JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Optimalisatie van de tubuline-opbrengst van hersenweefsel bij varkens

Published: October 11, 2024
doi:
10.3791/64925
, , , , ,
1Veterinary Research Institute

Summary

Dit protocol beschrijft een techniek voor de high-yield isolatie van tubuline uit de hersenen van varkens, geoptimaliseerd voor kleinschalige instrumentatie. De isolatieprocedures worden aangevuld met procedures voor het bepalen van de tubulinepolymerisatieactiviteit in vitro met behulp van co-sedimentatieassays en transmissie-elektronenmicroscopie.

Abstract

Neuraal weefsel uit elke bron is een uitstekend materiaal voor tubuline-isolatie, omdat de dendrieten en axonen van neuronen rijk zijn aan microtubuli. Hier presenteren we een procedure voor het extraheren van tubuline die, met kleine aanpassingen, kan worden gebruikt voor neuraal weefsel uit meerdere bronnen. In het gepresenteerde protocol is een nieuwe klaringsstap van het ruwe lysaat geïntroduceerd, wat heeft geleid tot een aanzienlijke vermindering van de initiële hoeveelheid onoplosbaar puin voordat de eerste polymerisatiestap plaatsvond. Deze extra stap maakte het mogelijk om extra weefsel te verwerken met behulp van dezelfde instrumentatie en zo het relatieve volume van het verwerkte homogenaat te vergroten. De nieuw geïntroduceerde stap heeft geen significant effect op de kwaliteit van gezuiverde tubuline, zoals bevestigd door in vitro activiteitstesten en transmissie-elektronenmicroscopie. De beschreven procedure omvat alle cruciale stappen, waaronder weefselverzameling, transport, weefselhomogenisatie, tubuline-isolatiecycli en uiteindelijk polijsten door ionenuitwisselingschromatografie met behulp van FPLC en daaropvolgende activiteitsmetingstests. De homogeniteit van gezuiverde tubuline was meer dan 97%, zoals bevestigd door MS/MS-analyse met behulp van elektrospray-ionisatie en MALDI-TOF.

Introduction

Microtubuli, holle eiwitfilamenten (24 nm in diameter) gevormd door alfa- en bèta-tubuline-heterodimeren, zijn betrokken bij verschillende essentiële cellulaire processen. Ze nemen deel aan de vorming van intracellulaire structuren, beweeglijkheid, celdeling, celdifferentiatie, cellulair transport, vormbehoud en secretie1. De cellulaire functies van microtubuli kunnen worden beïnvloed door directe of indirecte interacties met microtubuli-geassocieerde eiwitten (MAP’s) en andere eiwitten of via complexe posttranslationele modificaties gedefinieerd in de tubulinecode2.

Tubulinevezels ontstaan uit dynamische niet-covalente interacties tussen alfa- en bèta-subeenheden in het nucleatie-verlengingsmechanisme. Er worden korte microtubuli gevormd en de daaropvolgende groei van tubulinevezels wordt bereikt door omkeerbare rek aan beide uiteinden, waardoor cilinders worden gevormd die bestaan uit tubuline-heterodimeren die in parallelle protofilamenten zijn gerangschikt2. Dynamische instabiliteit verwijst naar het feit dat geassembleerde microtubuli vaak niet in evenwicht zijn met hun subeenheden, maar een faseovergang kunnen ondergaan tussen een langere periode van groei en krimp terwijl ze een stabiele toestand behouden 1,2.

De dynamische instabiliteit van tubulinevezels wordt voornamelijk gebruikt in veel tubulinescheidings- en zuiveringsprocedures met behulp van cycli van polymerisatie bij hoge temperatuur en depolymerisatie bij lage temperatuur in de omgeving van zeer zuivere glycerol, DMSO, GTP/ATP, Mg2+ of andere chemische middelen (zoals taxol of polykationen)3. De meeste scheidingsprocedures4 worden gevolgd door eiwitchromatografie 5,6,7,8,9, die zorgt voor de scheiding van tubuline-geassocieerde eiwitten met nucleoside-difosfokinase en ATPase-activiteit 5. Vergelijkbare resultaten kunnen worden verkregen door gebruik te maken van buffers met een hoog zoutgehalte10. Meerdere bronnen, waaronder neurale 11,12,13,14 en niet-neurale 15 weefsels, vissen16 (zowel zoet water als zee), gisten of recombinante varianten17 die tot overexpressie worden gebracht in verschillende productiestammen 11,12,13,14 en andere bronnen 9,18 werden gebruikt voor fractionering en zuivering.

Het gepresenteerde protocol maakt gebruik van precipitatie en eiwitchromatografie om tubuline uit de hersenen van varkens te isoleren tot een hoge homogeniteit (Figuur 1). Het belangrijkste voordeel is een relatief hoge opbrengst die wordt bereikt met instrumenten die beschikbaar zijn in laboratoria die zijn uitgerust voor routinematige moleculair-biologische experimenten.

