C57BL/6J 마우스의 중심삭증후군 모델 확립

실험은 산동대학교 치루 의과대학 실험동물윤리복지위원회(승인번호: 22021)의 승인을 받았다. 이들은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)에서 발행한 실험동물의 관리 및 사용 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)(NIH Publications No. 85-23, revised 1996)에 따라 수행되었다. 본 연구에 사용된 모든 마우스는 Jinan Pengyue Experimental Animal Company(중국 지난)에서 구입한 9-10주 된 암컷 C57BL/6J 마우스였습니다. 이 연구에 참여한 총 9마리의 마우스는 대조군, 경증 및 중증 그룹에 동등하게 무작위 배정되었습니다. 부상 후 7일, 28일, 70일이 지났을 때, 각 그룹에서 한 마리의 쥐가 희생되었다. 1. C6 후궁 절제술 및 척수 노출 알림: 노출은 현미경으로 수행되었습니다. 출혈은 두 가지 측면에 주의를 기울임으로써 피할 수 있다: (i) 모든 혈관은 피해야 한다. (ii) 근육은 근육의 원점과 종점에서 분리되어야 합니다. 수술 기구와 SCICP를 준비합니다.참고: SCICP의 구조는 이전 연구11에서 보고되었습니다. 선행 연구와 다른 점은 본 프로토콜이 압박에 의한 척수 손상을 달성한다는 것이다. 이 플랫폼의 두 가지 무게(10.4g 및 20.8g)는 각각 5g/mm2 및 10g/mm2의 압축을 생성할 수 있습니다(그림 1). 척수 노출 및 압박 단계는 그림 2에 나와 있습니다. 노즈콘을 이용한 흡입으로 마우스에 이소플루란을 투여한다(유도: 3%-5%, 유지: 1.5%-2%). 마취가 효과를 발휘한 후 쥐의 목 뒤 정중선에 있는 작은 돌출부를 탐색하는데, 이는 두 번째 흉추(T2)의 가시 돌기입니다. 이 부풀어 오른 부분 주위의 머리카락을 면도하십시오. 요오드포 용액을 세 번 번갈아 바른 다음 피부 소독제 75% 에탄올을 번갈아 가며 피부를 소독합니다. 마우스를 수술대에 엎드려 놓습니다. 눈을 보호하기 위해 눈 연고를 바르십시오. 흉부 아래에 3-4mm 두께의 패드를 깔아 경추 곡선이 아치형이 되도록 하여 수술 중 층간 공간과 기도가 막히지 않도록 합니다. 수술 전 진통제로 부프레노르핀을 주사합니다(0.05-0.1mg/kg, SQ). 1-1.5cm의 세로로 절개하여 제2 흉추 가시돌기를 중심으로 멸균 메스를 사용하여 근막층을 노출시킵니다(그림 2A). 멸균 마이크로 가위로 T2 위의 지방 조직 일부를 제거하여 T2 가시 돌기를 찾습니다. 마이크로 가위로 정중선을 따라 C5-T2에서 양측 승모근과 능형근을 분리합니다(그림 2B). 마이크로 가위로 C5-T2 척추 라미나의 근육을 분리하고 멸균 마이크로 견인기를 사용하여 근육층을 측면으로 후퇴시킵니다(그림 2C). 척추 표면의 다열근과 경추 척추 근육을 자릅니다. 가시돌기의 가장 높은 지점에 따라 T2를 찾습니다. C6을 찾기 위해 T2에서 rostral end를 향해 가시 돌기를 연속적으로 조사합니다(그림 3). 집게로 C6 라미나를 들어 올리고 라미나를 잘라내면 척수가 노출됩니다(그림 2D). 2. 경추 척수 압박 손상 척추 안정기로 C6-7 패싯 조인트를 고정하고 잠급니다(그림 2E). 멸균 웨이트 팁을 노출된 척수를 향하게 하고 팁의 평평한 바닥이 척수의 등쪽 표면과 평행하게 위치하도록 합니다(그림 2F). 무게가 척수를 압박하도록 소매를 조정합니다. 체중이 척수와 일정한 상대 위치를 유지하면 조정을 중지합니다(그림 2G).