Das vorliegende Protokoll, das das zentrale Rückenschnursyndrom (CCS) bei Mäusen simuliert, hat die Wiederholbarkeit verbessert und die Operationsschäden der Versuchstiere minimiert, wodurch eine übermäßige Störung der anatomischen Struktur vermieden wurde. Die Strategie in dieser Studie ist vorteilhaft, da sie die Erforschung von Verletzungsmechanismen ermöglicht, indem sie konsistente Ergebnisse liefert.
Tiermodelle des Zentralschnursyndroms (CCS) könnten der präklinischen Forschung einen erheblichen Nutzen bringen. Identifizierbare anatomische Pfade können minimalinvasive Expositionsansätze ermöglichen und zusätzliche Verletzungen von Versuchstieren während des Betriebs reduzieren, wodurch die Aufrechterhaltung einer konsistenten und stabilen anatomischen Morphologie während der Experimente ermöglicht wird, um Verhaltens- und histologische Unterschiede zwischen Individuen zu minimieren und die Reproduzierbarkeit von Experimenten zu verbessern. In dieser Studie wurde das Rückenmark auf C6-Ebene mit einer koaxialen Plattform für Rückenmarksverletzungen (SCICP) und einer Kombination mit einer minimal-invasiven Technik exponiert. Mit Hilfe eines Wirbelstabilisators fixierten wir die Wirbel und komprimierten das Rückenmark von C57BL/6J-Mäusen mit 5 g/mm2 und 10 g/mm2 Gewichten mit SCICP, um eine C6-Rückenmarksverletzung unterschiedlichen Grades zu induzieren. In Übereinstimmung mit der vorherigen Beschreibung von CCS zeigen die Ergebnisse, dass die Läsion in diesem Modell in der grauen Substanz um den zentralen Strang konzentriert ist, was weitere Forschungen zu CCS ermöglicht. Abschließend werden histologische Ergebnisse als Referenz für die Leser zur Verfügung gestellt.
In den letzten Jahren ist die Inzidenz von Rückenmarksverletzungen (SCI) stetig gestiegen, wobei mehr Verletzungen bei älteren Menschen durch weniger heftiges Taumaauftreten 1. Diese Verletzungen betreffen häufiger die Halswirbelsäule und führen häufiger zu einer inkompletten neurologischen Dysfunktion2.
Im 21. Jahrhundert ist CCS die am weitesten verbreitete Form der inkompletten Rückenmarksverletzung und macht mehr als die Hälfte aller Querschnittlähmungen aus. Im Vergleich zur konventionellen inkompletten Rückenmarksverletzung ist CCS durch eine unverhältnismäßig stärkere Beeinträchtigung der oberen als der unteren Extremitäten gekennzeichnet3. Sie ist gekennzeichnet durch eine vorwiegende Schwäche der oberen Extremitäten mit weniger signifikanten sensorischen und Blasenfunktionsstörungen. Es wird angenommen, dass CCS durch posttraumatische Blutungen und Ödeme in der Zentralregion verursacht wird oder, wie kürzlich vorgeschlagen, durch Wallersche Degeneration durch Kompression des Rückenmarks bei Spinalkanalstenose. Für die Behandlung von CCS fehlt es an Evidenz auf hohem Niveau, was ein umfassendes Verständnis der Pathophysiologie erfordert4. Es wurden jedoch keine Modelle von CCS berichtet. Für das Verständnis der Pathophysiologie sind geeignete Tiermodelle unerlässlich, die eine Forschungsgrundlage für klinische und präklinische Studien bieten können 5,6,7,8,9,10.
In dieser Studie wird ein CCS-Modell in Mäusen mit einer koaxialen Plattform für Rückenmarksverletzungen (SCICP) und einem minimal-invasiven Operationsplan etabliert, der die weitere Erforschung und das Verständnis von CCS ermöglicht. Das Modell wird im Laufe des Forschungsprozesses durch histologische, Magnetresonanztomographie (MRT) und Immunfluoreszenzanalyse valide gemacht.
Von den zahlreichen Arten von Rückenmarksverletzungen ist CCS eine der potenziell am besten behandelbaren Verletzungsarten 3,4. Aufgrund des Mangels an Laborforschungsmodellen konzentrierte sich die CCS-Forschung ab den 1950er Jahren auf klinische Studien und Leichenpräparationsuntersuchungen 3,16,17. Die vorliegende Studie zeigt, wie kompatible Werkzeuge und minimalinvasive Verfahren verwendet werden, um das CCS-Modell von Mäusen zu etablieren. Aus technischer Sicht verfügt diese Plattform über eine starke Bedienbarkeit und gute Reproduzierbarkeit. Angesichts der Tatsache, dass die Ergebnisse des Experiments die Validität belegen, ist unsere Technik zur Etablierung des Modells, das dem Standard, den frühere Studien für CCS4 definiert haben, am nächsten kommt.
