Инфекция первичных эпителиальных клеток носа, выращенных на границе воздух-жидкость, для характеристики взаимодействия коронавируса человека с хозяином
Summary
Эпителий носа является основным барьерным узлом, с которым сталкиваются все респираторные патогены. В этой статье мы опишем методы использования первичных эпителиальных клеток носа, выращенных в качестве культур границы раздела воздух-жидкость (ALI), для характеристики взаимодействия коронавируса человека с хозяином в физиологически значимой системе.
Abstract
За последние 20 лет появились три высокопатогенных коронавируса человека (HCoV) – SARS-CoV (2002 г.), MERS-CoV (2012 г.) и SARS-CoV-2 (2019 г.), которые вызвали серьезные кризисы в области общественного здравоохранения. Еще четыре HCoV вызывают значительную часть случаев простуды каждый год (HCoV-NL63, -229E, -OC43 и -HKU1), что подчеркивает важность изучения этих вирусов в физиологически значимых системах. HCoV проникают в дыхательные пути и создают инфекцию в эпителии носа, который является основным местом, с которым сталкиваются все респираторные патогены. Мы используем систему культивирования первичного эпителия носа, в которой образцы носа, взятые у пациентов, выращиваются на границе воздух-жидкость (ALI) для изучения взаимодействия патогена-хозяина в этом важном дозорном участке. Эти культуры повторяют многие особенности дыхательных путей in vivo , включая присутствующие типы клеток, функцию цилиарных мышц и выработку слизи. Мы описываем методы характеристики репликации вируса, тропизма клеток хозяина, вирус-индуцированной цитотоксичности и врожденной иммунной индукции в назальных культурах ALI после инфекции HCoV, используя в качестве примера недавнюю работу, сравнивающую летальные и сезонные HCoV в качестве примера1. Более глубокое понимание взаимодействий между хозяином и патогеном в носу может стать новыми мишенями для противовирусной терапии против HCoV и других респираторных вирусов, которые, вероятно, появятся в будущем.
Introduction
На сегодняшний день выявлено семь коронавирусов человека (HCoV), вызывающих целый ряд респираторных заболеваний2. Распространенные или сезонные HCoV (HCoV-NL63, -229E, -OC43 и -HKU1) обычно связаны с патологией верхних дыхательных путей и вызывают примерно 10–30% случаев простуды ежегодно. Несмотря на то, что это типичный клинический фенотип, ассоциированный с распространенным HCoV, эти вирусы могут вызывать более серьезные заболевания нижних дыхательных путей в группах риска, включая детей, пожилых людей и лиц с ослабленным иммунитетом 3,4. За последние 20 лет появились три патогенных HCoV, которые вызвали серьезные чрезвычайные ситуации в области общественного здравоохранения, включая тяжелый острый респираторный синдром (SARS)-CoV, ближневосточный респираторный синдром (MERS)-CoV и SARS-CoV-2. Летальные ГЦОФ ассоциируются с более тяжелой патологией дыхательных путей, что наглядно демонстрируется коэффициентом летальности >34%, связанным с БВРС-КоВ (894 случая смерти из более чем 2 500 случаев с момента его появления в 2012 г.)5,6. Важно отметить, что смертельные ГЦОФ также вызывают целый ряд заболеваний дыхательных путей, от бессимптомных инфекций до смертельной пневмонии, как это видно на примере продолжающейся пандемии COVID-197.
HCoV, как и другие респираторные возбудители, проникают в дыхательные пути и устанавливают продуктивную инфекцию в эпителии носа8. Считается, что распространение в нижние дыхательные пути связано с аспирацией из ротовой/носовой полости в легкие, где HCoV вызывают более выраженную патологию нижних дыхательных путей 9,10,11. Таким образом, нос служит начальными воротами для проникновения вируса и является основным барьером для инфекции благодаря своему надежному механизму мукоцилиарного клиренса и уникальным врожденным иммунным механизмам, направленным на предотвращение дальнейшего распространения вируса в нижние дыхательные пути12,13. Например, сообщалось, что эпителиальные клетки носа экспрессируют более высокие, чем в среднем, базальные уровни противовирусных интерферонов и интерферон-стимулированных генов, что указывает на то, что клетки носа могут быть подготовлены к раннему ответу на респираторные вирусы14,15,16.
Ранее мы использовали первичные эпителиальные клетки носа, полученные от пациентов, выращенные на границе раздела воздух-жидкость (ALI), для моделирования взаимодействия HCoV и хозяина в носу, где начинаются инфекции HCoV. Назальные бактериологические исследования ALI являются допускающими как патогенные (SARS-CoV-2 и MERS-CoV), так и распространенные HCoV (HCoV-NL63 и HCoV-229E) и обладают различными преимуществами по сравнению с традиционными линиями эпителиальных клеток дыхательных путей, такими как A549 (клеточная линия аденокарциномы легкого)16,17. После дифференцировки назальные культуры ALI содержат гетерогенную клеточную популяцию и демонстрируют многие функции, ожидаемые от эпителия носа in vivo, такие как механизм мукоцилиарного клиренса18. Клетки носа также имеют преимущества по сравнению с системами культивирования нижних дыхательных путей (такими как эпителиальные клетки бронхов человека, HBECs), поскольку получение эпителиальных клеток носа с помощью цитологической чистки является значительно менее инвазивным по сравнению с использованием таких методов, как бронхоскопия для получения HBECs 19,20,21.