Protocol

De samenstelling van alle oplossingen en instrumentatie wordt beschreven in de Tabel met Materialen. Alle oplossingen werden bereid met behulp van chemicaliën van FPLC-kwaliteit en vóór gebruik door een filter van 0,22 μm gefilterd. Tijdens alle operaties werden persoonlijke beschermingsmiddelen gebruikt, zoals laboratoriumjassen, handschoenen en een veiligheidsbril. Alle instrumenten waren schoon en vrij van sporen van wasmiddelen. Tijdens de procedures werden de juiste richtlijnen voor dierenverzorging (zoals goedgekeurd door de instelling) gevolgd. Al het biologisch materiaal, inclusief hersenweefsel, werd als grondstof gekocht van een slachthuis. Er werden geen levende dieren gebruikt in enige stap van het protocol. 1. Activering van een fosfo-cellulosekolom voor snelle eiwitvloeistofchromatografie Voeg 700 ml 50% ethanol toe aan 15 g droge fosfocellulosehars en meng dit voorzichtig met een lepel in het bekerglas. Giet de suspensie in een geschikte chromatografische kolom met het juiste volume (700 ml). Sluit de kolom af met zuigers voorzien van fritten. Laat ten minste 10% lege hoofdruimte over.OPMERKING: Andere vaten kunnen worden gebruikt, maar de FPLC-kolom, in combinatie met een peristaltische pomp, verkort de tijd die nodig is voor harsactivering en harsverliezen aanzienlijk. Incubeer op een rocker-shaker op 60 rpm gedurende 30 minuten. Laat de hars bezinken en verwijder het teveel aan 50% ethanol met behulp van de peristaltische pomp met het debiet ingesteld op 3 ml/min. Laat de hars niet opdrogen. Verwijder de bovenste zuiger en voeg 300 ml 50% ethanol toe. Sluit de kolom, schud hem kort en verwijder de overtollige ethanol via een peristaltische pomp. Verwijder de resterende ethanol. Voeg 300 ml ultrazuiver water toe aan de kolom, sluit de kolom af met de zuiger en kantel totdat de hars is geresuspendeerd. Verwijder overtollige vloeistof met behulp van een peristaltische pomp. Herhaal deze stap drie keer. Open de kolom aan de bovenkant, voeg 500 ml 0,5 M HCl toe, sluit de kolom en repareer de hars door deze voorzichtig te kantelen. Incubeer op een rocker-shaker op 60 rpm gedurende 30 minuten.Verwijder overtollige vloeistof met behulp van een peristaltische pomp. Voeg 300 ml 0,5 m HCl toe, resuspendeer de hars en verwijder de overtollige vloeistof. Verwijder de resterende HCl. Voeg 300 ml ultrazuiver water toe aan de kolom, sluit de kolom af met de zuiger en kantel totdat de hars weer suspendeert. Verwijder overtollige vloeistof met behulp van een peristaltische pomp. Herhaal deze stap drie keer. Giet de 700 ml MES-buffer (25 mM MES, 0,1 mM EGTA, 0,5 mM MgCl2) in de kolom en resuspendeer de hars door deze te kantelen. Giet de suspensie in het bekerglas, stel de pH in op 6,1 met 1 M NaOH en laat 2 uur onder zachte beweging incuberen. Laat de hars bezinken, decanteer de vloeistof, voeg 300 ml MES-buffer toe, pH 6,4, en incubeer een nacht bij 4 °C. Decanteer de overtollige vloeistof, voeg 96% ethanol toe tot 20% eindconcentratie en bewaar bij 4 °C tot gebruik. 2. Fosfo-cellulose kolom verpakking Giet 12 ml geactiveerde hars in de schone chromatografische kolom met een plug met gesloten bodem. Laat de hars bezinken. Het volume bezonken hars is ongeveer 5 ml. Verwijder de bovenste laag van de hars (ongeveer 2-3 mm) waar lichtere gebroken matrixfragmenten zich kunnen afzetten. Verwijder de onderste plug en laat de bewaaroplossing druppel voor druppel vrij weglopen. Laat de hars niet opdrogen. Sluit de zuil en sluit deze aan op het FPLC-systeem. Was de kolom met PEM-buffer (100 mM PIPES pH 6,9, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4) bij 1 ml/min (max. druk 1 bar) gedurende 30 min, stel de zuigerhoogte in, draai de kolom ondersteboven en was de kolom onder dezelfde omstandigheden gedurende de volgende 30 min in de omgekeerde stroom. Bewaar de kolom gevuld met geactiveerde fosfocellulose bij 4 °C gedurende enkele dagen. 3. Tubulinescheiding en zuivering OPMERKING: Tubuline is zeer gevoelig voor degradatie en het is van cruciaal belang om snel te werk te gaan. Alle oplossingen, instrumenten en apparatuur moeten, indien nodig, van tevoren worden bereid, gekoeld of opgewarmd. De procedures zijn gevoelig voor verschuivingen in de aanbevolen temperaturen. Het hersenweefsel moet zo snel mogelijk na de dissectie worden verwerkt, rekening houdend met de hoeveelheid biologisch afval die tijdens de zuivering wordt geproduceerd. De procedure werd geoptimaliseerd voor de rotor met zes ultracentrifugatiecuvetten van 75 ml. De hoeveelheid bewerkt weefsel kan worden verhoogd of verlaagd afhankelijk van de beschikbare ultracentrifuge. Transport van weefselDoe 500 g vers ontlede varkenshersenen (6-8 stuks) in een transportvat van 3 L en giet de ijskoude transportbuffer (4,1 mM MES pH 7, 320 mM Sacharose, 1 mM EGTA) tot deze volledig is ondergedompeld. Laat 5 minuten op ijs staan en vervang de transportbuffer door een verse buffer om de warmteafvoer te vergemakkelijken. Transporteer snel op ijs voor verdere verwerking. Homogenisatie van weefselsOPMERKING: Weefselhomogenisatie wordt uitgevoerd op ijs in een koude ruimte. Alle instrumenten moeten worden voorgekoeld om spontane polymerisatie te voorkomen. De primaire bron van tubuline is grijze stof en de rest wordt in de volgende stappen verwijderd.Giet 100 ml extractiebuffer (4,1 mM MES pH 7, 520 mM sacharose, 1 mM EGTA, 1 mM ATP en 0,1 mM GTP) in een plastic bekerglas van 1 l en bepaal het gewicht W1 (g) inclusief het vat. ATP en GTP worden vlak voor het gebruik toegevoegd. Haal de varkenshersenen uit het transportvat en verwijder het hele cerebellum, vet, grote stukken witte stof, hersenvliezen en bloedvaten met de vingers door bescheiden kracht uit te oefenen. Een schaar of pincet kan ook worden gebruikt. Plaats de varkenshersenen, ontdaan van ongewenst weefsel, in het bekerglas met 100 ml koude extractiebuffer. Ga door totdat al het weefsel is