알림: 무게가 척수에 타박상을 가하는 경우 이 과정을 너무 격렬하거나 빠르게 만들지 마십시오. 5분 압축 후 추와 척추 안정기를 제거합니다. 현미경으로 압박 후 척수의 색상 변화를 관찰합니다(그림 2H). 멸균 PBS로 헹구고 석션을 사용하여 작업 부위를 청소합니다. 폴리프로필렌 비흡수성 봉합사(크기: 6-0)를 사용하여 근육과 피부를 층으로 봉합합니다. 수술 부위를 소독하고 마우스가 완전한 의식을 회복할 때까지 따뜻한 패드에 마우스를 놓은 다음 마우스를 마우스 케이지에 다시 넣습니다. 진통을 위해 부프레노르핀(0.05-0.1mg/kg, SQ)을 3일 동안 8-12시간마다 주사합니다. 3. 조직학적 분석 부상 후 7일, 28일 또는 70일에 1.25% 트리브로모에탄올(체중 0.02mL/g)을 복강 내 주사하여 마우스를 마취합니다. 마우스에 60mL의 인산염 완충 식염수(PBS)와 20mL의 4% 파라포름알데히드를 심혈관 경전으로 주입합니다11. 척수를 병변 중심에서 0.5cm 떨어진 양쪽에서 마이크로 가위로 절제하고 1cm 길이의 부분을 보존합니다. 보존된 척수 절편을 4°C에서 48시간 동안 30% 자당에 담그십시오. OCT로 조직을 삽입하고 냉동체로 조직을 6μm 두께로 절단한 다음 유리 슬라이드에 절편을 수집합니다. 헤마톡실린 및 에오신 염색6μm 절편을 1x PBS로 5분 동안 3회 헹구어 잔류 OCT를 제거합니다. 섹션을 헤마톡실린에 90초 동안 담그십시오. 흐르는 물에 3분 동안 섹션을 씻습니다. 섹션을 4분 동안 eosin에 담그십시오. 과도한 에오신을 제거하기 위해 95% 알코올에 30초 동안 담그십시오. 마지막으로 슬라이드를 알코올(95% 알코올 및 100% 알코올 2회, 연속)로 30초 동안 탈수하고 슬라이드를 크실렌 욕조에 넣어 2분 동안 청소합니다. 그런 다음 커버 유리와 수지 젤로 섹션을 밀봉합니다. 프러시안 블루 염색페로시아나이드칼륨(20%)과 염산(10%)을 균등하게 섞은 슬라이드를 10분 동안 담그십시오. 증류수로 3번 헹구고 Nuclear Fast Red로 5분 동안 카운터 스테인합니다. 증류수로 세 번 헹군 다음 95% 알코올로 한 번 헹구고 100% 알코올로 5분 동안 두 번 헹굽니다. 크실렌 부분을 각각 3분 동안 두 번 청소한 다음 수지 젤12로 밀봉합니다. 면역형광 염색37 °C에서 1 시간 동안 다음과 같은 1 차 항체로 슬라이드를 배양합니다 : 토끼 항 이온화 칼슘 결합 어댑터 분자 1 (Iba-1) (1 : 500), 신경 손상 후 미세 아교세포에서 상향 조절되었습니다. 중추 신경계의 성상교세포에서 발현되는 마우스 항신경교세포(GFAP)(1:300); 토끼 항 신경 필라멘트 -200 (NF-200) (1 : 2000), 신경 필라멘트로 발현됩니다. 실온(RT)에서 1시간 동안 2차 항체로 배양: Alexa Fluor488 goat anti-mouse 및 Alexa Fluor594 goat anti-rabbit (1:1,000). 사진을 찍고 형광 현미경으로 추가 분석13. 4. 자기공명영상(MRI) 미니 마스크를 통해 투여된 이소플루란 마취(1%-2% 이소플루란, 20%-30%O2)로 부상 후 7일에 마우스를 마취합니다. 시상 방향으로 경추 척수를 스캔합니다. MRI 이미징에는 TR/TE = 2500/12ms, 시야(FOV)에 대한 획득 매트릭스 = 256 x 128 매트릭스 = 12 x 8mm2, 슬라이스 두께 = 1mm, 여기 수(NEX) = 2인 멀티슬라이스 및 인터리브 방식의 스핀 에코(SE) 시퀀스 설정을 사용합니다.알림: 호흡 관련 이미지 아티팩트를 제거하기 위해 스캔하는 동안 마우스의 호흡수를 10-15/min으로 유지하십시오14.