JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

C57BL/6J Farede Santral Kord Sendromu Modelinin Kurulması

Published: September 08, 2023
doi:
10.3791/65028
, ,
1Department of Orthopaedics,Qilu Hospital of Shandong University, 2Department of Orthopaedics,Tianjin Medical University General Hospital

Summary

Farelerde merkezi kord sendromunu (CCS) simüle eden mevcut protokol, tekrarlanabilirliği artırmış ve deney hayvanlarında operasyon hasarını en aza indirerek anatomik yapıyı aşırı derecede bozmaktan kaçınmıştır. Bu çalışmadaki strateji, tutarlı sonuçlar üreterek yaralanma mekanizmalarının araştırılmasına izin verdiği için avantajlıdır.

Abstract

Merkezi kord sendromunun (CCS) hayvan modelleri, klinik öncesi araştırmalara önemli ölçüde fayda sağlayabilir. Tanımlanabilir anatomik yollar, minimal invaziv maruziyet yaklaşımları sağlayabilir ve çalışma sırasında deney hayvanlarının ekstra yaralanmasını azaltabilir, deneylerin tekrarlanabilirliğini artırmak için bireyler arasındaki davranışsal ve histolojik farklılıkları en aza indirmek için deneyler sırasında tutarlı ve stabil anatomik morfolojinin korunmasını sağlar. Bu çalışmada, C6 seviyesindeki omurilik, omurilik yaralanması koaksiyel platformu (SCICP) kullanılarak ve minimal invaziv bir teknikle kombinasyon kullanılarak ortaya çıkarıldı. Bir vertebral stabilizatör yardımıyla, omurları sabitledik ve farklı derecelerde C6 omurilik yaralanmasını indüklemek için 5 g/mm2 ve 10 g/mm2 ağırlıklara sahip C57BL/6J farelerin omuriliklerini SCICP ile sıkıştırdık. CCS’nin önceki tanımına uygun olarak, sonuçlar, bu modeldeki lezyonun merkezi kord etrafındaki gri maddede yoğunlaştığını ve CCS hakkında daha fazla araştırma yapılmasını sağladığını ortaya koymaktadır. Son olarak, histolojik sonuçlar okuyucular için referans olarak sunulmaktadır.

Introduction

Son yıllarda, omurilik yaralanması (SCI) insidansının sürekli arttığına tanık olunmuştur ve yaşlılarda daha az şiddetli tauma1’den daha fazla yaralanma olmuştur. Bu yaralanmalar daha sık servikal omurgayı tutar ve daha sıklıkla eksik bir nörolojik disfonksiyona yol açar2.

Yirmi birinci yüzyılda, CCS, tüm SCI’nin yarısından fazlasını oluşturan en yaygın tamamlanmamış SCI türüdür. Konvansiyonel inkomplet SCI ile karşılaştırıldığında, CCS, üst ekstremitelerin alt ekstremitelere göre orantısız bir şekilde daha fazla bozulması ile karakterizedir3. Ağırlıklı olarak üst ekstremite güçsüzlüğü ve daha az belirgin duyu ve mesane disfonksiyonu ile karakterizedir. CCS’nin travma sonrası santral bölge kanaması ve ödeminden veya yakın zamanda önerildiği gibi spinal kanal darlığında omuriliğin basısına bağlı Wallerian dejenerasyonundan kaynaklandığı düşünülmektedir. CCS’nin yönetimi, patofizyolojisinin kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını gerektiren üst düzey kanıtlardan yoksundur4. Ancak, CCS modelleri rapor edilmemiştir. Klinik ve klinik öncesi çalışmalar için bir araştırma temeli sağlayabilen patofizyolojinin anlaşılması için uygun hayvan modellerigereklidir 5,6,7,8,9,10.

Bu çalışmada, omurilik yaralanması koaksiyel platformu (SCICP) ve CCS’nin daha fazla araştırılmasına ve anlaşılmasına olanak tanıyan minimal invaziv bir operasyon planı ile farelerde bir CCS modeli oluşturulmuştur. Modelin araştırma sürecinde histolojik, manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ve immünofloresan analizi ile geçerliliği kanıtlanmıştır.