В данной работе описаны методы использования этой назальной системы культивирования ALI для характеристики взаимодействия HCoV с хозяином в эпителии носа. Мы применили эти методы в недавно опубликованных работах для сравнения SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 и HCoV-229E 1,16,17. Несмотря на то, что эти методы и репрезентативные результаты подчеркивают важность изучения HCoV в этой модели клеток носа, система легко адаптируется к другим HCoV, а также к другим респираторным патогенам. Кроме того, эти методы могут быть более широко применены к другим системам культивирования ALI для изучения репликации вируса и клеточного тропизма, а также цитотоксичности и индукции врожденного иммунитета после инфекции.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методы, подробно описанные здесь, описывают систему культивирования первичного эпителия, в которой эпителиальные клетки носа, полученные от пациентов, выращиваются на границе раздела воздух-жидкость и применяются для изучения взаимодействий HCoV с хозяином. После дифференцировки эти н…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансируется следующими источниками: Национальные институты здравоохранения (NIH) R01AI 169537 (S.R.W. и N.A.C.), NIH R01AI 140442 (S.R.W.), VA Merit Review CX001717 (N.A.C.), VA Merit Review BX005432 (S.R.W. и N.A.C.), Пенсильванский центр исследований коронавирусов и других новых патогенов (S.R.W.), Фонд Лаффи-Макхью (S.R.W. и N.A.C.), T32 AI055400 (CJO), T32 AI007324 (AF).
Materials
| Alexa Fluor secondary antibodies (488, 594, 647) | Invitrogen | Various | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Cytotoxicity detection kit | Roche | 11644793001 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | Gibco | 11965-084 | |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco | 14190136 | |
| DPBS + calcium + magnesium | Gibco | 14040-117 | |
| Endohm-6G measurement chamber | World Precision Instruments | ENDOHM-6G | |
| Epithelial cell adhesion marker (EpCAM; CD326) | eBiosciences | 14-9326-82 | |
| Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM) | World Precision Instruments | 300523 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | HyClone | SH30071.03 | |
| FV10-ASW software for imaging | Olympus | Version 4.02 | |
| HCoV-NL63 (Human coronavirus, NL63) | BEI Resources | NR-470 | |
| HCoV-NL63 nucleocapsid antibody | Sino Biological | 40641-V07E | |
| Hoescht stain | Thermo Fisher | H3570 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BIO-RAD | 1610747 | |
| LLC-MK2 cells | ATCC | CCL-7 | To titrate HCoV-NL63 |
| MERS-CoV (Human coronavirus, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), EMC/2012) | BEI Resources | NR-44260 | |
| MERS-CoV nucleocapsid antibody | Sino Biological | 40068-MM10 | |
| MUC5AC antibody | Sigma-Aldrich | AMAB91539 | |
| Olympus Fluoview confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Phalloidin-iFluor 647 stain | Abcam | ab176759 | |
| PhosStop easy pack (phosphatase inhibitors) | Roche | PHOSS-RO | |
| Plate reader | Perkin Elmer | HH34000000 | Any plate reader or ELISA reader is sufficient; must be able to read absorbance at 492 nm |
| RIPA buffer (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0.5% deoxycholate; 0.1% SDS; 1% NP40) | Thermo Fisher | 89990 | Can prep in-house or purchase |
| RNeasy Plus Kit | Qiagen | 74134 | |
| SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020) | BEI Resources | NR-52281 | |
| SARS-CoV-2 nucleocapsid antibody | Genetex | GTX135357 | |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151100 | |
| Type IV β- tubulin antibody | Abcam | ab11315 | |
| VeroCCL81 cells | ATCC | CCL-81 | To titrate MERS-CoV |
| VeroE6 cells | ATCC | CRL-1586 | To titrate SARS-CoV-2 |
References
- Otter, C. J., et al. Infection of primary nasal epithelial cells differentiates among lethal and seasonal human coronaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (15), 2218083120 (2023).
- Fehr, A., Perlman, S. Coronaviruses: An overview of their replication and pathogenesis. Methods in Molecular Biology. 1282, 1-23 (2015).
- Gaunt, E. R., Hardie, A., Claas, E. C. J., Simmonds, P., Templeton, K. E. Epidemiology and clinical presentations of the four human coronaviruses 229E, HKU1, NL63, and OC43 detected over 3 years using a novel multiplex real-time PCR method. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2940-2947 (2010).
- Kesheh, M. M., Hosseini, P., Soltani, S., Zandi, M. An overview on the seven pathogenic human coronaviruses. Reviews in Medical Virology. 32 (2), 2282 (2022).