verwerkt. Weeg het bekerglas met bewerkt hersenweefsel en bepaal het gewicht W2 (g). Voeg extractiebuffer toe volgens de formule, Extractiebuffergewicht = W2 – W1 (bijv. voor 400 g weefsel wordt 300 g extra extractiebuffer toegevoegd). Breng het hersenweefsel met extractiebuffer over in de voorgekoelde keukenblender en verwerk in 4-8 korte pulsen van drie seconden. Verwerk het gedeeltelijk gehomogeniseerde weefsel met een dispersiehomogenisator met hoge snelheid (18 000 tpm) gedurende 1 minuut. Laat de suspensie 3-5 minuten op ijs staan en meng af en toe met een lepel. Herhaal dit vijf keer of tot volledige homogenisatie. Giet in voorgekoelde ultracentrifugatiebuizen en laat 10 minuten draaien, bij 4 °C en 50.000 x g. Bewaar het supernatans en gooi de pellet weg. Herhaal dit totdat 430 ml geklaard extract is verzameld. Giet het geklaarde extract in voorgekoelde ultracentrifugatiebuisjes (elk 70 ml) en centrifugeer gedurende 60 minuten op 4 °C en 75.000 x g . Verzamel het supernatans en bepaal het volume S1.OPMERKING: Als er slechts één rotor bestaat, verwarm deze dan in een warmwaterbad voor de volgende centrifugatiestap (37 °C). Eerste polymerisatieVoeg 10x MEM-buffer toe (1 M MES pH 6,8, 10 mM EGTA, 10 mM MgCl2) volgens formule V = S1/9 ml (voeg voor 585 ml supernatant 65 ml 10x MEM-buffer toe). Meng goed en voeg glycerol toe tot 3,5 M en GTP tot 0,1 mM eindconcentratie. Giet de suspensie in ultracentrifugatiebuizen (het volume van het supernatans is groter dan het volume van de buizen; de rest wordt weggegooid). Incubeer de buisjes met het supernatans in een waterbad gedurende 45 minuten bij 37 °C. Draai de buizen 90 minuten rond op 37 °C en 75.000 x g. Meet het volume van het supernatans (S2) om het volume van de MEM-buffer te bepalen, voeg het toe aan de pellets in stap 3.3.4 en gooi het supernatans vervolgens weg. Bewaar de pellet op de plaats waar de gepolymeriseerde tubuline zich bevindt. Bereid 0,5 x S2 volume ijskoude 1x MEM-buffer voor. Voeg een gelijke hoeveelheid 1x MEM-buffer toe aan elke ultracentrifugebuis met de pellet. Resuspendeer pellets in de toegevoegde 1x MEM-buffer, breng de suspensies over in de gegradueerde cilinder en bepaal het totale volume.Voeg GTP toe aan de eindconcentratie van 1 mM. Breng de suspensie over in een Dounce glashomogenisator en homogeniseer de oplossing elke 10 minuten of zo gedurende 45 minuten op ijs. De zuiger moet voorzichtig worden bediend, omdat deze gemakkelijk kan breken.NOTITIE: Koel intussen de rotor af in water met ijs. Giet de gehomogeniseerde oplossing in voorgekoelde ultracentrifugatiebuizen en draai gedurende 60 minuten op 75.000 x g en 4 °C. Bepaal na het centrifugeren het volume van het bovendrijvende middel (S3). Tweede polymerisatieMeng het supernatans met de 0,35 x S3 ml glycerol en voeg GTP toe tot de eindconcentratie van 1 mM. Giet het supernatans in ultracentrifugatiebuizen en incubeer gedurende 45 minuten bij 37 °C.OPMERKING: Verwarm intussen de rotor in het waterbad tot 37 °C. Centrifugeer het gepolymeriseerde supernatans uit stap 3.4.1 gedurende 60 minuten bij 75.000 x g en 37 °C. Bepaal het volume van het supernatans (S4).OPMERKING: Dit is een optioneel stoppunt. De pellet met tubuline kan worden ingevroren in vloeibare stikstof en worden opgeslagen bij -80 °C. Laat de bevroren pellets langzaam ontdooien op ijs gedurende 30 min. Bereid 0,25 x S4 ml PIPES-buffer (500 mM PIPES pH 6,9, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, 1 mM DTT, 0,1 mM ATP), verdeel gelijkmatig in buizen met pellets, resuspendeer de pellets met een lepel en breng de oplossing over in een Dounce-glashomogenisator. Homogeniseer elke 10 minuten op ijs gedurende 45 minuten.NOTITIE: Koel intussen de rotor af in water met ijs. Giet de oplossing met gedepolymeriseerde tubuline in ultracentrifugatiebuizen en draai gedurende 60 minuten bij 4 °C en 75.000 x g. Derde polymerisatieBepaal het volume supernatans (S5) en voeg S5/9 ml DMSO toe. Giet de suspensie in ultracentrifugatiebuizen en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C om te polymeriseren.OPMERKING: Verwarm intussen de rotor in het waterbad tot 30 °C. Centrifugeer de gepolymeriseerde tubuline gedurende 60 minuten bij 75.000 x g en 30 °C. Bepaal het volume supernatans (S6) en bewaar de pellets. Los de pellets op in 0,25 x S6 ml PEM-buffer (100 mM PIPES pH 6,9, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, 1 mM DTT, 0,1 mM ATP). Gebruik een Dounce glashomogenisator om de oplosbaarheid te verbeteren. Blijf PEM-buffer toevoegen totdat de pellets volledig zijn opgelost (er zijn geen opaalachtige deeltjes meer zichtbaar). Zuivering van ionenuitwisselingschromatografieOPMERKING: De omgekeerde ionenuitwisselingschromatografie wordt gebruikt om microtubuline-geassocieerde eiwitten te verwijderen. Tubuline stroomt vrij door de kolom bij de gegeven pH en verontreinigende eiwitten worden vastgehouden op de fosfo-cellulosehars. Alle stappen worden uitgevoerd bij temperaturen in de buurt van 4° C of op ijs. Klaring het tubuline-extract niet vóór de FPLC-zuivering, noch door filtratie, noch door centrifugatie. Breng FPLC en de kolom met de PEM-buffer in evenwicht (100 mM PIPES pH 6,9, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, 1 mM DTT, 0,1 mM ATP). Gebruik ten minste 10 kolomvolumes voor evenwicht. Het pompdebiet mag niet hoger zijn dan het debiet dat wordt gebruikt voor het verpakken van kolommen (1 ml/min). Laad de tubuline-suspensie langzaam (0,5 ml/min) op de kolom en verzamel het ongebonden eiwit dat door de hars stroomt. Voeg 10 μL 100 mM GTP toe aan elke fractie van 1 ml die het tubuline-eiwit bevat. Vries fracties die tubuline bevatten in vloeibare stikstof in en breng ze onmiddellijk over in de container met vloeibare stikstof. Tubuline kan onder deze omstandigheden meerdere jaren worden bewaard. De stabiliteit neemt snel af over enkele maanden als de tubuline wordt bewaard bij -80 °C.

