Infectie van primaire neusepitheelcellen gekweekt op een lucht-vloeistofinterface om menselijke interacties tussen coronavirus en gastheer te karakteriseren
Summary
Het neusepitheel is de primaire barrièreplaats waar alle respiratoire pathogenen voorkomen. Hier schetsen we methoden om primaire neusepitheelcellen te gebruiken die zijn gekweekt als lucht-vloeistofinterface (ALI)-culturen om menselijke interacties tussen coronavirus en gastheer in een fysiologisch relevant systeem te karakteriseren.
Abstract
Drie hoogpathogene menselijke coronavirussen (HCoV’s) – SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012) en SARS-CoV-2 (2019) – zijn ontstaan en hebben de afgelopen 20 jaar aanzienlijke volksgezondheidscrises veroorzaakt. Vier extra HCoV’s veroorzaken elk jaar een aanzienlijk deel van de verkoudheidsgevallen (HCoV-NL63, -229E, -OC43 en -HKU1), wat het belang benadrukt van het bestuderen van deze virussen in fysiologisch relevante systemen. HCoV’s komen de luchtwegen binnen en brengen een infectie tot stand in het neusepitheel, de primaire plaats waar alle respiratoire pathogenen worden aangetroffen. We gebruiken een primair neusepitheelkweeksysteem waarin van patiënten afkomstige neusmonsters worden gekweekt op een lucht-vloeistofinterface (ALI) om gastheer-pathogeen interacties op deze belangrijke schildwachtplaats te bestuderen. Deze culturen recapituleren vele kenmerken van de in vivo luchtwegen, waaronder de aanwezige celtypen, ciliaire functie en slijmproductie. We beschrijven methoden om virale replicatie, gastheerceltropisme, virusgeïnduceerde cytotoxiciteit en aangeboren immuuninductie in nasale ALI-culturen na HCoV-infectie te karakteriseren, met behulp van recent werk waarin letale en seizoensgebonden HCoV’s als voorbeeldworden vergeleken 1. Een beter begrip van gastheer-pathogeen interacties in de neus heeft het potentieel om nieuwe doelen te bieden voor antivirale therapieën tegen HCoV’s en andere respiratoire virussen die waarschijnlijk in de toekomst zullen opduiken.
Introduction
Tot op heden zijn zeven menselijke coronavirussen (HCoV’s) geïdentificeerd die een reeks aandoeningen van de luchtwegen veroorzaken2. De veel voorkomende of seizoensgebonden HCoV’s (HCoV-NL63, -229E, -OC43 en -HKU1) worden doorgaans geassocieerd met pathologie van de bovenste luchtwegen en veroorzaken jaarlijks naar schatting 10%-30% van de verkoudheidsgevallen. Hoewel dit het typische klinische fenotype is dat geassocieerd wordt met de veel voorkomende HCoV’s, kunnen deze virussen een significantere ziekte van de onderste luchtwegen veroorzaken bij risicopopulaties, waaronder kinderen, oudere volwassenen en immuungecompromitteerdepersonen. Drie pathogene HCoV’s zijn de afgelopen 20 jaar ontstaan en hebben aanzienlijke noodsituaties op het gebied van de volksgezondheid veroorzaakt, waaronder ernstig acuut respiratoir syndroom (SARS)-CoV, Middle East respiratory syndrome (MERS)-CoV en SARS-CoV-2. Dodelijke HCoV’s worden in verband gebracht met ernstigere pathologie van de luchtwegen, wat duidelijk wordt geïllustreerd door het sterftecijfer van >34% geassocieerd met MERS-CoV-gevallen (894 sterfgevallen op meer dan 2.500 gevallen sinds de opkomst in 2012)5,6. Het is belangrijk op te merken dat de dodelijke HCoV’s ook een reeks aandoeningen van de luchtwegen veroorzaken, van asymptomatische infecties tot dodelijke longontsteking, zoals te zien is bij de aanhoudende COVID-19-pandemie7.
