Infezione di cellule epiteliali nasali primarie cresciute in un'interfaccia aria-liquido per caratterizzare le interazioni uomo-coronavirus-ospite
Summary
L’epitelio nasale è il sito di barriera primario incontrato da tutti i patogeni respiratori. Qui, descriviamo i metodi per utilizzare le cellule epiteliali nasali primarie cresciute come colture di interfaccia aria-liquido (ALI) per caratterizzare le interazioni coronavirus-ospite umano in un sistema fisiologicamente rilevante.
Abstract
Negli ultimi 20 anni sono emersi tre coronavirus umani ad alta patogenicità (HCoV) – SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012) e SARS-CoV-2 (2019) – che hanno causato significative crisi di salute pubblica. Quattro HCoV aggiuntivi causano una parte significativa dei casi di raffreddore comune ogni anno (HCoV-NL63, -229E, -OC43 e -HKU1), evidenziando l’importanza di studiare questi virus in sistemi fisiologicamente rilevanti. Gli HCoV entrano nel tratto respiratorio e stabiliscono l’infezione nell’epitelio nasale, il sito primario incontrato da tutti i patogeni respiratori. Utilizziamo un sistema di coltura epiteliale nasale primaria in cui i campioni nasali derivati dal paziente vengono coltivati in un’interfaccia aria-liquido (ALI) per studiare le interazioni ospite-patogeno in questo importante sito sentinella. Queste colture ricapitolano molte caratteristiche delle vie aeree in vivo , compresi i tipi di cellule presenti, la funzione ciliare e la produzione di muco. Descriviamo i metodi per caratterizzare la replicazione virale, il tropismo della cellula ospite, la citotossicità indotta dal virus e l’induzione immunitaria innata in colture nasali di ALI a seguito di infezione da HCoV, utilizzando un recente lavoro che confronta HCoV letali e stagionali come esempio1. Una maggiore comprensione delle interazioni ospite-patogeno nel naso ha il potenziale per fornire nuovi bersagli per terapie antivirali contro HCoV e altri virus respiratori che probabilmente emergeranno in futuro.
Introduction
Ad oggi sono stati identificati sette coronavirus umani (HCoV) che causano una serie di malattie respiratorie2. Gli HCoV comuni o stagionali (HCoV-NL63, -229E, -OC43 e -HKU1) sono tipicamente associati alla patologia del tratto respiratorio superiore e causano circa il 10%-30% dei casi di raffreddore comuni ogni anno. Sebbene questo sia il tipico fenotipo clinico associato ai comuni HCoV, questi virus possono causare malattie più significative del tratto respiratorio inferiore nelle popolazioni a rischio, inclusi bambini, anziani e individui immunocompromessi 3,4. Negli ultimi 20 anni sono emersi tre HCoV patogeni che hanno causato significative emergenze di salute pubblica, tra cui la sindrome respiratoria acuta grave (SARS)-CoV, la sindrome respiratoria mediorientale (MERS)-CoV e SARS-CoV-2. Gli HCoV letali sono associati a una patologia del tratto respiratorio più grave, il che è chiaramente illustrato dal tasso di mortalità del >34% associato ai casi di MERS-CoV (894 decessi su oltre 2.500 casi dalla sua comparsa nel 2012)5,6. È importante notare che gli HCoV letali causano anche una serie di malattie del tratto respiratorio, dalle infezioni asintomatiche alla polmonite letale, come si è visto con la pandemia di COVID-19 in corso7.
Gli HCoV, come altri patogeni respiratori, entrano nel tratto respiratorio e stabiliscono un’infezione produttiva nell’epitelio nasale8. Si ritiene che la diffusione alle vie aeree inferiori sia associata all’aspirazione dalla cavità orale/nasale al polmone, dove gli HCoV causano una patologia più significativa del tratto respiratorio inferiore 9,10,11. Pertanto, il naso funge da portale iniziale per l’ingresso virale ed è la barriera primaria all’infezione con il suo robusto meccanismo di clearance mucociliare e meccanismi immunitari innati unici volti a prevenire un’ulteriore diffusione virale alle vie aeree inferiori12,13. Ad esempio, è stato riportato che le cellule epiteliali nasali esprimono livelli basali superiori alla media di interferoni antivirali e geni stimolati dall’interferone, indicando che le cellule nasali possono essere innescate per risposte precoci ai virus respiratori14,15,16.