Representative Results

Tijdens de scheidings- en zuiveringsstappen werden monsters voor SDS-PAGE-elektroforese genomen en vervolgens geanalyseerd met behulp van Coomassie-blue-kleuring (Figuur 2). 20 μL van elk monster werd gemengd met 10 μL Laemmli-monsterbuffer (188 mM Tris-HCl pH 6,8, 3% SDS (w/w), 30% glycerol (v/v), 0,01 broomfenolblauw (w/g), 15% β-mercaptoethanol) en geïncubeerd bij 95 °C gedurende 15 min. 4 μL van elk monster werd geladen op 12,5% acrylamide SDS-gel en gescheiden onder een constante stroom van 30 mA per gel in reducerende en denaturerende omstandigheden. De resultaten bevestigden een incrementele toename van de relatieve tubulineconcentratie, vergezeld van een vermindering van verontreinigende eiwitten. Bovendien was er geen significant verlies van tubuline in geklaard lysaat in de eerste centrifugatie (stap 3.2.7) in vergelijking met het weglaten van deze stap (figuur 2A,B). De eiwitconcentratie werd bepaald met behulp van drie onafhankelijke methoden: BCA-test, Bradford-eiwittest en SDS-PAGE-geldensitometrieanalyse19 (Figuur 3). De totale opbrengst van tubuline met behulp van de beschreven procedure was 123 mg gezuiverde tubuline uit 250 g neuraal weefsel. Tijdens de metingen moet er rekening mee worden gehouden dat de hoge DTT-concentratie in de opslagbuffer een aanzienlijke impact heeft op de BCA-test. Zowel de PEM-buffer als de PBS-buffer, met toevoeging van DTT, verhogen de achtergrondabsorptie met ongeveer 0,900 A595, wat de capaciteit van de BCA-test aanzienlijk vermindert (Figuur 3A). Het negatieve effect van DTT is zelfs waarneembaar na tien keer verdunning met zuiver water (gegevens niet weergegeven). De Bradford-test leek niet te worden beïnvloed door de opslagbuffer (figuur 3B), zoals bevestigd door densitometrieanalyse. De zuiverheid van het tubulinepreparaat werd geverifieerd door middel van massaspectrometrie-analyse in twee onafhankelijke faciliteiten (VRI Brno, Tsjechië; CEITEC MU Brno, Tsjechië) met behulp van elektrospray-ionisatie en MALDI-TOF. Beide analyses bevestigden de aanwezigheid van varkenstubulines, alfa en bèta in verschillende isovormen. De totale zuiverheid was meer dan 97,07% (PSM’s 1065), waarbij de meest voorkomende onzuiverheden afkomstig waren van Homo sapiens Keratin Type II (PSM’s 246, 2,24% van de onzuiverheden) die hoogstwaarschijnlijk werden geïntroduceerd tijdens de tubuline-isolatie en monstervoorbereiding voor MS/MS-analyse. Andere onzuiverheden bestaande uit 322 PSM’s en alleen serumalbumine, actine-gamma en trypsinogeen afkomstig van Sus scrofa werden geïdentificeerd met één peptideresolutie (0,0069%). In daaropvolgende experimenten werd het behoud van de polymerisatiecapaciteit na snel invriezen en opslag in vloeibare stikstof geverifieerd. De aliquot van 10 mg/ml werd uit vloeibare stikstof verwijderd en langzaam ontdooid op ijs. Monsters van verschillende concentraties (10 mg/ml, 8 mg/ml, 6 mg/ml, 4 mg/ml en 2 mg/ml) werden bereid door de aliquots te verdunnen in PEM-buffer die DTT, ATP en GTP bevat voor het zelfassemblage-experiment. Eén verdunningsreeks werd gedurende 60 minuten bij 37 °C geïncubeerd en de tweede werd gedurende 60 minuten op ijs geïncubeerd. Beide series werden gedurende 60 minuten gecentrifugeerd bij 21.000 x g en de bijbehorende temperatuur (4 °C of 37 °C). 30 μL supernatans werd verwijderd en gebruikt voor SDS-PAGE. Het resterende supernatans werd voorzichtig verwijderd met behulp van een pipet en weggegooid. De pellets werden kort gewassen door 100 μM PEM-buffer toe te voegen, gevolgd door onmiddellijke verwijdering met behulp van een pipet. Vervolgens werden de pellets geresuspendeerd in 50 μL 1x geconcentreerde SDS-laadbuffer zodat de relatieve concentratie van pellet en supernatans behouden blijft. Aan elke supernatant werd 10 μL SDS-laadbuffer toegevoegd. Alle monsters werden geanalyseerd met behulp van de SDS-PAGE en Coomassie Staining (Figuur 4). Het volume van elk monster dat in SDS-PAGE werd geladen, werd aangepast aan de startconcentratie, zodat het verschil in neerslag als gevolg van de concentratie duidelijker is. De zelfassemblagetest van tubuline in PEM-buffer bevestigde het vermogen om tubulinevezels op een temperatuurafhankelijke manier te vormen. De MAP2c-aangedreven tubuline20,21-assemblagetest die het vermogen van tubuline om te interageren met andere eiwitten verifieert, werd uitgevoerd22. De seriële verdunningen van MAP2c werden bereid waarbij 100 μL van 1 mg/ml tubuline-aliquots werden gemengd met MAP2c tot de uiteindelijke concentratie variërend van 0 μM tot 8 μM. Alle monsters werden bereid op ijs door verdunning in vers