O presente protocolo simulando a síndrome da medula central (SCC) em camundongos melhorou a repetibilidade e minimizou os danos operacionais aos animais experimentais, evitando a ruptura excessiva da estrutura anatômica. A estratégia deste estudo é vantajosa, pois permite a pesquisa dos mecanismos de lesão ao produzir resultados consistentes.
Modelos animais de síndrome da medula central (SCC) poderiam beneficiar substancialmente a pesquisa pré-clínica. Vias anatômicas identificáveis podem fornecer abordagens de exposição minimamente invasivas e reduzir lesões extras em animais experimentais durante a operação, permitindo a manutenção de uma morfologia anatômica consistente e estável durante os experimentos para minimizar as diferenças comportamentais e histológicas entre os indivíduos para melhorar a reprodutibilidade dos experimentos. Neste estudo, a medula espinhal nível C6 foi exposta usando uma plataforma coaxial de lesão medular (SCICP) e combinada com uma técnica minimamente invasiva. Com o auxílio de um estabilizador vertebral, fixamos as vértebras e comprimimos a medula espinhal de camundongos C57BL/6J com pesos de 5 g/mm2 e 10 g/mm2 com SCICP para induzir diferentes graus de lesão medular C6. Em consonância com a descrição anterior do SCC, os resultados revelam que a lesão neste modelo está concentrada na substância cinzenta ao redor do cordão central, possibilitando novas pesquisas sobre o SCC. Finalmente, os resultados histológicos são fornecidos como referência para os leitores.
Nos últimos anos, tem-se assistido a um aumento constante da incidência de lesão medular (LM), com mais lesões em idosos de tauma menos violenta1. Essas lesões acometem mais frequentemente a coluna cervical e mais frequentemente levam a uma disfunção neurológicaincompleta2.
No século XXI, o SCC é o tipo mais prevalente de LM incompleta, correspondendo a mais da metade de toda a LME. Em comparação com a LM incompleta convencional, a SCC é caracterizada por um comprometimento desproporcionalmente maior dos membros superiores do queinferiores3. Caracteriza-se por fraqueza predominantemente dos membros superiores, com disfunção sensitiva e vesical menos significativa. Acredita-se que a SCC seja causada por hemorragia e edema pós-traumático da região central ou, como proposto recentemente, por degeneração walleriana por compressão da medula espinhal na estenose do canal vertebral. O manejo da SCC carece de evidências de alto nível para orientar, o que requer uma compreensão abrangente de sua fisiopatologia4. No entanto, modelos de SCC não foram relatados. Modelos animais adequados são essenciais para o entendimento da fisiopatologia, o que pode fornecer uma base de pesquisa para estudos clínicos e pré-clínicos5,6,7,8,9,10.
Neste estudo, um modelo de SCC em camundongos é estabelecido com uma plataforma coaxial de lesão medular (SCICP) e um plano de operação minimamente invasivo, o que permite novas pesquisas e compreensão do SCC. O modelo é comprovado como válido no decorrer do processo de pesquisa por análise histológica, ressonância magnética (RM) e imunofluorescência.
Dos inúmeros tipos de lesão medular, o SCC é um dos tipos de lesão mais potencialmente tratáveis 3,4. Devido à falta de modelos de pesquisa laboratorial, as pesquisas sobre SCC a partir da década de 1950 concentraram-se em estudos clínicos e investigações de dissecção cadavérica 3,16,17. O presente estudo mostra o uso de ferramentas compatíveis e procedimentos minimamente invasivos para estabelecer o modelo de CCS em camundongos. Do ponto de vista técnico, esta plataforma tem forte operacionalidade e boa reprodutibilidade. Dado que os resultados do experimento demonstram a validade, nossa técnica para estabelecer o modelo mais próximo do padrão que estudos anteriores definiram para o CCS4.
Estudos prévios de lesão por compressão empregaram principalmente clipes de aneurisma, balões e pinças calibradas 9,10,18. Além disso, a maioria das lesões ocorreu ao nível da medulatorácica18. A medula espinhal no nível de C6 foi escolhida como segmento lesado neste estudo para investigar as características do SCC. Vale a atenção que a taxa de sobrevivência do modelo CCS também é um fator essencial para garantir a consistência experimental. O presente estudo relata causar lesão por compressão bilateral na medula cervical de camundongos, enquanto lesão traumática medular de alto nível, especialmente lesão bilateral, pode ser fatal para animais de experimento se muito grave. Segundo El-Bohy, a medula espinhal C4/5 tem maior probabilidade de afetar o trato bulboespinhal descendente e os motoneurônios relacionados à respiração, o que leva os animais de experimento à depressão respiratória e à morte 18,19,20,21,22,23., Neste estudo, camundongos com diferentes graus de compressão sobre a medula espinhal cervical C6 apresentam características de lesão significativamente diferenciadas sugeridas por testes histológicos. Embora houvesse diferenças comportamentais e histológicas significativas no modelo de pinçamento medular cervical de camundongos relatado por Forgione, a ruptura dos pedículos, processos articulares, lâminas e até raízes nervosas foi necessária para pinçar a medula espinhal com as pinças modificadas, o que teve uma influência significativa na estabilidade das estruturas cervicais24. Outro estudo de lesões cervicais relatou a utilização do processo transverso como local de fixação5. Embora os processos articulares tenham sido impedidos de danos, a ruptura do tecido muscular excessivo também poderia levar a um impacto na estabilidade da medula espinhal. No presente estudo, apenas a6ª lâmina cervical foi ressecada para manter a estabilidade da medula cervical, com as articulações adjacentes preservadas e dano muscular excessivo evitado. Ao mesmo tempo, a compressão de cima da medula espinhal evita danos às raízes nervosas.