HCoV’s komen, net als andere respiratoire pathogenen, de luchtwegen binnen en vestigen een productieve infectie in het neusepitheel8. Verspreiding naar de onderste luchtwegen wordt verondersteld geassocieerd te zijn met aspiratie van de mond-/neusholte naar de long, waar HCoV’s een significantere pathologie van de onderste luchtwegen veroorzaken 9,10,11. De neus dient dus als het eerste portaal voor het binnendringen van virussen en is de primaire barrière tegen infectie met zijn robuuste mucociliaire klaringsmachinerie en unieke aangeboren immuunmechanismen die gericht zijn op het voorkomen van verdere virale verspreiding naar de lagere luchtwegen12,13. Van neusepitheelcellen is bijvoorbeeld gemeld dat ze hogere dan gemiddelde basale niveaus van antivirale interferonen en interferon-gestimuleerde genen tot expressie brengen, wat aangeeft dat neuscellen mogelijk voorbereid zijn op vroege reacties op respiratoire virussen14,15,16.
We hebben eerder van patiënten afgeleide primaire neusepitheelcellen gebruikt die zijn gekweekt op een lucht-vloeistofinterface (ALI) om HCoV-gastheerinteracties in de neus te modelleren, waar HCoV-infecties beginnen. Nasale ALI-culturen zijn tolerant voor zowel pathogene (SARS-CoV-2 en MERS-CoV) als veel voorkomende HCoV’s (HCoV-NL63 en HCoV-229E) en bieden verschillende voordelen ten opzichte van traditionele luchtwegepitheelcellijnen zoals A549 (een longadenocarcinoomcellijn)16,17. Na differentiatie bevatten nasale ALI-culturen een heterogene cellulaire populatie en vertonen ze veel van de functies die van het in vivo neusepitheel worden verwacht, zoals mucociliaireklaringsmachines18. Neuscellen bieden ook voordelen ten opzichte van kweeksystemen van de lagere luchtwegen (zoals menselijke bronchiale epitheelcellen, HBEC’s), aangezien de verwerving van neusepitheelcellen via cytologisch poetsen aanzienlijk minder invasief is in vergelijking met het gebruik van technieken zoals bronchoscopie voor het bereiken van HBEC’s 19,20,21.
Dit artikel beschrijft methoden voor het gebruik van dit nasale ALI-kweeksysteem om HCoV-gastheerinteracties in het neusepitheel te karakteriseren. We hebben deze methoden toegepast in recent gepubliceerde werken om SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 en HCoV-229E 1,16,17 te vergelijken. Hoewel deze methoden en representatieve resultaten de nadruk leggen op de studie van HCoV’s in dit neuscelmodel, is het systeem zeer aanpasbaar aan andere HCoV’s en andere respiratoire pathogenen. Verder kunnen deze methoden breder worden toegepast op andere ALI-kweeksystemen om virale replicatie en cellulair tropisme te onderzoeken, evenals cytotoxiciteit en aangeboren immuuninductie na infectie.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven methoden beschrijven een primair epitheelkweeksysteem waarin van de patiënt afgeleide neusepitheelcellen worden gekweekt op een lucht-vloeistofinterface en worden toegepast op de studie van HCoV-gastheerinteracties. Eenmaal gedifferentieerd, recapituleren deze nasale ALI-culturen vele kenmerken van het in vivo neusepitheel, waaronder een heterogene cellulaire populatie met trilhaar-, beker- en basale cellen vertegenwoordigd, evenals intacte mucociliaire functie met robuust kloppende trilhaart…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie heeft de volgende financieringsbronnen: National Institutes of Health (NIH) R01AI 169537 (SRW en NAC), NIH R01AI 140442 (SRW), VA Merit Review CX001717 (NAC), VA Merit Review BX005432 (S.R.W. en NAC), Penn Center for Research on Coronaviruses and other Emerging Pathogens (SRW), Laffey-McHugh Foundation (SRW en NAC), T32 AI055400 (CJO), T32 AI007324 (AF).
