تحسين عائد التوبولين من أنسجة المخ الخنازير
Summary
يصف هذا البروتوكول تقنية لعزل التوبولين عالي الغلة من دماغ الخنازير الأمثل للأجهزة الصغيرة الحجم. وتستكمل إجراءات العزل بإجراءات لتحديد نشاط بلمرة التوبولين في المختبر باستخدام مقايسات الترسيب المشترك والمجهر الإلكتروني النافذ.
Abstract
الأنسجة العصبية من أي مصدر هي مادة ممتازة لعزل التوبولين ، حيث أن الزوائد الشجيرية والمحاور العصبية غنية بالأنابيب الدقيقة. هنا ، نقدم إجراء لاستخراج التوبولين يمكن استخدامه ، مع تعديلات طفيفة ، للأنسجة العصبية من مصادر متعددة. في البروتوكول المقدم ، تم إدخال خطوة توضيح جديدة للتحلل الخام ، مما أدى إلى انخفاض كبير في الكمية الأولية للحطام غير القابل للذوبان قبل حدوث خطوة البلمرة الأولى. سمحت هذه الخطوة الإضافية بمعالجة أنسجة إضافية أثناء استخدام نفس الأجهزة ، وبالتالي زيادة الحجم النسبي للتجانس المعالج. الخطوة التي تم إدخالها حديثا ليس لها تأثير كبير على جودة التوبولين المنقى ، كما تؤكده فحوصات النشاط في المختبر والمجهر الإلكتروني النافذ. يحتوي الإجراء الموصوف على جميع الخطوات الحاسمة ، بما في ذلك جمع الأنسجة ، والنقل ، وتجانس الأنسجة ، ودورات عزل التوبولين ، والتلميع النهائي عن طريق كروماتوغرافيا التبادل الأيوني باستخدام FPLC ومقايسات قياس النشاط اللاحقة. كان تجانس التوبولين المنقى أكثر من 97٪ ، كما أكد تحليل MS / MS باستخدام التأين بالرش الكهربائي و MALDI-TOF.
Introduction
تشارك الأنابيب الدقيقة ، خيوط البروتين المجوفة (قطرها 24 نانومتر) التي تتكون من متغاير ألفا وبيتا توبولين ، في العديد من العمليات الخلوية الأساسية. يشاركون في تشكيل الهياكل داخل الخلايا ، والحركة ، وانقسام الخلايا ، وتمايز الخلايا ، والنقل الخلوي ، وصيانة الشكل ، والإفراز1. يمكن أن تتأثر الوظائف الخلوية للأنابيب الدقيقة بالتفاعلات المباشرة أو غير المباشرة مع البروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة (MAPs) والبروتينات الأخرى أو عن طريق تعديلات معقدة بعد الترجمة المحددة في كود توبولين2.
تنشأ ألياف التوبولين من التفاعلات الديناميكية غير التساهمية بين وحدات ألفا وبيتا الفرعية في آلية استطالة النواة. يتم تشكيل الأنابيب الدقيقة القصيرة ، ويتم تحقيق النمو اللاحق لألياف التوبولين عن طريق الاستطالة العكسية في كلا الطرفين ، وتشكيل أسطوانات تتكون من متغايرة توبولين مرتبة في خيوط أوليةمتوازية 2. يشير عدم الاستقرار الديناميكي إلى حقيقة أن الأنابيب الدقيقة المجمعة غالبا ما تكون غير متوازنة مع وحداتها الفرعية ولكن يمكن أن تخضع لمرحلة انتقالية بين فترة طويلة من النمو والانكماش مع الحفاظ على حالة مستقرة 1,2.
يتم استخدام عدم الاستقرار الديناميكي لألياف التوبولين بشكل أساسي في العديد من إجراءات فصل وتنقية التوبولين باستخدام دورات البلمرة ذات درجة الحرارة العالية وإزالة البلمرة بدرجة حرارة منخفضة في بيئة الجلسرين عالي النقاء أو DMSO أو GTP / ATP أو Mg2+ أو عوامل كيميائية أخرى (مثل التاكسول أو البوليكاتيونات) 3. يتبع معظم إجراءات الفصل4 كروماتوغرافيا البروتين5،6،7،8،9 ، مما يضمن فصل البروتينات المرتبطة بالتوبولين مع نشاط ثنائي فوسفوكيناز النوكليوزيد و ATPase5. يمكن الحصول على نتائج مماثلة من خلال استخدام مخازن عالية الملح10. مصادر متعددة ، بما في ذلك الأنسجةالعصبية 11،12،13،14 وغير العصبية15 ، والأسماك16 (المياه العذبة والبحرية) ، والخمائر ، أو المتغيرات المؤتلفة17 تم التعبير عنها بشكل مفرط في سلالات الإنتاجالمختلفة 11،12،13،14 ، ومصادر أخرى9،18 تم استخدامها للتجزئة و تنقيه.
