية أو الأساليب في الجسم الحي ، والتي يمكن أن تقدم اختلافات إضافية بسبب الضوابط دون المستوى الأمثل. في المقابل ، فإن استخدام الأقطاب الكهربائية لقياس الإشارات العصبية في الخلايا العصبية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان في المختبر (HiPSC) يوفر قياسات أكثر حساسية وتحكما أكبر في البيئة التجريبية. في هذا العمل ، تم تطوير نظام في المختبر باستخدام صفائف الأقطاب الكهربائية الدقيقة (MEAs) لقياس الاستجابات الكهربائية للخلايا العصبية HiPSC بعد تحفيز FUS ، كما هو موضح في الشكل 1. يمكن هذا النظام الباحثين في المجتمع من مراقبة الاستجابات العصبية عند تغيير معلمات الموجات فوق الصوتية (على سبيل المثال ، التردد ، طول الانفجار ، الشدة). بالإضافة إلى ذلك ، يتيح هذا النظام مستوى عال من التحكم في الحساسية العصبية للمنبهات الفيزيائية (مثل درجة الحرارة والضغط والتجويف)8,9 ، حيث يمكن التلاعب بوظيفة القناة الأيونية للخلايا العصبية وراثيا وصيدلانيا (على سبيل المثال ، استخدام الجادولينيوم لتثبيط القنوات الأيونية)10،11،12. قد يساعد هذا التحكم على المستوى الجزيئي في توضيح الآليات الكامنة وراء التأثيرات العصبية ل FUS.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصف هذه المخطوطة طريقة جديدة يمكن استخدامها لتسجيل النشاط العصبي في HiPSCs أثناء التعديل العصبي FUS. هذا البروتوكول قابل للتعميم على مختلف محولات الطاقة FUS وأنظمة MEA. لتكرار النتائج التي لوحظت مع البروتوكول الموصوف ، يجب على الباحث التأكد من أن النقطة البؤرية لمحول الطاقة أكبر من مساحة قاع بئر MEA. علاوة على ذلك ، إذا تم استخدام خطوط خلايا عصبية مختلفة ، فيجب ضبط معلمات المرشح على استجابة التردد المتوقعة للخلايا داخل البئر. إذا تعذر تحقيق نتائج تمثيلية ، ينبغي للمرء أن ينظر في تعديل المعلمات المذكورة أعلاه (على سبيل المثال ، طول الانفجار ، والشدة ، ودورة العمل ، وما إلى ذلك).
على الرغم من أن هذا العمل أظهر زيادة في معدل إطلاق النار بعد تحفيز FUS ، يجب جمع المزيد من البيانات لإثبات تكرار هذه النتيجة قبل استخلاص أي استنتاجات. يرث هذا البروتوكول قيود أنظمة MEA ، والتي عادة ما يكون لها نقاط ضعف ناجمة عن تسجيل إشارة تيار القطب الدقيق المباشر. على الرغم من أن الاتصال المباشر مع الخلايا العصبية يوفر حساسية أفضل ، إلا أنه قد يغير الخلية ويؤثر على دقة القياس. علاوة على ذلك ، نظرا لصغر حجم الآبار ، لا يشتمل نظامنا على الأنسجة المحيطية ، والتي قد تلعب أيضا دورا في التعديل العصبي17. قد يحد هذا من إمكانية تطبيق الاستنتاجات المستخلصة من هذا الإعداد على البيئات في الجسم الحي . لدراسة استجابات الشبكة الأكثر تعقيدا ، يجب تصميم نظام MEA عالي الكثافة لتحسين حساسيته18. تم تحديد العديد من الاتجاهات المستقبلية لهذا النظام المقترح ، بما في ذلك استخدام جسر 3D لعقد محول الطاقة وضمان وضع دقيق19. يمكن إجراء تحسينات إضافية فيما يتعلق بخوارزمية ما بعد المعالجة ، بما في ذلك استخدام خوارزمية فرز الارتفاع20 لتصنيف الخلايا العصبية الفردية. ستكون هذه العملية مفيدة لفك تشابك استجابات الخلايا العصبية متعددة الوحدات في الدراسات المستقبلية حول آليات FUS. الأهم من ذلك ، من الضروري دمج طرق إضافية للتحفيز ، مثل المحفزات الكيميائية والكهربائية والبصرية ، لتوضيح الآليات الأساسية. يمكن لهذه الطرق تغيير الخصائص والسلوكيات العصبية ، مثل تثبيط قنوات أيونية معينة15 أو تعديل خصائص الغشاء21. من خلال تعديل العوامل الرئيسية داخل مسار الإشارات المفترض ، يمكن للباحثين تحديد مساهمات كل عامل في البيئات الخاضعة للرقابة ، وفي النهاية ، إلقاء الضوء على التفاعلات المعقدة في اللعب.