In früheren Studien zu Kompressionsverletzungen wurden hauptsächlich Aneurysma-Clips, Ballons und kalibrierte Pinzetten verwendet 9,10,18. Darüber hinaus traten die meisten Verletzungen auf der Ebene des thorakalen Rückenmarksauf 18. Das Rückenmark auf C6-Ebene wurde in dieser Studie als verletztes Segment ausgewählt, um die Charakteristika von CCS zu untersuchen. Es ist erwähnenswert, dass die Überlebensrate des CCS-Modells auch ein wesentlicher Faktor für die Gewährleistung der experimentellen Konsistenz ist. Die vorliegende Studie berichtet von einer bilateralen Kompressionsverletzung des zervikalen Rückenmarks der Maus, während eine traumatische Verletzung des Rückenmarks auf hohem Niveau, insbesondere bilaterale Verletzungen, für Versuchstiere tödlich sein kann, wenn sie zu schwerwiegend ist. Laut El-Bothy ist es wahrscheinlicher, dass das C4/5-Rückenmark den absteigenden bulbospinalen Trakt und die respiratorischen Motoneuronen beeinflusst, was bei Versuchstieren zu Atemdepression und Tod führt 18,19,20,21,22,23., In dieser Studie wiesen Mäuse mit unterschiedlichen Kompressionsgraden am zervikalen Rückenmark C6 signifikant differenzierte Verletzungsmerkmale auf, die auf histologische Untersuchungen. Obwohl es signifikante Verhaltens- und histologische Unterschiede in dem von Forgione berichteten Modell der zervikalen Rückenmarksklemmung der Maus gab, war eine Störung der Pedikel, der Gelenkfortsätze, der Lamina und sogar der Nervenwurzeln erforderlich, um das Rückenmark mit den modifizierten Klemmen zu klemmen, was einen signifikanten Einfluss auf die Stabilität der zervikalen Strukturen hatte24. Eine weitere Studie über zervikale Verletzungen berichtete über die Verwendung des Querfortsatzes als Fixationsstelle5. Auch wenn die Gelenkfortsätze nicht geschädigt werden konnten, konnte ein übermuskulärer Gewebeabbau ebenfalls zu einer Beeinträchtigung der Stabilität des Rückenmarks führen. In der vorliegenden Studie wurde nur die 6. zervikale Lamina reseziert, um die Stabilität des zervikalen Rückenmarks zu erhalten, wobei die angrenzenden Gelenke erhalten blieben und übermäßige Muskelschäden vermieden wurden. Gleichzeitig verhindert die Kompression von oberhalb des Rückenmarks eine Schädigung der Nervenwurzeln.
Die HE-Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Bereich der Schädigung des zervikalen Rückenmarks der Mäuse in jeder Gruppe hauptsächlich in der grauen Substanz in der Nähe des zentralen Rückenmarks lag, was CCS charakterisierte, mit signifikanten Unterschieden im Umfang der Verletzung zwischen den verschiedenen Gruppen. Bemerkenswert ist, dass die pathologischen Schnitte, die wir zeigten, die Manifestation der Verletzung gelindert haben könnten, da die Proben einige Tage nach der Verletzung entnommen wurden. Die Immunfluoreszenz (NF-200) zeigte eine geringere Schädigung der Nervenbahnen in der Region der weißen Substanz des Rückenmarks, was auch bestätigte, dass sich die Schädigung bei CCS hauptsächlich auf das zentrale Rückenmark konzentrierte. Das Immunfluoreszenzergebnis wurde durch frühere histologische Ergebnisse der Pathologie verstärkt. Frühere Studien haben gezeigt, dass CCS zu Ödemen in der Nähe des zentralen Rückenmarks führt, die zu Hämatomen und schließlich zu Funktionsstörungen im medialen Teil des lateralen kortikospinalen Trakts führen3. Blutungen wurden als typische Komponente des CCS beschrieben, werden aber in nachfolgenden Bildgebungs- und Autopsiestudien selten beobachtet17. In dieser Studie deuteten die HE-Ergebnisse 7 Tage nach der Verletzung auf Anzeichen eines Gewebeödems in allen Gruppen hin; Es wurden jedoch keine verbleibenden roten Blutkörperchen im Verletzungsbereich gefunden. Daher wurde Preußischblau verwendet, um den Verletzungsbereich auf Blutungen zu untersuchen, und die Ergebnisse entsprachen der Hämosiderose, die im Verletzungsbereich der Gruppe mit schweren Verletzungen 7 Tage nach der Verletzung beobachtet wurde, während dies in der Gruppe mit leichten Verletzungen nicht der Fall war. MRT-T2-Bilder zeigten, dass sowohl leichte als auch schwere