يستخدم البروتوكول المقدم الترسيب وكروماتوغرافيا البروتين لعزل التوبولين من دماغ الخنزير إلى تجانس عالي (الشكل 1). الميزة الرئيسية هي العائد المرتفع نسبيا الذي تم تحقيقه مع الأجهزة المتاحة في المختبرات المجهزة لتجارب البيولوجيا الجزيئية الروتينية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد النسيج العصبي من أي مصدر مادة ممتازة لعزل التوبولين حيث أن الزوائد الشجيرية والمحاور العصبية غنية بالأنابيب الدقيقة (حتى 40٪) 23. يمكن الحصول على أنسجة المخ بسهولة نسبيا بكميات كافية. قد يكون العيب الرئيسي هو مستوى غير محدد من تعديلات ما بعد الترجمة ، والتي يمكن أن تؤثر على التجارب اللاحقة24,25. خلاف ذلك ، فإن الشاغل الوحيد هو التدهور السريع للمواد الأولية ، وخاصة في الظروف الدافئة. لقد استخدمنا العديد من عمليات التبادل بين النقل والمخزن المؤقت لتعزيز تبديد الحرارة قبل النقل والنقل السريع للمعالجة ، والتي تبدأ في أقرب وقت ممكن. يتم تشريح الأنسجة الطازجة في ظروف تمنع التسخين ومتجانسة في مخزن مؤقت يحتوي على GTP والجلسرين ، مما يزيد من استقرار توبولين26.
في البروتوكول المقدم ، تم إدخال خطوة التوضيح (الخطوة 3.2.7) من المحللة الخام. لا ينصح عموما بالطرد المركزي لفترات طويلة قبل البلمرة الأولى بسبب قابلية التوبولين للتعديلات والبروتياز التي لا رجعة فيها. من ناحية أخرى ، أظهرت التجارب الحالية أن الدوران القصير في قوة G العالية يقلل من الحطام وبالتالي يزيد من الحجم النسبي للتجانس المعالج دون التأثير بشكل كبير على جودة التوبولين.
يعد التحديد الدقيق لتركيز البروتين ضروريا لمزيد من التجارب ، خاصة عند دراسة التفاعلات مع البروتينات أو مثبطات ربط التوبولين. خلال التحقيقات ، واجهنا اختلافات كبيرة في نتائج فحوصات تركيز البروتين. كان السبب الرئيسي هو وجود DTT و GTP و ATP بتركيزات عالية تتداخل مع المقايسات. تم تحويل مقايسة BCA إلى الحدود العليا بسبب الكمية العالية من DTT في المخزن المؤقت للتخزين ، مما يقلل من سعة الفحص. علاوة على ذلك ، تسبب الحد الأقصى للامتصاص المماثل للبروتينات و ATP أو GTP في حدوث تناقضات في تحديد تركيز البروتين باستخدام الامتصاص عند 280 نانومتر. كانت نفس المشكلة ملحوظة في القراءات من كاشف الأشعة فوق البنفسجية FPLC. كان الفحص الأكثر موثوقية ، مع نتائج مستقرة ، هو فحص بروتين برادفورد ، حيث لم يلاحظ أي تأثير للمركبات العازلة. ومع ذلك ، من الضروري تحضير سلسلة التخفيف القياسية للبروتين في مخزن التخزين.