bereide PEM-buffer met 1 mM DTT en 1 mM GTP. De tubuline werd gedurende 15 minuten geïncubeerd bij 37 °C met verschillende concentraties MAP2c en gedurende 60 minuten gecentrifugeerd bij 21.000 x g en 37 °C. De laatste wasbeurt van de pellet werd twee keer uitgevoerd met 100 μL PEM-buffer. Het experiment bevestigde het vermogen van de bereide tubuline om MAP2c-gestuurde polymerisatie te ondergaan, aangezien alleen het monster zonder MAP2c geen pellet vormde (Figuur 5). Transmissie-elektronenmicroscopie werd verder gebruikt om de aanwezigheid van tubulinefilamenten uit co-polymerisatie-experimenten te bevestigen. Suspensies van gezuiverde tubuline geprecipiteerd met MAP2c werden voorbereid voor transmissie-elektronenmicroscopie met behulp van negatieve kleuring. De monsters werden geadsorbeerd op met Formvar beklede, met koolstof gestabiliseerde koperen roosters. De roosters werden vervolgens negatief gekleurd met 2% NH4MoO4 en onderzocht onder een elektronenmicroscoop met een vergroting van 18.000x en een versnellende spanning van 80 kV. De aanwezigheid van homogene microtubuli met een duidelijke filamenteuze structuur en de juiste grootte toonde het vermogen om microtubuli in natuurlijke conformatie te vormen (figuur 6). Figuur 1: Een schematisch diagram van de scheiding en zuivering van tubulines. Het getal tussen haakjes verwijst naar de protocolstap. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Scheiding en zuivering van tubuline. (A) De SDS-PAGE-analyse van monsters die zijn genomen tijdens de scheiding van tubuline met behulp van temperatuurgestuurde polymerisatie (3 μL per lijn). De afname van onzuiverheden met een stabiele toename van de relatieve tubuline-abundantie (ongeveer 50 kDa) is zichtbaar. De getallen boven elke regel komen overeen met het stapnummer in het protocol. (B) De SDS-PAGE-analyse van fracties verkregen na eiwitchromatografie op fosfocellulosehars (4 μL per lijn). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Eiwitconcentratie. De verdunningsreeks van runderserumalbumine tot 1 mg/ml in PEM-buffer of PBS werd vergeleken met BSA-verdunningsreeksen die afzonderlijk of in combinatie 0,1 mM GTP, 1 mM DTT bevatten (0,1 mM ATP, 1 mM GTP en 1 mM DTT) in de PEM- of PBS-buffer. (A) Toen de BCA-test werd gebruikt, was er een significante verschuiving in de achtergrond van monsters die DTT (vaste symbolen) bevatten. (B) Dit effect werd niet gedetecteerd bij het meten van de concentraties in de Bradford-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Tubulin zelfassemblagetest. De SDS-PAGE-analyse van de zelfassemblagetest bevestigde het vermogen van opgeslagen tubuline geïncubeerd bij (A) 4 °C of (B) 37 °C om op een temperatuurafhankelijke manier te polymeriseren in een breed spectrum van concentraties. (P – pellet, S – supernatant; de respectieve concentratie van tubuline wordt boven elk lijnenpaar aangegeven; de hoeveelheid van elk geladen monster was 10 μg). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Tubuline co-sedimentatie test. De SDS-PAGE-analyse van MAP2c-geassisteerde tubuline-assemblage bevestigde het vermogen van opgeslagen tubuline om polymerisatie te ondergaan die wordt aangedreven door interactie met microtubuli-geassocieerd eiwit op een concentratie-afhankelijke manier. De molaire concentratie van MAP2c staat boven elke lijn aangegeven. (P – pellet, S – supernatant). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: Transmissie elektronenmicroscopie. De TEM-microfoto’s toonden aan dat tubuline zich assembleert (A) tot microtubuli met de juiste diameter (B) bestaande uit homogene tubulinefilamenten versierd met MAP2c-eiwitten. De staaf komt overeen met 1000 nm (A) en 200 nm (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Het neurale weefsel van elke bron is een uitstekend materiaal voor tubuline-isolatie, aangezien de dendrieten en axonen van neuronen rijk zijn aan microtubuli (tot 40%)23. Hersenweefsel kan relatief gemakkelijk in voldoende hoeveelheden worden verkregen. Het grootste nadeel kan een niet-gespecificeerd niveau van posttranslationele modificaties zijn, die van invloed kunnen zijn op latere experimenten24,25. Anders is de enige zorg de snelle degradatie van uitgangsmateriaal, vooral in warme omstandigheden. We hebben verschillende overdrachtsbufferuitwisselingen gebruikt om de warmteafvoer voorafgaand aan het transport te verbeteren en snel transport voor de verwerking, die zo snel mogelijk begint. Het verse weefsel wordt ontleed onder omstandigheden die verhitting voorkomen en gehomogeniseerd in een buffer die GTP en glycerol bevat, die tubuline verder stabiliseert26.