Protocol

Deneyler, Shandong Üniversitesi Cheeloo Tıp Fakültesi Laboratuvar Hayvanları Etik ve Refah Komitesi tarafından onaylandı (onay numarası: 22021). Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzuna (NIH Yayınları No. 85-23, 1996’da revize edilmiştir) uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada kullanılan tüm fareler, Jinan Pengyue Deneysel Hayvan Şirketi’nden (Jinan, Çin) satın alınan 9-10 haftalık dişi C57BL / 6J farelerdi. Bu çalışmaya katılan toplam 9 fare, kontrol, hafif ve şiddetli gruplara eşit olarak randomize edildi. Yaralanmadan 7, 28 ve 70 gün sonra, her gruptan bir fare sakrifiye edildi. 1. C6 laminektomi ve omurilik maruziyeti NOT: Pozlama mikroskop altında gerçekleştirilmiştir. İki hususa dikkat edilerek kanama önlenebilir: (i) Tüm kan damarlarından kaçınılmalıdır. (ii) Kasların, kasın başlangıç ve bitiş noktalarında ayrılması gerekir. Cerrahi aletleri ve SCICP’yi hazırlayın.NOT: SCICP’nin yapısı önceki çalışma11’de bildirilmiştir. Önceki çalışmaya göre farkı, mevcut protokolün omurilik yaralanmasını kompresyon yoluyla gerçekleştirmesidir. Bu platformun iki farklı ağırlığı (10,4 g ve 20,8 g) sırasıyla 5 g/mm2 ve 10 g/mm2 sıkıştırma üretebilir (Şekil 1). Omuriliğe maruz kalma ve kompresyon adımları Şekil 2’de gösterilmiştir. İzofluranı bir burun konisi kullanarak inhalasyon yoluyla fareye uygulayın (indüksiyon:% 3 -% 5, bakım:% 1.5 -% 2). Anestezi etkisini gösterdikten sonra, ikinci torasik omurun (T2) dikenli süreci olan farelerin boynunun arkasındaki orta hatta küçük bir çıkıntı keşfedin. Bu çıkıntının etrafındaki saçları tıraş edin. Cildi, bir iyodofor çözeltisinin üç alternatif uygulamasıyla dezenfekte edin, ardından cilt antiseptikleri% 75 etanol. Fareyi çalışma masasına yüzüstü yatırın. Gözleri korumak için göz merhemi sürün. Kemerli bir servikal omurga eğrisine izin vermek için göğsün altına 3-4 mm kalınlığında bir ped yerleştirin, bu da çalışma sırasında laminalar arası boşluğun ve engelsiz bir hava yolunun açığa çıkmasını kolaylaştırır. Ameliyat öncesi analjezi olarak buprenorfin enjekte edin (0.05-0.1 mg/kg, SQ). Fasyal tabakayı ortaya çıkarmak için 2. torasik vertebra spinöz işlemi merkezli steril bir neşter ile 1-1.5 cm uzunlamasına bir kesi yapın (Şekil 2A). T2 spinöz sürecini bulmak için steril mikro makasla T2’nin üzerindeki yağ dokusunun bir kısmını çıkarın. Bilateral trapez ve eşkenar dörtgen kasları orta hat boyunca C5-T2’den mikro makasla ayırın (Şekil 2B). C5-T2 omurlarının laminasındaki kaslar mikro makasla ayrılarak steril mikro ekartörlerle kas tabakası yanlara doğru geri çekilir (Şekil 2C). Omurların yüzeyindeki multifidus ve servikal omurga kaslarını kesin. T2’yi dikenli süreçlerin en yüksek noktasına göre yerleştirin. C6’yı bulmak için dikenli süreçleri T2’den rostral uca doğru art arda araştırın (Şekil 3). C6 laminasını forseps ile kaldırın, laminayı kesin ve omurilik açığa çıkar (Şekil 2D). 2. Servikal omurilik sıkışması yaralanması C6-7 faset eklemlerini vertebral stabilizatör ile sıkıştırın ve kilitleyin (Şekil 2E). Steril ağırlık ucunu açıkta kalan omuriliğe doğrultun ve ucun düz tabanının omuriliğin dorsal yüzeyine paralel olarak konumlandırıldığından emin olun (Şekil 2F). Ağırlığın omuriliği sıkıştırmasını sağlamak için manşonu ayarlayın. Ağırlık omurilik ile sabit bir göreceli pozisyon tuttuğunda ayarlamayı bırakın (Şekil 2G).NOT: Ağırlığın omuriliğe kontüzyon kuvveti uygulaması durumunda bu işlemi çok şiddetli veya hızlı yapmayın. 