Materials
| Alexa Fluor secondary antibodies (488, 594, 647) | Invitrogen | Various | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Cytotoxicity detection kit | Roche | 11644793001 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | Gibco | 11965-084 | |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco | 14190136 | |
| DPBS + calcium + magnesium | Gibco | 14040-117 | |
| Endohm-6G measurement chamber | World Precision Instruments | ENDOHM-6G | |
| Epithelial cell adhesion marker (EpCAM; CD326) | eBiosciences | 14-9326-82 | |
| Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM) | World Precision Instruments | 300523 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | HyClone | SH30071.03 | |
| FV10-ASW software for imaging | Olympus | Version 4.02 | |
| HCoV-NL63 (Human coronavirus, NL63) | BEI Resources | NR-470 | |
| HCoV-NL63 nucleocapsid antibody | Sino Biological | 40641-V07E | |
| Hoescht stain | Thermo Fisher | H3570 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BIO-RAD | 1610747 | |
| LLC-MK2 cells | ATCC | CCL-7 | To titrate HCoV-NL63 |
| MERS-CoV (Human coronavirus, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), EMC/2012) | BEI Resources | NR-44260 | |
| MERS-CoV nucleocapsid antibody | Sino Biological | 40068-MM10 | |
| MUC5AC antibody | Sigma-Aldrich | AMAB91539 | |
| Olympus Fluoview confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Phalloidin-iFluor 647 stain | Abcam | ab176759 | |
| PhosStop easy pack (phosphatase inhibitors) | Roche | PHOSS-RO | |
| Plate reader | Perkin Elmer | HH34000000 | Any plate reader or ELISA reader is sufficient; must be able to read absorbance at 492 nm |
| RIPA buffer (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0.5% deoxycholate; 0.1% SDS; 1% NP40) | Thermo Fisher | 89990 | Can prep in-house or purchase |
| RNeasy Plus Kit | Qiagen | 74134 | |
| SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020) | BEI Resources | NR-52281 | |
| SARS-CoV-2 nucleocapsid antibody | Genetex | GTX135357 | |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151100 | |
| Type IV β- tubulin antibody | Abcam | ab11315 | |
| VeroCCL81 cells | ATCC | CCL-81 | To titrate MERS-CoV |
| VeroE6 cells | ATCC | CRL-1586 | To titrate SARS-CoV-2 |
References
- Otter, C. J., et al. Infection of primary nasal epithelial cells differentiates among lethal and seasonal human coronaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (15), 2218083120 (2023).
- Fehr, A., Perlman, S. Coronaviruses: An overview of their replication and pathogenesis. Methods in Molecular Biology. 1282, 1-23 (2015).
- Gaunt, E. R., Hardie, A., Claas, E. C. J., Simmonds, P., Templeton, K. E. Epidemiology and clinical presentations of the four human coronaviruses 229E, HKU1, NL63, and OC43 detected over 3 years using a novel multiplex real-time PCR method. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2940-2947 (2010).
- Kesheh, M. M., Hosseini, P., Soltani, S., Zandi, M. An overview on the seven pathogenic human coronaviruses. Reviews in Medical Virology. 32 (2), 2282 (2022).
- MERS-CoV Worldwide Overview. European Centre for Disease Prevention and Control Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/middle-east-respiratory-syndrome-coronavirus-mers-cov-situation-update (2022)
- Cao, Y., Liu, X., Xiong, L., Cai, K. Imaging and clinical features of patients with 2019 novel coronavirus SARS-CoV-2: A systematic review and meta-analysis. Journal of Medical Virology. 92 (9), 1449-1459 (2020).
- Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: Soldier in the fight against respiratory viruses. Clinical Microbiology Reviews. 24 (1), 210-229 (2011).
- Farzal, Z., et al. Comparative study of simulated nebulized and spray particle deposition in chronic rhinosinusitis patients. International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 746-758 (2019).
- Gaeckle, N. T., Pragman, A. A., Pendleton, K. M., Baldomero, A. K., Criner, G. J. The oral-lung axis: The impact of oral health on lung health. Respiratory Care. 65 (8), 1211-1220 (2020).