In het gepresenteerde protocol is de klaringsstap (stap 3.2.7) van het ruwe lysaat geïntroduceerd. Langdurige centrifugatie vóór de eerste polymerisatie wordt over het algemeen niet aanbevolen vanwege de gevoeligheid van tubuline voor onomkeerbare modificaties en proteasen. Aan de andere kant toonden de huidige experimenten aan dat een korte spin in hoge G-kracht het puin vermindert en zo het relatieve volume van het verwerkte homogenaat verhoogt zonder de kwaliteit van de tubuline significant te beïnvloeden.

De exacte bepaling van de eiwitconcentratie is essentieel voor verdere experimenten, vooral wanneer interacties met tubulinebindende eiwitten of remmers worden bestudeerd. Tijdens de onderzoeken stuitten we op significante verschillen in de resultaten van eiwitconcentratietesten. De belangrijkste reden was de aanwezigheid van DTT, GTP en ATP in hoge concentraties die de tests verstoorden. De BCA-test werd verschoven naar de bovengrenzen vanwege de hoge hoeveelheid DTT in de opslagbuffer, waardoor de analysecapaciteit afnam. Bovendien veroorzaakten de vergelijkbare extinctiemaxima van eiwitten en ATP of GTP inconsistenties in de bepaling van de eiwitconcentratie met behulp van de absorptie bij 280 nm. Hetzelfde probleem was merkbaar in de uitlezingen van de FPLC UV-detector. De meest betrouwbare test, met stabiele resultaten, was de Bradford-eiwittest, waarbij geen invloed van bufferverbindingen werd waargenomen. Toch is het essentieel om de standaard eiwitverdunningsreeksen in de opslagbuffer te bereiden.