5 dakikalık bir sıkıştırmadan sonra ağırlığı ve vertebral stabilizatörü çıkarın. Mikroskop altında kompresyon sonrası omuriliğin renk değişikliklerini gözlemleyin (Şekil 2H). Steril PBS ile durulayın ve çalışma bölgesini temizlemek için emme kullanın. Polipropilen emilmeyen sütür kullanarak kasları ve cildi katmanlar halinde dikin (boyut: 6-0). Cerrahi alanı dezenfekte edin, fare bilincini tam olarak yerine getirene kadar fareyi ılık bir ped üzerine yerleştirin ve ardından fareyi fare kafesine geri koyun. Analjezi için buprenorfin (0.05-0.1 mg / kg, SQ) 3 gün boyunca her 8-12 saatte bir enjekte edin. 3. Histolojik analiz Yaralanmadan sonraki 7, 28 veya 70. günlerde %1,25 tribromoetanol (0,02 mL/g vücut ağırlığı) intraperitoneal enjeksiyonu ile fareyi uyuşturun. Fareyi transkardiyal olarak 60 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ve 20 mL% 4 paraformaldehit11 ile infüze edin. Omuriliği lezyon merkezinden 0,5 cm uzaklıktan mikro makasla her iki taraftan kesin ve 1 cm uzunluğundaki bölümü koruyun. Korunmuş omurilik bölümünü 48 saat boyunca 4 ° C’de% 30 sükroz içine daldırın. Dokuları OCT ile gömün, dokuları bir kriyotom ile 6 μm kalınlığında bölümler halinde dilimleyin ve bölümleri bir cam slayt üzerinde toplayın. Hematoksilen ve eozin boyamaKalan OCT’yi çıkarmak için 6 μm’lik bölümleri 1x PBS ile 5 dakika 3 kez durulayın. Bölümleri 90 saniye boyunca hematoksilen içine daldırın. Bölümleri akan su altında 3 dakika yıkayın. Bölümleri 4 dakika boyunca eozin içine daldırın. Fazla eozini gidermek için 30 saniye boyunca alkolde bekletin. Son olarak, slaytları 30 saniye boyunca alkolle ( alkol ve 0 alkol art arda iki kez) kurutun ve slaytları 2 dakika boyunca temizlemek için bir ksilen banyosuna koyun. Ardından, bölümleri bir kapak camı ve reçine jeli ile kapatın. Prusya mavisi boyamaSlaytları 20 dakika boyunca eşit miktarda potasyum ferrosiyanür (% 10) ve hidroklorik asit (% 10) karışımına batırın. Damıtılmış su ile 3 kez durulayın ve Nuclear Fast Red ile 5 dakika boyunca lekeleyin. Damıtılmış su ile üç kez durulayın, ardından alkol ile bir durulama ve 5 dakika boyunca 0 alkol ile iki durulama yapın. Bölümleri her biri 3 dakika boyunca iki kez ksilen içinde temizleyin ve ardından reçine jeli12 ile kapatın. İmmünofloresan boyamaSlaytları 37 ° C’de 1 saat boyunca aşağıdaki birincil antikorlarla inkübe edin: tavşan anti-iyonize kalsiyum bağlayıcı adaptör molekülü 1 (Iba-1) (1:500), sinir hasarından sonra mikrogliada yukarı regüle edildi; merkezi sinir sistemindeki astrositlerde eksprese edilen fare anti-glial fibriler asidik protein (GFAP) (1:300); tavşan anti-nörofilament-200 (NF-200) (1:2000), nörofilamentte eksprese edilir. İkincil antikorlarla oda sıcaklığında (RT) 1 saat inkübe edin: Alexa Fluor488 keçi anti-fare ve Alexa Fluor594 keçi anti-tavşan (1: 1,000). Fotoğraf çekin ve bir floresan mikroskobu ile daha fazla analiz yapın13. 4. Manyetik rezonans görüntüleme Yaralanmadan 7 gün sonra fareyi mini bir maske ile uygulanan İzofluran anestezisi (% 1 -% 2 izofluran,% 20 -% 30 O2) ile uyuşturun. Servikal omuriliği sagital yönde tarayın. MRI görüntüleme için aşağıdaki ayarları kullanın: TR/TE = 2500/12 ms ile çok kesitli ve serpiştirilmiş şekilde spin-eko (SE) dizisi, elde etme matrisi = 256 x 128 görüş alanı üzerinde matris (FOV) = 12 x 8 mm2, dilim kalınlığı = 1 mm ve uyarma sayısı (NEX) = 2.NOT: Solunumla ilgili görüntü artefaktlarını ortadan kaldırmak için tarama sırasında farenin solunum hızını 10-15/dk’da tutun14.