يعد التحفيز الكهربائي22 أحد أكثر التقنيات رسوخا للتعديل العصبي ، مع تاريخ طويل من التطبيقات الناجحة في الإعدادات السريرية والبحثية. في المقابل ، FUS وعلم البصرياتالوراثي 23 هي طرائق جديدة نسبيا اكتسبت الاهتمام في السنوات الأخيرة. تتمثل المزايا الرئيسية ل FUS في عدم غزوها وقدرتها على تحفيز الخلايا العصبية في أعماق قد يصعب الوصول إليها باستخدام تقنيات أخرى ، بما في ذلك التحفيز الكهربائي وعلم البصريات الوراثي. ومع ذلك ، مثل علم البصرياتالوراثي 24 ، فإن FUS لديها بعض القيود المتعلقة بنمذجة انتشار الموجة والاستجابات العصبية المرتبطة بها. قد يكون التقاط تعقيد الخصائص الصوتية غير المتجانسة للأنسجة في الجسم الحي أمرا صعبا ، مما يؤدي إلى عدم اليقين في مجال الضغط ، وبالتالي في الاستجابات العصبية. تمثل هذه الصعوبة في نمذجة هذه الخصائص بدقة تحديا عند تحسين التقنية لتطبيقات محددة في العالم الحقيقي. تؤكد التعقيدات المتأصلة على أهمية الأنظمة في المختبر مثل تلك الموجودة في هذه الدراسة ، لأنها تمكن من الدراسة المباشرة للاستجابات في ظل ظروف الكثافة الصوتية الخاضعة للرقابة.
في الختام ، يوفر هذا النظام منصة عالية الإنتاجية في المختبر لدراسة التأثيرات العصبية المعدلة ل FUS على الخلايا العصبية البشرية. مع هذا النظام ، يمكن استكشاف آليات عمل FUS عن طريق قياس الاستجابات الكهربائية من الخلايا العصبية البشرية عند تعرضها لمستويات وأنواع مختلفة من التحفيز في بيئة خاضعة للرقابة. لذلك ، فإنه يوفر أداة تكميلية قيمة للنماذج البشرية والحيوانية الشائعة الاستخدام في هذا المجال.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أمير مانباشي ونيتيش ثاكور يعترفان بدعم التمويل من وكالة مشاريع البحوث الدفاعية المتقدمة ، DARPA ، عقد الترسية: N660012024075. بالإضافة إلى ذلك ، يقر أمير منباشي بدعم التمويل من برنامج علماء الأبحاث السريرية (KL2) التابع لمعهد جونز هوبكنز للبحوث السريرية والانتقالية (ICTR) ، والذي يديره المركز الوطني لتطوير العلوم الانتقالية (NCATS) ، المعاهد الوطنية للصحة (NIH). يقر Nitish Thakor بدعم التمويل من المعاهد الوطنية للصحة (NIH): R01 HL139158-01A1 و R01 HL071568-15.
Materials
| MEA System | Axion Biosystem Inc. | Maestro Edge | Sampling Rate: 11500 Hz |
| MEA Plate | Axion Biosystem Inc. | CytoView MEA | Electrode and Well: 16 electrodes in 24 wells |
| Well plate Interface | Amcor Inc. | Parafilm PM996; P7793 | Thickness: 127 µm |
| CO2 Tank and Regulator for culture | AirGas Inc./ Harris Inc. | 9296NC | Concentration: 5% |
| Culture Media | ThermoFisher Inc. | Laminin; 23017-015 | Concentration: 1 µg/mL |
| HiPSC Neurons | Peprotech | CIPS and GM01582 Derived; 450-10 | Concentration: 10 ng/mL (Refer Taga et al [2021]13) |
| Transducer | Sonic Concepts Inc. | CTX250; 008 | Center Frequency: 250 kHz |
| Matching Network | Sonic Concepts Inc. | CTX250; NFS102v2 | Impedance: 50 Ω |
| Transducer Power Output (TPO) | Sonic Concepts Inc. | Version 4.1; 020 | Frequency: From 250 kHz to 2.5 MHz |
| Membrane | McMaster Inc. | Silicone Rubber; 5542N115 | Thickness: 0.0127 cm |
| Coupling Gel | Parker Laboratory Inc. | Aquasonic 100; B08DDWG GXB | Viscosity: 130,000–185,000 cops |
| Connection to Probe holder | McMaster Inc. | Steal Threaded Rod; 90322A661 | Length: 1–1/2" Long |
| Centrifuge | ThermoFisher Inc. | Sorvall Legend X1R; 75004261 | Max acceleration: 10–25,830 x g |
| Hydrophone | Sonic Concepts Inc. | Y-104; 009 | Range: 50 kHz–1.9 MHz |
| Water Tank | Sonic Concepts Inc. | WT | Size: 30 cm x 30 cm x 30 cm |
| Water Conditioning Unit | Sonic Concepts Inc. | WCU; SN006 | Flow Velocity: 50 mL/s maximum |
| Oscilloscope | Rohde-Schwarz Inc. | RTC1002 | Sampling rate: Up to 50 MHz |
| Stage | Sonic Concepts Inc. | MicroStage; 2 | Accuracy: 1 µm |
| Thermochromic sheet | TIPTEMP Inc. | Liquid Crystal Sheet; TLCSEN337 | Range: 22–24 °C |
| Computer | Microsoft Surface | Surface Pro | CPU i5 1035G4: 3.7 GHz |
| Data Transfer Software | Mathworks Inc. | MATLAB | Version 2021b |
| Processing Software | Python Software Foundation | Python | Version 3.7.10 |
References
- Kamimura, H. A. S., Conti, A., Toschi, N., Konofagou, E. E. Ultrasound neuromodulation: Mechanisms and the potential of multimodal stimulation for neuronal function assessment. Frontiers in Physics. 8, 150 (2020).