Het vermogen van gezuiverde tubuline om geschikte arrangementen te creëren is een voorwaarde voor latere experimenten. Tubuline is van nature zeer vatbaar voor afbraak, zelfs in een glycerol-GTP-rijke omgeving, wat resulteert in een verminderd vermogen om homogene filamenten te vormen. Het is van cruciaal belang om het zuiveringsproces te volgen en experimenteel het vermogen van opgeslagen tubuline te verifiëren om te polymeriseren tot stabiele, regelmatige filamenten. Er zijn verschillende onafhankelijke methoden geïntroduceerd om de tubulinetoestand in vivo en in vitro te verifiëren. Een van de meest prominente, de circulaire dichroïsmespectroscopie27, de oppervlakteplasmonresonantietest28, de thermische verschuivingstest29, de polymerisatieremmingstest30, de immunofluorescentiekleuring31,32, de coprecipitatie22,33 en de transmissie-elektronenmicroscoopanalyse32 kan worden genoemd. De polymerisatietest en coprecipitatie van tubuline die in dit protocol worden gebruikt, zijn eenvoudig uit te voeren. Ze kunnen snel worden geëvalueerd door de pellets die op de bodem van de buis voorkomen of met behulp van SDS-PAGE. Aan de andere kant kan de neergeslagen tubuline de vorm hebben van aggregaten. Meer geavanceerde methoden, zoals transmissie-elektronenmicroscopie, moeten worden opgenomen om de aanwezigheid van microtubuli-vezels voor kwaliteitscontrole te bevestigen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De studie werd ondersteund door het Technologieagentschap van Tsjechië (projectnr. TN02000017 – Nationaal Centrum voor Biotechnologie in de Diergeneeskunde – NaCeBiVet).