Representative Results

Sagital HE bölümü, gri maddedeki hasarlı alanın şiddetli grupta daha geniş olmasına rağmen, beyaz madde üzerinde sürekliliğin mevcut olduğunu göstermektedir. Ek olarak, şiddetli ve hafif gruplar arasındaki hasarlı gri madde alanındaki fark, protokoldeki grup ayarının makullüğünü desteklemektedir (Şekil 4). Koronal HE kesitleri, lezyonun her iki grupta da esas olarak gri cevherde bulunduğunu göstermektedir. Şiddetli grupta, gri maddeyi çevreleyen beyaz cevherin yapısının etkilenme olasılığı daha yüksekti, ancak beyaz cevherin ana hatları hala korunuyordu (Şekil 5). NF-200 immünofloresansı, gri maddeyi çevreleyen beyaz maddenin şiddetli grupta etkilenmiş olmasına rağmen, beyaz maddenin hala nispeten sağlam olduğunu göstermektedir. Bu sonuçlar, önceki çalışma4’te CCS için açıklanan özelliklerle tutarlıdır (Şekil 6). Hafif veya şiddetli grupta yaralanmadan 7 gün sonra sagital HE bölümlerinde kırmızı kan hücresi bulunmadı. Prusya mavisi boyaması hafif grupta hemosideroz göstermedi, ancak şiddetli grupta görüldü. Bu sonuçlar, kanama indüksiyonunun nispeten ciddi derecede hasar gerektirebileceğini göstermektedir (Şekil 7). İmmünofloresan, hem hafif hem de şiddetli yaralanmada yüksek GFAP ve Iba-1 ekspresyonu alanlarını ortaya çıkardı, bu da inflamatuar bir yanıt ve lezyonda glial bir skar oluşumunu düşündürdü. Ayrıca, şiddetli grup, hafif gruba göre daha geniş bir lezyon alanı sergiledi (Şekil 8). MRG, omuriliği gözlemlemek için nispeten minimal invaziv bir yöntemdir. Sonuçlar, hem hafif hem de şiddetli gruplarda, yüksek sinyal taslağı ile lezyonda hipointens bir sinyal değişikliği olduğunu göstermektedir. Şiddetli grup, önemli ölçüde daha büyük bir hipointens sinyal alanı gösterdi (Şekil 9). Hipointens sinyal, bu bölgedeki retikülosit lizatından bir çökelti olduğunu düşündürür ve çevredeki hiperintens sinyal, inflamatuar bir yanıt olduğunu gösterir. Önceki çalışmamızda birkaç davranış testi yaptık. Örneğin, ön ayaklardaki kavrama kuvveti testi önemli bir fark ortaya koymaktadır15. Şekil 1: SCICP’nin manşonu ve ağırlıkları. Ucun yüzey alanı, C6 laminektomi sonrası ölçülen omuriliğin açıkta kalan alanına göre 1,3 mm x 1,6 mm olacak şekilde tasarlanmıştır. Ağırlık, manşonun iç duvarı ile ağırlık arasındaki sürtünmeyi etkili bir şekilde azaltan PTFE ile kaplanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Omuriliğin açığa çıkması ve sıkışması. (A) Derinin uzunlamasına insizyonu; (B) Kasları rostral olarak T2 spinöz süreçten ayırın; (C) Laminaların üzerindeki kasları ayırın; (D) C6 laminektomi; (E) Omur gövdesinin sabitlenmesi; (F) Sıkıştırma yerinin belirlenmesi; (G) Omuriliğin sıkışması; (H) Omurilik sıkışmasından sonra omuriliğin üzerindeki beyaz cevherde önemli bir hasar yoktur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Fare servikal iskelet anatomisi. Okla gösterilen bölge T2 dikenli süreçtir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Sagital HE boyalı kesitler. (A) Servikal omurilik sagital bölümü. (B,C) Şiddetli grup, Hafif gruptan daha ciddi hasara sahipti, ancak her ikisi de merkezi kordonun etrafındaki gri maddeye odaklandı. 7, 28 ve 70 dpi görüntüler, aynı yaralanma grubunda farklı dönemlerde yaralanma ifadesinde anlamlı bir fark olmadığını ve üst ve alt omurilikteki beyaz cevherin devamlılığının korunduğunu göstermektedir. Ölçek çubuğu: 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: Servikal omurilik yaralanması koronal HE boyalı kesitler. (A-C) Yaralanma, B ve C panellerinde görüldüğü gibi, öncelikle merkezi kordonu çevreleyen gri maddeyi etkiler. Ağır yaralanma grubu, beyaz maddeyi etkileme olasılığı daha yüksek olan hafif yaralanma grubundan daha geniş bir hasar aralığından muzdariptir. Ölçek çubuğu: 400 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 6: Yaralanma sonrası NF-200 koronal immünofloresan. Beyaz madde taslağında önemli bir fark olmayan NF-200 yanıtı. Ölçek çubuğu: 400 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 7: Prusya mavisi boyaması. (A-C) Hemosideroz şiddetli grupta gözlendi, ancak hafif grupta gözlenmedi. Ölçek çubuğu: 400 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 8: Yaralanma sonrası sagital GFAP ve Iba-1 immünofloresansı. (A-C) Yaralanma derecesi arttıkça GFAP ve Iba-1 yanıtının alanı artar. Ölçek çubuğu: 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 9: Servikal omurilik yaralanması sonrası sagital MRG (T2 ağırlıklı görüntüler). Yaralanma bölgesi, hafif ve ağır yaralanma gruplarında hipointens bir sinyal olarak gözlenirken, ağır yaralanma grubunda önemli ölçüde daha geniş bir hipointens sinyal alanı izlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Çok sayıda omurilik yaralanması türünden CCS, potansiyel olarak en tedavi edilebilir yaralanma türlerinden biridir 3,4. Laboratuvar araştırma modellerinin eksikliği nedeniyle, 1950’lerden itibaren CCS ile ilgili araştırmalar klinik çalışmalara ve kadavra diseksiyon incelemelerine odaklanmıştır 3,16,17. Bu çalışma, farelerin CCS modelini oluşturmak için uyumlu araçlar ve minimal invaziv prosedürler kullanıldığını göstermektedir. Teknik açıdan bakıldığında, bu platform güçlü çalışabilirliğe ve iyi tekrarlanabilirliğe sahiptir. Deney sonuçlarının geçerliliği gösterdiği göz önüne alındığında, tekniğimiz CCS4 için önceki çalışmaların tanımladığı standarda en yakın modeli belirleme tekniğimizdir.