- Manbachi, A., Kempski, K. M., Curry, E. J. . The Abundant Promise of Ultrasound in Neurosurgery: A Broad Overview and Thoughts on Ethical Paths to Realizing Its Benefits. , (2022).
- . Handbook for Clinical Ultrasound.Beginner’s Guide to Fundamental Physics & Medical Ultrasound Applications. Audible Available from: https://www.audible.com/pd/Handbook-for-Clinical-Ultrasound-Audiobook/B0983XJY83 (2021)
- Yoo, S., Mittelstein, D. R., Hurt, R. C., Lacroix, J., Shapiro, M. G. Focused ultrasound excites cortical neurons via mechanosensitive calcium accumulation and ion channel amplification. Nature Communications. 13 (1), 493 (2022).
- Szczot, M., Nickolls, A. R., Lam, R. M., Chesler, A. T. The form and function of PIEZO2. Annual Review of Biochemistry. 90, 507-534 (2021).
- Kim, H., et al. Miniature ultrasound ring array transducers for transcranial ultrasound neuromodulation of freely-moving small animals. Brain Stimulation: Basic, Translational, and Clinical Research in Neuromodulation. 12 (2), 251-255 (2019).
- Hoffman, B. U., et al. Focused ultrasound excites action potentials in mammalian peripheral neurons in part through the mechanically gated ion channel PIEZO2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (21), e2115821119 (2022).
- Tyler, W. J. The mechanobiology of brain function. Nature Reviews Neuroscience. 13 (12), 867-878 (2012).
- Collins, M. N., Legon, W., Mesce, K. A. The inhibitory thermal effects of focused ultrasound on an identified, single motoneuron. eNeuro. 8 (2), (2021).
- Chalfie, M. Neurosensory mechanotransduction. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (1), 44-52 (2009).
- Launay, P., et al. TRPM4 Is a Ca2+-activated nonselective cation channel mediating cell membrane depolarization. Cell. 109 (3), 397-407 (2002).
- Cain, S. M., Snutch, T. P. Contributions of T-type calcium channel isoforms to neuronal firing. Channels. 4 (6), 475-482 (2010).
- Taga, A., et al. Establishment of an electrophysiological platform for modeling ALS with regionally-specific human pluripotent stem cell-derived astrocytes and neurons. Journal of Visualized Experiments. (174), e62726 (2021).
- Taga, A., et al. Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multielectrode array system. Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).
- Manuel, T. J., et al. Ultrasound neuromodulation depends on pulse repetition frequency and can modulate inhibitory effects of TTX. Scientific Reports. 10 (1), 15347 (2020).
- Treeby, B. E., Cox, B. T. k-wave: Matlab toolbox for the simulation and reconstruction of photoacoustic wave fields. J. Biomed. Opt. 15 (2), 021314 (2010).
- Akhtar, K., et al. Noninvasive peripheral focused ultrasound neuromodulation of the celiac plexus ameliorates symptoms in a rat model of inflammatory bowel disease. Experimental Physiology. 106 (4), 1038-1060 (2021).
- Smirnova, L., et al. Organoid intelligence (OI): The new frontier in biocomputing and intelligence-in-a-dish. Frontiers in Science. 1, 1017235 (2023).
- Saccher, M., et al. Focused ultrasound neuromodulation on a multi-well MEA. Bioelectronic Medicine. 8 (1), 2 (2022).
- Yger, P., et al. A spike sorting toolbox for up to thousands of electrodes validated with ground truth recordings in vitro and in vivo. eLife. 7, e34518 (2018).
- Babakhanian, M., et al. Effects of low intensity focused ultrasound on liposomes containing channel proteins. Scientific Reports. 8, 17250 (2018).
- Liang, R., et al. Designing an Accurate Benchtop Characterization Device: An acoustic measurement platform for localizing and implementing therapeutic ultrasound devices and equipment (amplitude). 2022 Design of Medical Devices Conference. , (2022).
- Ko, H., Yoon, S. -. P. Optogenetic neuromodulation with gamma oscillation as a new strategy for Alzheimer disease: A narrative review. Journal of Yeungnam Medical Science. 39 (4), 269-277 (2022).
- White, M., Mackay, M., Whittaker, R. G. Taking optogenetics into the human brain: Opportunities and challenges in clinical trial design. Open Access Journal of Clinical Trials. 2020, 33-41 (2020).