Os resultados de HE sugerem que a área de dano à medula cervical dos camundongos em cada grupo foi principalmente na substância cinzenta próxima à medula central, o que caracterizou o SCC, com diferenças significativas na abrangência da lesão entre os diferentes grupos. Notavelmente, os cortes patológicos que exibimos podem ter aliviado a manifestação da lesão, pois os espécimes foram coletados alguns dias após a lesão. A imunofluorescência (NF-200) mostrou menor dano ao trato neural na região da substância branca da medula espinhal, o que também confirmou que o dano no SCC estava concentrado principalmente ao redor da medula central. O resultado da imunofluorescência foi agravado por resultados histológicos prévios da patologia. Estudos prévios demonstraram que o SCC leva ao edema próximo à medula central, levando a hematoma e, finalmente, disfunção na porção medial do trato corticoespinhal lateral3. A hemorragia tem sido relatada como um componente típico do SCC, mas raramente é vista em estudos subsequentes de imagem e autópsia17. Neste estudo, os resultados de HE aos 7 dias pós-lesão sugeriram sinais de edema tecidual em todos os grupos; entretanto, não foram encontradas hemácias residuais na área da lesão. Portanto, o azul da Prússia foi usado para examinar a área da lesão para hemorragia, e os resultados corresponderam à hemossiderose observada na área de lesão do grupo lesão grave aos 7 dias pós-lesão, enquanto o grupo leve não. indicando a deposição de lisado de reticulócitos aqui. Esses resultados fornecem evidências circunstanciais de que a discrepância entre os achados relatados anteriormente deve-se, provavelmente, ao fato de o exame de RM ser potencialmente mais sensível que o examehistológico14, além da gravidade da lesão, que também pode influenciar na quantidade de hemorragia na área da lesão. GFAP também foi expressa extensivamente na área danificada. Ao mesmo tempo, a expressão de Iba-1 também foi observada em áreas íntegras, sugerindo a persistência de uma resposta inflamatória, consistente com os resultados da RM, onde um anel de hipersinal ao redor da área de hiposinal na lesão sugere a presença de uma resposta inflamatória. Em última análise, com base nos resultados do presente estudo, a área de lesão no modelo foi focada na substância cinzenta ao redor do cordão central, o que geralmente é consistente com as descrições relatadasanteriormente13. Infelizmente, não realizamos RM repetidamente em todos os animais do experimento para mostrar como o local da lesão muda dinamicamente com o tempo. Futuros pesquisadores podem incluir isso em seus trabalhos para uma melhor investigação sobre CCS. Além disso, a imunomarcação com marcadores neuronais como NeuN, que definem a substância cinzenta, pode ser incluída no estudo.
Em conclusão, as características dos achados em exames anatomopatológicos e de RM têm estreita semelhança com as descritas para SCC em estudosprévios4. O presente protocolo de modelagem viável do CCS possibilita novas pesquisas e entendimento do CCS.
The authors have nothing to disclose.
Este estudo foi apoiado pelo Projeto Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento de Células-Tronco e Pesquisa de Transformação (2019YFA0112100) e pelo Programa de Chave Estadual de Ciência Natural Nacional da China (81930070).
4% fixative solution | Solarbio | P1110 | 4% |
Anti-Neurofilament heavy polypeptide antibody | Abcam | ab8135 | Dilution ratio (1:2000) |
Eosin Staining Solution (water soluble) | Biosharp | BL727B | |
Ethanol | Fuyu Reagent | ||
Fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X800 | |
Frozen Slicer | Leica | ||
GFAP (GA5) Mouse mAb | Cell Signaling TECHNOLOGY | #3670 | Dilution ratio (1:600) |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32723TR | Dilution ratio (1:1000) |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32740 | Dilution ratio (1:1000) |
Hematoxylin Staining Solution | Biosharp | BL702A | |
Mice | Jinan Pengyue Experimental AnimalCompany | C57BL/6J | |
Microsurgery apparatus | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | All the surgey instruments are custom-made | Ophthalmic scissors, micro mosquito forceps, microsurgery forceps, micro scissors |
Normal sheep serum for blocking (working solution) | Zhong Shan Jin Qiao | ZLI-9022 | working solution |
O.C.T. Compound | SAKURA | 4583 | |
Phosphate buffered solution (PBS) | Solarbio | P1020 | pH 7.2–7.4 |
Prussian Blue Iron Stain Kit (With Eosin) | Solarbio | G1424 | |
RWD Laboratory inhalation anesthetic station | RWD Life Science Co., Ltd | R550 | |
Small animal in vivo microCT imaging system | PerkinElmer | Quantum GX2 | |
Spinal cord injury coaxial platform | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | Custom-made(Feng's standard) | https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~ 1~b0yRFKOq&alg_id= 0&slg=tagGoodList-default%2COpBottom%2Cuuid% 2CabTraceId&components_ style_layout =1&reft=1659409105184&spm= g.930111970_f.81386274&alias= 367x5ovgn69q18g&from_uuid= 1362cc46-ffe0-6886-2c65-01903 dbacbba&sf=qq_sm&is_share= 1&shopAutoEnter=1&share_cmpt =native_wechat&is_silence_auth=1 |
Surgery microscope | Zumax Medical Co., Ltd. | zumax, OMS2355 | |
Tris Buffered Saline+Tween (TBST) | Solarbio | T1082 | Dilution ratio (1:19) |
Xylene | Fuyu Reagent |