Kompresyon yaralanması ile ilgili önceki çalışmalarda esas olarak anevrizma klipsleri, balonlar ve kalibre edilmiş forsepskullanılmıştır 9,10,18. Ayrıca, yaralanmaların çoğu torasik omurilik seviyesinde meydana geldi18. Bu çalışmada CCS’nin özelliklerini araştırmak için C6 seviyesindeki spinal kord yaralı segment olarak seçildi. CCS modelinin hayatta kalma oranının da deneysel tutarlılığın sağlanmasında önemli bir faktör olduğuna dikkat etmek önemlidir. Bu çalışma, fare servikal omuriliğinde bilateral kompresyon yaralanmasına neden olurken, yüksek seviyeli omurilik travmatik yaralanması, özellikle iki taraflı yaralanma, çok ciddiyse deney hayvanları için ölümcül olabilir. El-Bohy’ye göre, C4/5 omuriliğinin inen bulbospinal sistemi ve solunumla ilgili motonöronları etkileme olasılığı daha yüksektir, bu da deney hayvanlarını solunum depresyonuna ve ölüme götürür 18,19,20,21,22,23., Bu çalışmada, C6 servikal omurilik üzerinde farklı derecelerde kompresyona sahip fareler, aşağıdakiler tarafından önerilen yaralanma özelliklerini önemli ölçüde farklılaştırmıştır: histolojik testler. Forgione tarafından bildirilen fare servikal omurilik klempleme modelinde önemli davranışsal ve histolojik farklılıklar olmasına rağmen, modifiye klemplerle omuriliği klemplemek için pediküllerin, eklem işlemlerinin, laminaların ve hatta sinir köklerinin bozulması gerekiyordu ve bu da servikal yapıların stabilitesi üzerinde önemli bir etkiye sahipti24. Servikal yaralanmalarla ilgili bir başka çalışma, transvers işlemin bir fiksasyon bölgesi olarak kullanıldığını bildirmiştir5. Eklem süreçlerinin hasar görmesi önlense de, aşırı kas dokusu bozulması da aynı şekilde omuriliğin stabilitesi üzerinde bir etkiye yol açabilir. Bu çalışmada, servikal omuriliğin stabilitesini korumak için sadece 6. servikal lamina rezeke edildi, komşu eklemler korundu ve aşırı kas hasarı önlendi. Aynı zamanda omuriliğin üstünden yapılan kompresyon sinir köklerinin zarar görmesini engeller.