Verletzungen 7 Tage nach der Verletzung niedrige Signalbereiche im geschädigten Bereich der Verletzung aufwiesen. Dies deutet hier auf die Ablagerung von Retikulozytenlysat hin. Diese Ergebnisse liefern Indizien dafür, dass die Diskrepanz zwischen den zuvor berichteten Befunden wahrscheinlich darauf zurückzuführen ist, dass der MRT-Test potenziell sensitiver ist als der histologische Test14, zusätzlich zur Schwere der Verletzung, die auch das Ausmaß der Blutung im Verletzungsbereich beeinflussen kann. GFAP wurde auch im geschädigten Bereich großflächig exprimiert. Gleichzeitig wurde die Iba-1-Expression auch in intakten Bereichen beobachtet, was auf die Persistenz einer Entzündungsreaktion hindeutet, die mit den MRT-Ergebnissen übereinstimmt, wobei ein Ring aus hyperintensen Signalen um den hypointensen Signalbereich in der Läsion auf das Vorhandensein einer Entzündungsreaktion hindeutet. Basierend auf den Ergebnissen der vorliegenden Studie wurde der Verletzungsbereich im Modell auf die graue Substanz um den zentralen Strang konzentriert, was im Allgemeinen mit den zuvor berichteten Beschreibungen übereinstimmt13. Leider haben wir nicht bei jedem Versuchstier eine MRT wiederholt durchgeführt, um zu zeigen, wie sich die Verletzungsstelle mit der Zeit dynamisch verändert. Zukünftige Forscher können dies in ihre Arbeit einbeziehen, um CCS besser zu untersuchen. Auch die Immunmarkierung mit neuronalen Markern wie NeuN, die die graue Substanz definieren, kann in die Studie einbezogen werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Charakteristika der Befunde in der Pathologie und in MRT-Scans große Ähnlichkeiten mit denen aufweisen, die in früheren Studien für CCS beschrieben wurden4. Das vorliegende Protokoll, das CCS modelliert, ermöglicht die weitere Erforschung und das Verständnis von CCS.
The authors have nothing to disclose.
Diese Studie wurde vom National Key Research and Development Project of Stem Cell and Transformation Research (2019YFA0112100) und dem State Key Program of National Natural Science of China (81930070) unterstützt.
4% fixative solution | Solarbio | P1110 | 4% |
Anti-Neurofilament heavy polypeptide antibody | Abcam | ab8135 | Dilution ratio (1:2000) |
Eosin Staining Solution (water soluble) | Biosharp | BL727B | |
Ethanol | Fuyu Reagent | ||
Fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X800 | |
Frozen Slicer | Leica | ||
GFAP (GA5) Mouse mAb | Cell Signaling TECHNOLOGY | #3670 | Dilution ratio (1:600) |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32723TR | Dilution ratio (1:1000) |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32740 | Dilution ratio (1:1000) |
Hematoxylin Staining Solution | Biosharp | BL702A | |
Mice | Jinan Pengyue Experimental AnimalCompany | C57BL/6J | |
Microsurgery apparatus | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | All the surgey instruments are custom-made | Ophthalmic scissors, micro mosquito forceps, microsurgery forceps, micro scissors |
Normal sheep serum for blocking (working solution) | Zhong Shan Jin Qiao | ZLI-9022 | working solution |
O.C.T. Compound | SAKURA | 4583 | |
Phosphate buffered solution (PBS) | Solarbio | P1020 | pH 7.2–7.4 |
Prussian Blue Iron Stain Kit (With Eosin) | Solarbio | G1424 | |
RWD Laboratory inhalation anesthetic station | RWD Life Science Co., Ltd | R550 | |
Small animal in vivo microCT imaging system | PerkinElmer | Quantum GX2 | |
Spinal cord injury coaxial platform | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | Custom-made(Feng's standard) | https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~ 1~b0yRFKOq&alg_id= 0&slg=tagGoodList-default%2COpBottom%2Cuuid% 2CabTraceId&components_ style_layout =1&reft=1659409105184&spm= g.930111970_f.81386274&alias= 367x5ovgn69q18g&from_uuid= 1362cc46-ffe0-6886-2c65-01903 dbacbba&sf=qq_sm&is_share= 1&shopAutoEnter=1&share_cmpt =native_wechat&is_silence_auth=1 |
Surgery microscope | Zumax Medical Co., Ltd. | zumax, OMS2355 | |
Tris Buffered Saline+Tween (TBST) | Solarbio | T1082 | Dilution ratio (1:19) |
Xylene | Fuyu Reagent |