Materials

1.5 mL tubes — — Common material
10 mL tubes — — Common material
50 mL tubes — — Common material
ATP ROTH HN35.2 Analytical grade
DMSO ROTH A994.2 Analytical grade
Dounce glass homogenizer P-LAB H244043 Homogenizer
DTT ROTH 6908.1 Analytical grade
EGTA ROTH 3054.3 Analytical grade
Ethanol PENTA 70390-11001 Analytical grade
Glycerol ROTH 6967.2 Analytical grade
Graduated beakers — — Common equipment
Graduated cilinders — — Common equipment
GTP MERCK 36051-31-7 Very high quality
HCl PENTA 19360-11000 Analytical grade
Izolated box for tissue transport — — Common equipment
Kitchen blender Waring 7011HB Glass or plastic vessel
Liquid nitrogen — — Common material
MES  ROTH 6066.4 Analytical grade
MgCl2 MERCK 814733  Analytical grade
MgSO4 PENTA 43180-31000 Analytical grade
NaOH PENTA 15650-11000 Analytical grade
Optima XPN100 Beckman Coulter  A94469 Ultracentrifuge
Phosphocellulose column VWR GENO786-1291 Empty column
Phosphocellulose resin Creative – Biomart, inc Phosphate-001C Ion exchange resin
PIPES ROTH 9156.2 Analytical grade
Saccharose PENTA 24970-31000 Analytical grade
Scales — — Common equipment
Scissors — — Common equipment
Spoons  — — Plastic or glass
Ti45 rotor Beckman Coulter  339160 Rotor for Ultracentrifuge
Tweezers — — Common equipment
Ultra turrax IKA T18 basic IKA 356 1000 Laboratory dispenser
Water bath 37 °C — — Stirred
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verhey, K. J., Gaertig, J. The tubulin code. Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).
  2. Murphy, D. B., Hiebsch, R. R. Purification of microtubule protein from beef brain and comparison of the assembly requirements for neuronal microtubules isolated from beef and hog. Anal Biochem. 96 (1), 225-235 (1979).
  3. Borisy, G. G., Marcum, J. M., Olmsted, J. B., Murphy, D. B., Johnson, K. A. Purification of tubulin and associated high molecular weight proteins from porcine brain and characterization of microtubule assembly in vitro. Ann NY Acad Sci. 253, 107-132 (1975).
  4. Weisenberg, R. C. Microtubule formation in vitro in solutions containing low calcium concentrations. Science. 177 (4054), 1104-1105 (1972).
  5. Roychowdhury, S., Gaskin, F. Separation of assembly-competent tubulin from brain microtubule protein preparations using a fast-performance liquid chromatography procedure. J Neurochem. 46 (5), 1399-1405 (1986).
  6. Weingarten, M. D., Suter, M. M., Littman, D. R., Kirschner, M. W. Properties of the depolymerization products of microtubules from mammalian brain. Biochemistry. 13 (27), 5529-5537 (1974).
  7. Souphron, J., et al. Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles. Nat Protoc. 14 (5), 1634-1660 (2019).
  8. Jacobs, M., Huitorel, P. Tubulin-associated nucleoside diphosphokinase. Eur J Biochem. 99 (3), 613-622 (1979).
  9. Munguía, B., et al. Purification of native M. vogae and H. contortus tubulin by TOG affinity chromatography. Exp Parasitol. 182, 37-44 (2017).
  10. Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein ExpPurif. 32 (1), 83-88 (2003).
  11. Minoura, I., et al. Overexpression, purification, and functional analysis of recombinant human tubulin dimer. FEBS Lett. 587 (21), 3450-3455 (2013).
  12. Liu, C., Yao, J., Yin, J., Xue, J., Zhang, H. Recombinant α- and β-tubulin from Echinococcus granulosus: Expression, purification and polymerization. Parasite. 25, 62 (2018).
  13. Ti, S. -. C., Wieczorek, M., Kapoor, T. M. Purification of affinity tag-free recombinant tubulin from insect cells. STAR protoc. 1 (1), 100011 (2020).
  14. Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Janke, C., Magiera, M. M. Purification of tubulin with controlled post-translational modifications and isotypes from limited sources by polymerization-depolymerization cycles. JVisExp. (165), e61826 (2020).
  15. Sackett, D. L., Werbovetz, K. A., Morrissette, N. S. Isolating tubulin from nonneural sources. Methods Cell Biol. 95, 17-32 (2010).
  16. Modig, C., Strömberg, E., Wallin, M. Different stability of posttranslationally modified brain microtubules isolated from cold-temperate fish. Mol Cell Biochem. 130 (2), 137-147 (1994).
  17. Fourest-Lieuvin, A. Purification of tubulin from limited volumes of cultured cells. Protein Exp Purif. 45 (1), 183-190 (2006).
  18. MacRae, T. H., Gull, K. Purification and assembly in vitro of tubulin from Trypanosoma brucei. Biochem J. 265 (1), 87-93 (1990).
  19. Jansen, S., et al. Quantitative mapping of microtubule-associated protein 2c (MAP2c) phosphorylation and regulatory protein 14-3-3ζ-binding sites reveals key differences between MAP2c and its homolog Tau. JBiol Chem. 292 (24), 3-3 (2017).
  20. Melková, K., et al. Structure and functions of microtubule associated proteins Tau and MAP2c: Similarities and differences. Biomolecules. 9 (3), E105 (2019).
  21. Herzog, W., Weber, K. Fractionation of brain microtubule-associated proteins: Isolation of two different proteins which stimulate tubulin polymerization in vitro. Eur J Biochem. 92 (1), 1-8 (1978).
  22. Castle, A. G., Crawford, N. Isolation of tubulin from pig platelets. FEBS Lett. 51 (1), 195-200 (1975).
  23. Wloga, D., Joachimiak, E., Fabczak, H. Tubulin post-translational modifications and microtubule dynamics. Int J Mol Sci. 18 (10), E2207 (2017).
  24. Lafanechère, L., Job, D. The third tubulin pool. Neurochem Res. 25 (1), 11-18 (2000).
  25. Arai, T., Ihara, Y., Arai, K., Kaziro, Y. Purification of tubulin from bovine brain and its interaction with guanine nucleotides. J Biochem. 77 (3), 647-658 (1975).
  26. Mahaddalkar, T., et al. Structural investigations into the binding mode of a novel noscapine analogue, 9-(4-vinylphenyl) noscapine, with tubulin by biochemical analyses and molecular dynamic simulations. J Biomol Struct Dyn. 35 (11), 2475-2484 (2017).
  27. Chen, H., et al. Structure-activity relationship study of novel 6-Aryl-2-benzoyl-pyridines as tubulin polymerization inhibitors with potent antiproliferative properties. J Med Chem. 63 (2), 827-846 (2020).
  28. Yao, D., et al. Ferulin C triggers potent PAK1 and p21-mediated anti-tumor effects in breast cancer by inhibiting Tubulin polymerization in vitro and in vivo. Pharmacol Res. 152, 104605 (2020).
  29. Sweetnam, P. M., et al. The role of receptor binding in drug discovery. JNat Prod. 56 (4), 441-455 (1993).
  30. Qi, Z. -. Y., et al. Synthesis and biological evaluation of 1-(benzofuran-3-yl)-4-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-1H-1,2,3-triazole derivatives as tubulin polymerization inhibitors. Bioorg Chem. 94, 103392 (2020).
  31. Sáez-Calvo, G., et al. Triazolopyrimidines are microtubule-stabilizing agents that bind the vinca inhibitor site of tubulin. Cell Chem Bio. 24 (6), 737-750 (2017).
  32. Bellocq, C., et al. Purification of assembly-competent tubulin from Saccharomyces cerevisiae. EurJ Biochem. 210 (1), 343-349 (1992).

Tags

BiochemistryTubulinextractionpurificationisolationbrainpolymerizationmammal

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Norek, A., Šťastná, M., Gečnuk, J., Kulich, P., Gebauer, J., Janda, L. Optimizing Tubulin Yield from Porcine Brain Tissue. J. Vis. Exp. (212), e64925, doi:10.3791/64925 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image