Este protocolo describe una técnica para el aislamiento de alto rendimiento de tubulina del cerebro porcino optimizada para instrumentación a pequeña escala. Los procedimientos de aislamiento se complementan con procedimientos para determinar la actividad de polimerización de la tubulina in vitro mediante ensayos de cosedimentación y microscopía electrónica de transmisión.
El tejido neural de cualquier fuente es un material excelente para el aislamiento de tubulina, ya que las dendritas y los axones de las neuronas son ricos en microtúbulos. Aquí, presentamos un procedimiento para extraer tubulina que se puede emplear, con pequeñas modificaciones, para el tejido neural de múltiples fuentes. En el protocolo presentado, se ha introducido un nuevo paso de clarificación del lisado de crudo, lo que condujo a una reducción significativa en la cantidad inicial de desechos insolubles antes de que ocurriera el primer paso de polimerización. Este paso adicional permitió el procesamiento de tejido adicional utilizando la misma instrumentación y, por lo tanto, aumentando el volumen relativo del homogeneizado procesado. El paso recién introducido no tiene un efecto significativo en la calidad de la tubulina purificada, como lo confirman los ensayos de actividad in vitro y la microscopía electrónica de transmisión. El procedimiento descrito contiene todos los pasos cruciales, incluida la recolección de tejidos, el transporte, la homogeneización de tejidos, los ciclos de aislamiento de tubulina y el pulido final mediante cromatografía de intercambio iónico mediante FPLC y ensayos de medición de actividad posteriores. La homogeneidad de la tubulina purificada fue superior al 97%, como se confirmó mediante el análisis MS/MS utilizando ionización por electrospray y MALDI-TOF.
Los microtúbulos, filamentos de proteínas huecas (24 nm de diámetro) formados por heterodímeros de alfa y beta-tubulina, participan en diversos procesos celulares esenciales. Participan en la formación de estructuras intracelulares, la motilidad, la división celular, la diferenciación celular, el transporte celular, el mantenimiento de la forma y la secreción1. Las funciones celulares de los microtúbulos pueden verse afectadas por interacciones directas o indirectas con proteínas asociadas a microtúbulos (MAP) y otras proteínas , o a través de complejas modificaciones postraduccionales definidas en el código de tubulina2.
Las fibras de tubulina surgen de interacciones dinámicas no covalentes entre subunidades alfa y beta en el mecanismo de nucleación-elongación. Se forman microtúbulos cortos, y el crecimiento posterior de las fibras de tubulina se logra mediante elongación reversible en ambos extremos, formando cilindros formados por heterodímeros de tubulina dispuestos en protofilamentos paralelos2. La inestabilidad dinámica se refiere al hecho de que los microtúbulos ensamblados a menudo no están en equilibrio con sus subunidades, pero pueden sufrir una transición de fase entre un período prolongado de crecimiento y contracción mientras se mantiene un estado estacionario 1,2.
La inestabilidad dinámica de las fibras de tubulina se utiliza principalmente en muchos procedimientos de separación y purificación de tubulina que utilizan ciclos de polimerización a alta temperatura y despolimerización a baja temperatura en el entorno de glicerol de alta pureza, DMSO, GTP / ATP, Mg2+ u otros agentes químicos (como taxol o policationes)3. La mayoría de los procedimientos de separación4 son seguidos por cromatografía de proteínas 5,6,7,8,9, que asegura la separación de las proteínas asociadas a la tubulina con actividad de nucleósido difosfoquinasa y ATPasa 5. Se pueden obtener resultados similares utilizando tampones con alto contenido de sal10. Para el fraccionamiento se utilizaron múltiples fuentes, incluyendo tejidos neuronales 11,12,13,14 y no neurales 15, peces16 (tanto de agua dulce como marinos), levaduras o variantes recombinantes17 sobreexpresadas en diferentes cepas de producción 11,12,13,14, y otras fuentes 9,18 y otras fuentes 9,18 purificación.
El protocolo presentado utiliza precipitación y cromatografía de proteínas para aislar la tubulina del cerebro porcino en alta homogeneidad (Figura 1). La principal ventaja es un rendimiento relativamente alto logrado con la instrumentación disponible en laboratorios equipados para experimentos rutinarios de biología molecular.
El tejido neural de cualquier fuente es un excelente material para el aislamiento de tubulina, ya que las dendritas y axones de las neuronas son ricos en microtúbulos (hasta un 40%)23. El tejido cerebral se puede obtener con relativa facilidad en cantidades suficientes. La principal desventaja podría ser un nivel no especificado de modificaciones postraduccionales, que pueden afectar a los experimentos posteriores24,25. De lo contrario, la única preocupación es la rápida degradación del material de partida, especialmente en condiciones cálidas. Empleamos varios intercambios de tampón de transferencia para mejorar la disipación de calor antes del transporte y el transporte rápido para el procesamiento, que comienza lo antes posible. El tejido fresco se disecciona en condiciones que impiden el calentamiento y se homogeneiza en un tampón que contiene GTP y glicerol, que estabiliza aún más la tubulina26.