- Hou, Y., et al. SARS-CoV-2 reverse genetics reveals a variable infection gradient in the respiratory tract. Cell. 182, 429-446 (2020).
- Hariri, B. M., Cohen, N. A. New insights into upper airway innate immunity. American Journal of Rhinology and Allergy. 30 (5), 319-323 (2016).
- Hiemstra, P. S., McCray, P. B., Bals, R. The innate immune function of airway epithelial cells in inflammatory lung disease. European Respiratory Journal. 45 (4), 1150-1162 (2015).
- Hatton, C. F., et al. Delayed induction of type I and III interferons mediates nasal epithelial cell permissiveness to SARS-CoV-2. Nature Communications. 12 (1), 7092 (2021).
- Sungnak, W., et al. SARS-CoV-2 entry factors are highly expressed in nasal epithelial cells together with innate immune genes. Nature Medicine. 26 (5), 681-687 (2020).
- Li, Y., et al. SARS-CoV-2 induces double-stranded RNA-mediated innate immune responses in respiratory epithelial-derived cells and cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (16), 2022643118 (2021).
- Comar, C. E., et al. MERS-CoV endoribonuclease and accessory proteins jointly evade host innate immunity during infection of lung and nasal epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (21), 2123208119 (2022).
- Lee, R. J., et al. Bacterial D-amino acids suppress sinonasal innate immunity through sweet taste receptors in solitary chemosensory cells. Science Signaling. 10 (495), (2017).
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).
- Comer, D. M., Elborn, J. S., Ennis, M. Comparison of nasal and bronchial epithelial cells obtained from patients with COPD. PLoS One. 7 (3), e32924 (2012).
- Vanders, R. L., Hsu, A., Gibson, P. G., Murphy, V. E., Wark, P. A. B. Nasal epithelial cells to assess in vitro immune responses to respiratory virus infection in pregnant women with asthma. Respiratory Research. 20 (1), 259 (2019).
- Lee, R. J., et al. Fungal aflatoxins reduce respiratory mucosal ciliary function. Scientific Reports. 6, 33221 (2016).
- Patel, N. N., et al. Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis. International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: Using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e52065 (2014).
- Robinot, R., et al. SARS-CoV-2 infection induces the dedifferentiation of multiciliated cells and impairs mucociliary clearance. Nature Communications. 12 (1), 4354 (2021).
- Whitsett, J. A. Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance. Annals of the American Thoracic Society. 15, S143-S148 (2018).
- Gao, N., Raduka, A., Rezaee, F. Respiratory syncytial virus disrupts the airway epithelial barrier by decreasing cortactin and destabilizing F-actin. Journal of Cell Science. 135 (16), 259871 (2022).
- Schmidt, H., et al. IL-13 impairs tight junctions in airway epithelia. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3222 (2019).
- Huang, Z. Q., et al. Interleukin-13 alters tight junction proteins expression thereby compromising barrier function and dampens rhinovirus induced immune responses in nasal epithelium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 572749 (2020).
- Saatian, B., et al. Interleukin-4 and interleukin-13 cause barrier dysfunction in human airway epithelial cells. Tissue Barriers. 1 (2), e24333 (2013).
- Coles, J. L., et al. A revised protocol for culture of airway epithelial cells as a diagnostic tool for primary ciliary dyskinesia. Journal of Clinical Medicine. 9 (11), 3753 (2020).
- Baldassi, D., Gabold, B., Merkel, O. M. Air−liquid interface cultures of the healthy and diseased human respiratory tract: Promises, challenges, and future directions. Advanced NanoBiomed Research. 1 (6), 2000111 (2021).
- Seibold, M. A. Interleukin-13 stimulation reveals the cellular and functional plasticity of the airway epithelium. Annals of the American Thoracic Society. 15, S98-S106 (2018).
- Morrison, C. B., et al. SARS-CoV-2 infection of airway cells causes intense viral and cell shedding, two spreading mechanisms affected by IL-13. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (16), 2119680119 (2022).