تعد قدرة التوبولين المنقى على إنشاء الترتيبات المناسبة شرطا أساسيا للتجارب اللاحقة. التوبولين ، بطبيعته ، عرضة بشدة للتدهور حتى في البيئة الغنية بالجلسرين – GTP ، مما يؤدي إلى انخفاض القدرة على تكوين خيوط متجانسة. من الأهمية بمكان متابعة عملية التنقية والتحقق تجريبيا من قدرة التوبولين المخزن على البلمرة إلى خيوط منتظمة مستقرة. تم إدخال العديد من الطرق المستقلة للتحقق من حالة التوبولين في الجسم الحي وفي المختبر. من بين أبرزها ، مطيافية ثنائية اللون الدائرية27 ، مقايسة رنين البلازمون السطحي28 ، مقايسة التحول الحراري29 ، مقايسة تثبيط البلمرة30 ، تلطيخ التألق المناعي31,32 ، الترسيبالمشترك 22,33 وتحليل المجهر الإلكتروني النافذ32 يمكن ذكرها. من السهل إجراء مقايسة البلمرة والترسيب المشترك للتوبولين المستخدم في هذا البروتوكول. يمكن تقييمها بسرعة إما عن طريق الكريات التي تحدث في أسفل الأنبوب أو باستخدام SDS-PAGE. من ناحية أخرى ، يمكن أن يكون التوبولين المترسب في شكل مجاميع. يجب تضمين طرق أكثر تطورا ، مثل المجهر الإلكتروني النافذ ، لتأكيد وجود ألياف الأنابيب الدقيقة لمراقبة الجودة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ودعمت الدراسة وكالة التكنولوجيا في الجمهورية التشيكية (المشروع رقم. TN02000017 – المركز الوطني للتكنولوجيا الحيوية في الطب البيطري – NaCeBiVet).
Materials
| 1.5 mL tubes | — | — | Common material |
| 10 mL tubes | — | — | Common material |
| 50 mL tubes | — | — | Common material |
| ATP | ROTH | HN35.2 | Analytical grade |
| DMSO | ROTH | A994.2 | Analytical grade |
| Dounce glass homogenizer | P-LAB | H244043 | Homogenizer |
| DTT | ROTH | 6908.1 | Analytical grade |
| EGTA | ROTH | 3054.3 | Analytical grade |
| Ethanol | PENTA | 70390-11001 | Analytical grade |
| Glycerol | ROTH | 6967.2 | Analytical grade |
| Graduated beakers | — | — | Common equipment |
| Graduated cilinders | — | — | Common equipment |
| GTP | MERCK | 36051-31-7 | Very high quality |
| HCl | PENTA | 19360-11000 | Analytical grade |
| Izolated box for tissue transport | — | — | Common equipment |
| Kitchen blender | Waring | 7011HB | Glass or plastic vessel |
| Liquid nitrogen | — | — | Common material |
| MES | ROTH | 6066.4 | Analytical grade |
| MgCl2 | MERCK | 814733 | Analytical grade |
| MgSO4 | PENTA | 43180-31000 | Analytical grade |
| NaOH | PENTA | 15650-11000 | Analytical grade |
| Optima XPN100 | Beckman Coulter | A94469 | Ultracentrifuge |
| Phosphocellulose column | VWR | GENO786-1291 | Empty column |
| Phosphocellulose resin | Creative – Biomart, inc | Phosphate-001C | Ion exchange resin |
| PIPES | ROTH | 9156.2 | Analytical grade |
| Saccharose | PENTA | 24970-31000 | Analytical grade |
| Scales | — | — | Common equipment |
| Scissors | — | — | Common equipment |
| Spoons | — | — | Plastic or glass |
| Ti45 rotor | Beckman Coulter | 339160 | Rotor for Ultracentrifuge |
| Tweezers | — | — | Common equipment |
| Ultra turrax IKA T18 basic | IKA | 356 1000 | Laboratory dispenser |
| Water bath 37 °C | — | — | Stirred |
References
- Verhey, K. J., Gaertig, J. The tubulin code. Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).
- Murphy, D. B., Hiebsch, R. R. Purification of microtubule protein from beef brain and comparison of the assembly requirements for neuronal microtubules isolated from beef and hog. Anal Biochem. 96 (1), 225-235 (1979).
- Borisy, G. G., Marcum, J. M., Olmsted, J. B., Murphy, D. B., Johnson, K. A. Purification of tubulin and associated high molecular weight proteins from porcine brain and characterization of microtubule assembly in vitro. Ann NY Acad Sci. 253, 107-132 (1975).
- Weisenberg, R. C. Microtubule formation in vitro in solutions containing low calcium concentrations. Science. 177 (4054), 1104-1105 (1972).
- Roychowdhury, S., Gaskin, F. Separation of assembly-competent tubulin from brain microtubule protein preparations using a fast-performance liquid chromatography procedure. J Neurochem. 46 (5), 1399-1405 (1986).
- Weingarten, M. D., Suter, M. M., Littman, D. R., Kirschner, M. W. Properties of the depolymerization products of microtubules from mammalian brain. Biochemistry. 13 (27), 5529-5537 (1974).
- Souphron, J., et al. Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles. Nat Protoc. 14 (5), 1634-1660 (2019).
- Jacobs, M., Huitorel, P. Tubulin-associated nucleoside diphosphokinase. Eur J Biochem. 99 (3), 613-622 (1979).