HE sonuçları, her gruptaki farelerin servikal omuriliğine verilen hasar alanının, esas olarak, farklı gruplar arasındaki yaralanma kapsamında önemli farklılıklar gösteren, CCS’yi karakterize eden merkezi kordun yakınındaki gri maddede olduğunu göstermektedir. Özellikle, gösterdiğimiz patolojik kesitler, numuneler yaralanmadan birkaç gün sonra toplandığı için yaralanma tezahürünü hafifletmiş olabilir. İmmünofloresan (NF-200), omuriliğin beyaz cevher bölgesindeki nöral yollara daha az hasar gösterdi ve bu da CCS’deki hasarın esas olarak merkezi kord çevresinde yoğunlaştığını doğruladı. İmmünofloresan sonucu, patolojinin önceki histolojik sonuçlarıyla birleşti. Önceki çalışmalar, CCS’nin merkezi kord yakınında ödemlere yol açtığını, hematoma ve nihayetinde lateral kortikospinal sistemin medial kısmında işlev bozukluğuna yol açtığını göstermiştir3. Kanama, CCS’nin tipik bir bileşeni olarak bildirilmiştir, ancak sonraki görüntüleme ve otopsi çalışmalarında nadiren görülür17. Bu çalışmada, yaralanmadan 7 gün sonra elde edilen HE sonuçları tüm gruplarda doku ödemi bulguları olduğunu düşündürdü; Bununla birlikte, yaralanma bölgesinde artık kırmızı kan hücresi bulunamadı. Bu nedenle, kanama için yaralanma bölgesini incelemek için Prusya mavisi kullanıldı ve sonuçlar, yaralanmadan 7 gün sonra ağır yaralanma grubunun yaralanma bölgesinde gözlenen hemosideroz ile karşılık gelirken, hafif grup bunu yapmadı. MRG T2 görüntüleri, hem hafif hem de ağır yaralanmaların, yaralanmadan 7 gün sonra yaralanmanın hasarlı bölgesinde düşük sinyal alanlarına sahip olduğunu gösterdi. burada retikülosit lizat birikimini gösterir. Bu sonuçlar, daha önce bildirilen bulgular arasındaki tutarsızlığın, yaralanmanın ciddiyetine ek olarak, yaralanma alanındaki kanama miktarını da etkileyebilecek MRI testinin histolojik testten14 potansiyel olarak daha hassas olmasından kaynaklandığına dair ikinci dereceden kanıtlar sağlar. GFAP, hasarlı bölgede de kapsamlı bir şekilde ifade edildi. Aynı zamanda, sağlam alanlarda Iba-1 ekspresyonu da görüldü, bu da lezyondaki hipointens sinyal alanı etrafındaki bir hiperintens sinyal halkasının bir inflamatuar yanıtın varlığını düşündürdüğü MRI sonuçlarıyla tutarlı bir inflamatuar yanıtın kalıcılığını düşündürdü. Sonuç olarak, bu çalışmanın sonuçlarına dayanarak, modeldeki yaralanma alanı, genellikle daha önce bildirilen açıklamalarla tutarlı olan merkezi kordon etrafındaki gri maddeye odaklanmıştır13. Ne yazık ki, yaralanma bölgesinin zamanla dinamik olarak nasıl değiştiğini göstermek için her deney hayvanında tekrar tekrar MRI yapmadık. Gelecekteki araştırmacılar, CCS’yi daha iyi araştırmak için bunu çalışmalarına dahil edebilirler. Ayrıca, gri maddeyi tanımlayan NeuN gibi nöronal belirteçlerle immünoetiketleme çalışmaya dahil edilebilir.