En el protocolo presentado, se ha introducido la etapa de clarificación (paso 3.2.7) del lisado crudo. Por lo general, no se recomienda la centrifugación prolongada antes de la primera polimerización debido a la susceptibilidad de la tubulina a modificaciones irreversibles y proteasas. Por otro lado, los experimentos presentes demostraron que un giro corto con una fuerza G alta reduce los desechos y, por lo tanto, aumenta el volumen relativo del homogeneizado procesado sin afectar significativamente la calidad de la tubulina.
La determinación exacta de la concentración de proteínas es esencial para experimentos posteriores, principalmente cuando se estudian las interacciones con proteínas de unión a la tubulina o inhibidores. Durante las investigaciones, encontramos diferencias significativas en los resultados de los ensayos de concentración de proteínas. La razón principal fue la presencia de DTT, GTP y ATP en altas concentraciones que interferían con los ensayos. El ensayo BCA se desplazó a los límites superiores debido a la alta cantidad de DTT en el tampón de almacenamiento, lo que disminuyó la capacidad del ensayo. Además, los máximos de absorbancia similares de las proteínas y el ATP o GTP causaron inconsistencias en la determinación de la concentración de proteínas utilizando la absorbancia a 280 nm. El mismo problema se notó en las lecturas del detector UV FPLC. El ensayo más fiable, con resultados estables, fue el ensayo de proteínas de Bradford, en el que no se observó ninguna influencia de los compuestos tampón. No obstante, es esencial preparar la serie de dilución estándar de proteínas en el tampón de almacenamiento.
La capacidad de la tubulina purificada para crear arreglos apropiados es un requisito previo para experimentos posteriores. La tubulina es, por naturaleza, muy propensa a la degradación incluso en el entorno rico en glicerol-GTP, lo que resulta en una capacidad reducida para formar filamentos homogéneos. Es fundamental seguir el proceso de purificación y verificar experimentalmente la capacidad de la tubulina almacenada para polimerizar en filamentos regulares estables. Se han introducido varios métodos independientes que verifican el estado de la tubulina in vivo e in vitro. Entre los más destacados, el espectroscopía de dicroísmo circular27, el ensayo de resonancia de plasmón de superficie28, el ensayo de desplazamiento térmico29, el ensayo de inhibición de la polimerización30, la tinción de inmunofluorescencia31,32, la coprecipitación22,33 y el análisis de microscopio electrónico de transmisión32 se puede mencionar. El ensayo de polimerización y coprecipitación de tubulina utilizado en este protocolo es fácil de realizar. Pueden evaluarse rápidamente mediante los gránulos que se encuentran en el fondo del tubo o mediante SDS-PAGE. Por otro lado, la tubulina precipitada puede presentarse en forma de agregados. Se deben incluir métodos más sofisticados, como la microscopía electrónica de transmisión, para confirmar la presencia de fibras de microtúbulos para el control de calidad.
The authors have nothing to disclose.
El estudio contó con el apoyo de la Agencia de Tecnología de la República Checa (proyecto nr. TN02000017 – Centro Nacional de Biotecnología en Medicina Veterinaria – NaCeBiVet).
1.5 mL tubes | — | — | Common material |
10 mL tubes | — | — | Common material |
50 mL tubes | — | — | Common material |
ATP | ROTH | HN35.2 | Analytical grade |
DMSO | ROTH | A994.2 | Analytical grade |
Dounce glass homogenizer | P-LAB | H244043 | Homogenizer |
DTT | ROTH | 6908.1 | Analytical grade |
EGTA | ROTH | 3054.3 | Analytical grade |
Ethanol | PENTA | 70390-11001 | Analytical grade |
Glycerol | ROTH | 6967.2 | Analytical grade |
Graduated beakers | — | — | Common equipment |
Graduated cilinders | — | — | Common equipment |
GTP | MERCK | 36051-31-7 | Very high quality |
HCl | PENTA | 19360-11000 | Analytical grade |
Izolated box for tissue transport | — | — | Common equipment |
Kitchen blender | Waring | 7011HB | Glass or plastic vessel |
Liquid nitrogen | — | — | Common material |
MES | ROTH | 6066.4 | Analytical grade |
MgCl2 | MERCK | 814733 | Analytical grade |
MgSO4 | PENTA | 43180-31000 | Analytical grade |
NaOH | PENTA | 15650-11000 | Analytical grade |
Optima XPN100 | Beckman Coulter | A94469 | Ultracentrifuge |
Phosphocellulose column | VWR | GENO786-1291 | Empty column |
Phosphocellulose resin | Creative – Biomart, inc | Phosphate-001C | Ion exchange resin |
PIPES | ROTH | 9156.2 | Analytical grade |
Saccharose | PENTA | 24970-31000 | Analytical grade |
Scales | — | — | Common equipment |
Scissors | — | — | Common equipment |
Spoons | — | — | Plastic or glass |
Ti45 rotor | Beckman Coulter | 339160 | Rotor for Ultracentrifuge |
Tweezers | — | — | Common equipment |
Ultra turrax IKA T18 basic | IKA | 356 1000 | Laboratory dispenser |
Water bath 37 °C | — | — | Stirred |