- Munguía, B., et al. Purification of native M. vogae and H. contortus tubulin by TOG affinity chromatography. Exp Parasitol. 182, 37-44 (2017).
- Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein ExpPurif. 32 (1), 83-88 (2003).
- Minoura, I., et al. Overexpression, purification, and functional analysis of recombinant human tubulin dimer. FEBS Lett. 587 (21), 3450-3455 (2013).
- Liu, C., Yao, J., Yin, J., Xue, J., Zhang, H. Recombinant α- and β-tubulin from Echinococcus granulosus: Expression, purification and polymerization. Parasite. 25, 62 (2018).
- Ti, S. -. C., Wieczorek, M., Kapoor, T. M. Purification of affinity tag-free recombinant tubulin from insect cells. STAR protoc. 1 (1), 100011 (2020).
- Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Janke, C., Magiera, M. M. Purification of tubulin with controlled post-translational modifications and isotypes from limited sources by polymerization-depolymerization cycles. JVisExp. (165), e61826 (2020).
- Sackett, D. L., Werbovetz, K. A., Morrissette, N. S. Isolating tubulin from nonneural sources. Methods Cell Biol. 95, 17-32 (2010).
- Modig, C., Strömberg, E., Wallin, M. Different stability of posttranslationally modified brain microtubules isolated from cold-temperate fish. Mol Cell Biochem. 130 (2), 137-147 (1994).
- Fourest-Lieuvin, A. Purification of tubulin from limited volumes of cultured cells. Protein Exp Purif. 45 (1), 183-190 (2006).
- MacRae, T. H., Gull, K. Purification and assembly in vitro of tubulin from Trypanosoma brucei. Biochem J. 265 (1), 87-93 (1990).
- Jansen, S., et al. Quantitative mapping of microtubule-associated protein 2c (MAP2c) phosphorylation and regulatory protein 14-3-3ζ-binding sites reveals key differences between MAP2c and its homolog Tau. JBiol Chem. 292 (24), 3-3 (2017).
- Melková, K., et al. Structure and functions of microtubule associated proteins Tau and MAP2c: Similarities and differences. Biomolecules. 9 (3), E105 (2019).
- Herzog, W., Weber, K. Fractionation of brain microtubule-associated proteins: Isolation of two different proteins which stimulate tubulin polymerization in vitro. Eur J Biochem. 92 (1), 1-8 (1978).
- Castle, A. G., Crawford, N. Isolation of tubulin from pig platelets. FEBS Lett. 51 (1), 195-200 (1975).
- Wloga, D., Joachimiak, E., Fabczak, H. Tubulin post-translational modifications and microtubule dynamics. Int J Mol Sci. 18 (10), E2207 (2017).
- Lafanechère, L., Job, D. The third tubulin pool. Neurochem Res. 25 (1), 11-18 (2000).
- Arai, T., Ihara, Y., Arai, K., Kaziro, Y. Purification of tubulin from bovine brain and its interaction with guanine nucleotides. J Biochem. 77 (3), 647-658 (1975).
- Mahaddalkar, T., et al. Structural investigations into the binding mode of a novel noscapine analogue, 9-(4-vinylphenyl) noscapine, with tubulin by biochemical analyses and molecular dynamic simulations. J Biomol Struct Dyn. 35 (11), 2475-2484 (2017).
- Chen, H., et al. Structure-activity relationship study of novel 6-Aryl-2-benzoyl-pyridines as tubulin polymerization inhibitors with potent antiproliferative properties. J Med Chem. 63 (2), 827-846 (2020).
- Yao, D., et al. Ferulin C triggers potent PAK1 and p21-mediated anti-tumor effects in breast cancer by inhibiting Tubulin polymerization in vitro and in vivo. Pharmacol Res. 152, 104605 (2020).
- Sweetnam, P. M., et al. The role of receptor binding in drug discovery. JNat Prod. 56 (4), 441-455 (1993).
- Qi, Z. -. Y., et al. Synthesis and biological evaluation of 1-(benzofuran-3-yl)-4-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-1H-1,2,3-triazole derivatives as tubulin polymerization inhibitors. Bioorg Chem. 94, 103392 (2020).
- Sáez-Calvo, G., et al. Triazolopyrimidines are microtubule-stabilizing agents that bind the vinca inhibitor site of tubulin. Cell Chem Bio. 24 (6), 737-750 (2017).
- Bellocq, C., et al. Purification of assembly-competent tubulin from Saccharomyces cerevisiae. EurJ Biochem. 210 (1), 343-349 (1992).