Sonuç olarak, patoloji ve MRG taramalarındaki bulguların özellikleri, önceki çalışmalarda CCS için tanımlananlarla yakın benzerlikler göstermektedir4. Mevcut protokol, CCS’yi uygulanabilir bir şekilde modellemek, CCS’nin daha fazla araştırılmasını ve anlaşılmasını sağlar.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Kök Hücre ve Dönüşüm Araştırmaları Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Projesi (2019YFA0112100) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Devlet Anahtar Programı (81930070) tarafından desteklenmiştir.

Materials

4% fixative solution Solarbio P1110 4%
Anti-Neurofilament heavy polypeptide antibody Abcam ab8135 Dilution ratio (1:2000)
Eosin Staining Solution (water soluble) Biosharp BL727B
Ethanol Fuyu Reagent
Fluorescent microscope KEYENCE BZ-X800
Frozen Slicer Leica
GFAP (GA5) Mouse mAb  Cell Signaling TECHNOLOGY #3670 Dilution ratio (1:600)
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 ThermoFisher SCIENTIFIC A32723TR Dilution ratio (1:1000)
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 ThermoFisher SCIENTIFIC A32740 Dilution ratio (1:1000)
Hematoxylin Staining Solution Biosharp BL702A
Mice Jinan Pengyue Experimental AnimalCompany  C57BL/6J 
Microsurgery apparatus  Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd All the surgey instruments are custom-made Ophthalmic scissors, micro mosquito forceps, microsurgery forceps, micro scissors
Normal sheep serum for blocking (working solution) Zhong Shan Jin Qiao ZLI-9022 working solution
O.C.T. Compound SAKURA 4583
Phosphate buffered solution (PBS)  Solarbio P1020 pH 7.2–7.4
Prussian Blue Iron Stain Kit (With Eosin) Solarbio G1424
RWD Laboratory inhalation anesthetic station RWD Life Science Co., Ltd R550
Small animal in vivo microCT imaging system PerkinElmer  Quantum GX2
Spinal cord injury coaxial platform Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd Custom-made(Feng's standard) https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~
1~b0yRFKOq&alg_id=
0&slg=tagGoodList-default%2COpBottom%2Cuuid%
2CabTraceId&components_
style_layout
=1&reft=1659409105184&spm=
g.930111970_f.81386274&alias=
367x5ovgn69q18g&from_uuid=
1362cc46-ffe0-6886-2c65-01903
dbacbba&sf=qq_sm&is_share=
1&shopAutoEnter=1&share_cmpt
=native_wechat&is_silence_auth=1
Surgery microscope  Zumax Medical Co., Ltd. zumax, OMS2355
Tris Buffered Saline+Tween (TBST) Solarbio T1082 Dilution ratio (1:19)
Xylene Fuyu Reagent
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, C., et al. Survival in 222 Patients With Severe CSCI: An 8-Year Epidemiologic Survey in Western China. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 100 (10), 1872-1880 (2019).
  2. Qi, C., Xia, H., Miao, D., Wang, X., Li, Z. The influence of timing of surgery in the outcome of spinal cord injury without radiographic abnormality (SCIWORA). Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15 (1), 223 (2020).
  3. Brooks, N. P. Central cord syndrome. Neurosurgery Clinics of North America. 28 (1), 41-47 (2017).
  4. Avila, M. J., Hurlbert, R. J. Central cord syndrome redefined. Neurosurgery Clinics of North America. 32 (3), 353-363 (2021).
  5. Forgione, N., Chamankhah, M., Fehlings, M. G. A mouse model of bilateral cervical contusion-compression spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (6), 1227-1239 (2017).
  6. López-Dolado, E., Lucas-Osma, A. M., Collazos-Castro, J. E. Dynamic motor compensations with permanent, focal loss of forelimb force after cervical spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 30 (3), 191-210 (2013).
  7. Allen, L. L., et al. Phrenic motor neuron survival below cervical spinal cord hemisection. Experimental Neurology. 346, 113832 (2021).