- MERS-CoV Worldwide Overview. European Centre for Disease Prevention and Control Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/middle-east-respiratory-syndrome-coronavirus-mers-cov-situation-update (2022)
- Cao, Y., Liu, X., Xiong, L., Cai, K. Imaging and clinical features of patients with 2019 novel coronavirus SARS-CoV-2: A systematic review and meta-analysis. Journal of Medical Virology. 92 (9), 1449-1459 (2020).
- Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: Soldier in the fight against respiratory viruses. Clinical Microbiology Reviews. 24 (1), 210-229 (2011).
- Farzal, Z., et al. Comparative study of simulated nebulized and spray particle deposition in chronic rhinosinusitis patients. International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 746-758 (2019).
- Gaeckle, N. T., Pragman, A. A., Pendleton, K. M., Baldomero, A. K., Criner, G. J. The oral-lung axis: The impact of oral health on lung health. Respiratory Care. 65 (8), 1211-1220 (2020).
- Hou, Y., et al. SARS-CoV-2 reverse genetics reveals a variable infection gradient in the respiratory tract. Cell. 182, 429-446 (2020).
- Hariri, B. M., Cohen, N. A. New insights into upper airway innate immunity. American Journal of Rhinology and Allergy. 30 (5), 319-323 (2016).
- Hiemstra, P. S., McCray, P. B., Bals, R. The innate immune function of airway epithelial cells in inflammatory lung disease. European Respiratory Journal. 45 (4), 1150-1162 (2015).
- Hatton, C. F., et al. Delayed induction of type I and III interferons mediates nasal epithelial cell permissiveness to SARS-CoV-2. Nature Communications. 12 (1), 7092 (2021).
- Sungnak, W., et al. SARS-CoV-2 entry factors are highly expressed in nasal epithelial cells together with innate immune genes. Nature Medicine. 26 (5), 681-687 (2020).
- Li, Y., et al. SARS-CoV-2 induces double-stranded RNA-mediated innate immune responses in respiratory epithelial-derived cells and cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (16), 2022643118 (2021).
- Comar, C. E., et al. MERS-CoV endoribonuclease and accessory proteins jointly evade host innate immunity during infection of lung and nasal epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (21), 2123208119 (2022).
- Lee, R. J., et al. Bacterial D-amino acids suppress sinonasal innate immunity through sweet taste receptors in solitary chemosensory cells. Science Signaling. 10 (495), (2017).
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).
- Comer, D. M., Elborn, J. S., Ennis, M. Comparison of nasal and bronchial epithelial cells obtained from patients with COPD. PLoS One. 7 (3), e32924 (2012).
- Vanders, R. L., Hsu, A., Gibson, P. G., Murphy, V. E., Wark, P. A. B. Nasal epithelial cells to assess in vitro immune responses to respiratory virus infection in pregnant women with asthma. Respiratory Research. 20 (1), 259 (2019).
- Lee, R. J., et al. Fungal aflatoxins reduce respiratory mucosal ciliary function. Scientific Reports. 6, 33221 (2016).
- Patel, N. N., et al. Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis. International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: Using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e52065 (2014).
- Robinot, R., et al. SARS-CoV-2 infection induces the dedifferentiation of multiciliated cells and impairs mucociliary clearance. Nature Communications. 12 (1), 4354 (2021).
- Whitsett, J. A. Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance. Annals of the American Thoracic Society. 15, S143-S148 (2018).
- Gao, N., Raduka, A., Rezaee, F. Respiratory syncytial virus disrupts the airway epithelial barrier by decreasing cortactin and destabilizing F-actin. Journal of Cell Science. 135 (16), 259871 (2022).
- Schmidt, H., et al. IL-13 impairs tight junctions in airway epithelia. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3222 (2019).
- Huang, Z. Q., et al. Interleukin-13 alters tight junction proteins expression thereby compromising barrier function and dampens rhinovirus induced immune responses in nasal epithelium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 572749 (2020).
- Saatian, B., et al. Interleukin-4 and interleukin-13 cause barrier dysfunction in human airway epithelial cells. Tissue Barriers. 1 (2), e24333 (2013).
- Coles, J. L., et al. A revised protocol for culture of airway epithelial cells as a diagnostic tool for primary ciliary dyskinesia. Journal of Clinical Medicine. 9 (11), 3753 (2020).
- Baldassi, D., Gabold, B., Merkel, O. M. Air−liquid interface cultures of the healthy and diseased human respiratory tract: Promises, challenges, and future directions. Advanced NanoBiomed Research. 1 (6), 2000111 (2021).
- Seibold, M. A. Interleukin-13 stimulation reveals the cellular and functional plasticity of the airway epithelium. Annals of the American Thoracic Society. 15, S98-S106 (2018).
- Morrison, C. B., et al. SARS-CoV-2 infection of airway cells causes intense viral and cell shedding, two spreading mechanisms affected by IL-13. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (16), 2119680119 (2022).