  8. Reinhardt, D. R., Stehlik, K. E., Satkunendrarajah, K., Kroner, A. Bilateral cervical contusion spinal cord injury: A mouse model to evaluate sensorimotor function. Experimental Neurology. 331, 113381 (2020).
  9. Ropper, A. E., Ropper, A. H. Acute spinal cord compression. The New England Journal of Medicine. 376 (14), 1358-1369 (2017).
  10. Sun, G. D., et al. A progressive compression model of thoracic spinal cord injury in mice: function assessment and pathological changes in spinal cord. Neural Regeneration Research. 12 (8), 1365-1374 (2017).
  11. Elzat, E. Y., et al. Establishing a mouse contusion spinal cord injury model based on a minimally invasive technique. Journal of Visualized Experiments. (187), 64538 (2022).
  12. Lu, J., Xu, F., Lu, H. LncRNA PVT1 regulates ferroptosis through miR-214-mediated TFR1 and p53. Life Sciences. 260, 118305 (2020).
  13. Zeng, H., et al. Lentivirus-mediated downregulation of α-synuclein reduces neuroinflammation and promotes functional recovery in rats with spinal cord injury. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 283 (2019).
  14. Bilgen, M., Al-Hafez, B., Berman, N. E., Festoff, B. W. Magnetic resonance imaging of mouse spinal cord. Magnetic Resonance in Medicine. 54 (5), 1226-1231 (2005).
  15. Yilihamu, E. E., et al. A novel mouse model of central cord syndrome. Neural Regeneration Research. 18 (12), 2751-2756 (2023).
  16. Chikuda, H., et al. Effect of early vs delayed surgical treatment on motor recovery in incomplete cervical spinal cord injury with preexisting cervical stenosis: A randomized clinical trial. JAMA Network Open. 4 (11), e2133604 (2021).
  17. Jimenez, O., Marcillo, A., Levi, A. D. A histopathological analysis of the human cervical spinal cord in patients with acute traumatic central cord syndrome. Spinal Cord. 38 (9), 532-537 (2000).
  18. Menezes, K., et al. Human mesenchymal stromal/stem cells recruit resident pericytes and induce blood vessels maturation to repair experimental spinal cord injury in rats. Scientific Reports. 10 (1), 19604 (2020).
  19. Hutson, T. H., Di Giovanni, S. The translational landscape in spinal cord injury: focus on neuroplasticity and regeneration. Nature Reviews. Neurology. 15 (12), 732-745 (2019).
  20. El-Bohy, A. A., Schrimsher, G. W., Reier, P. J., Goshgarian, H. G. Quantitative assessment of respiratory function following contusion injury of the cervical spinal cord. Experimental Neurology. 150 (1), 143-152 (1998).
  21. El-Bohy, A. A., Goshgarian, H. G. The use of single phrenic axon recordings to assess diaphragm recovery after cervical spinal cord injury. Experimental Neurology. 156 (1), 172-179 (1999).
  22. Gonzalez-Rothi, E. J., Lee, K. Z. Intermittent hypoxia and respiratory recovery in preclinical rodent models of incomplete cervical spinal cord injury. Experimental Neurology. 342, 113751 (2021).
  23. Locke, K. C., Randelman, M. L., Hoh, D. J., Zholudeva, L. V., Lane, M. A. Respiratory plasticity following spinal cord injury: perspectives from mouse to man. Neural Regeneration Research. 17 (10), 2141-2148 (2022).
  24. Forgione, N., et al. Bilateral contusion-compression model of incomplete traumatic cervical spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 31 (21), 1776-1788 (2014).

Tags

Central Cord SyndromeAnimal ModelC57BL/6J MouseSpinal Cord InjurySurgical ProcedureVertebraSpinal CordLaminaLaminectomyVertebral Stabilizer

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Yilizati-Yilihamu Elzat, E., Fan, X., Feng, S. Establishment of Central Cord Syndrome Model in C57BL/6J Mouse. J. Vis. Exp. (199), e65028, doi:10.3791/65028 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image