In precedenza abbiamo utilizzato cellule epiteliali nasali primarie derivate da pazienti cresciute in un’interfaccia aria-liquido (ALI) per modellare le interazioni HCoV-ospite nel naso, dove iniziano le infezioni da HCoV. Le colture nasali di ALI sono permissive sia per gli HCoV patogeni (SARS-CoV-2 e MERS-CoV) che per quelli comuni (HCoV-NL63 e HCoV-229E) e offrono vari vantaggi rispetto alle tradizionali linee cellulari epiteliali delle vie aeree come A549 (una linea cellulare di adenocarcinoma polmonare)16,17. Dopo il differenziamento, le colture nasali di ALI contengono una popolazione cellulare eterogenea e presentano molte delle funzioni attese dall’epitelio nasale in vivo, come il meccanismo di clearance mucociliare18. Le cellule nasali offrono anche vantaggi rispetto ai sistemi di coltura delle vie aeree inferiori (come le cellule epiteliali bronchiali umane, HBEC), poiché l’acquisizione di cellule epiteliali nasali tramite spazzolamento citologico è significativamente meno invasiva rispetto all’utilizzo di tecniche come la broncoscopia per ottenere HBEC 19,20,21.
Questo documento descrive i metodi per l’utilizzo di questo sistema di coltura ALI nasale per caratterizzare le interazioni HCoV-ospite nell’epitelio nasale. Abbiamo applicato questi metodi in lavori pubblicati di recente per confrontare SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 e HCoV-229E 1,16,17. Sebbene questi metodi e risultati rappresentativi enfatizzino lo studio degli HCoV in questo modello di cellule nasali, il sistema è altamente adattabile ad altri HCoV, così come ad altri patogeni respiratori. Inoltre, questi metodi possono essere applicati in modo più ampio ad altri sistemi di coltura ALI al fine di studiare la replicazione virale e il tropismo cellulare, nonché la citotossicità e l’induzione immunitaria innata a seguito di infezione.
Protocol
Representative Results
Discussion
I metodi qui descritti descrivono un sistema di coltura epiteliale primaria in cui le cellule epiteliali nasali derivate dal paziente vengono coltivate ad un’interfaccia aria-liquido e applicate allo studio delle interazioni HCoV-ospite. Una volta differenziate, queste colture nasali di ALI ricapitolano molte caratteristiche dell’epitelio nasale in vivo, tra cui una popolazione cellulare eterogenea con cellule ciliate, caliciformi e basali rappresentate, nonché una funzione mucociliare intatta con ciglia e secrezione di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio ha le seguenti fonti di finanziamento: National Institutes of Health (NIH) R01AI 169537 (S.R.W. e N.A.C.), NIH R01AI 140442 (S.R.W.), VA Merit Review CX001717 (N.A.C.), VA Merit Review BX005432 (S.R.W. e N.A.C.), Penn Center for Research on Coronaviruses and other Emerging Pathogens (S.R.W.), Laffey-McHugh Foundation (S.R.W. e N.A.C.), T32 AI055400 (CJO), T32 AI007324 (AF).
Materials
| Alexa Fluor secondary antibodies (488, 594, 647) | Invitrogen | Various | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Cytotoxicity detection kit | Roche | 11644793001 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | Gibco | 11965-084 | |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco | 14190136 | |
| DPBS + calcium + magnesium | Gibco | 14040-117 | |
| Endohm-6G measurement chamber | World Precision Instruments | ENDOHM-6G | |
| Epithelial cell adhesion marker (EpCAM; CD326) | eBiosciences | 14-9326-82 | |
| Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM) | World Precision Instruments | 300523 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | HyClone | SH30071.03 | |
| FV10-ASW software for imaging | Olympus | Version 4.02 | |
| HCoV-NL63 (Human coronavirus, NL63) | BEI Resources | NR-470 | |
| HCoV-NL63 nucleocapsid antibody | Sino Biological | 40641-V07E | |
| Hoescht stain | Thermo Fisher | H3570 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BIO-RAD | 1610747 | |
| LLC-MK2 cells | ATCC | CCL-7 | To titrate HCoV-NL63 |
| MERS-CoV (Human coronavirus, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), EMC/2012) | BEI Resources | NR-44260 | |
| MERS-CoV nucleocapsid antibody | Sino Biological | 40068-MM10 | |
| MUC5AC antibody | Sigma-Aldrich | AMAB91539 | |
| Olympus Fluoview confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Phalloidin-iFluor 647 stain | Abcam | ab176759 | |
| PhosStop easy pack (phosphatase inhibitors) | Roche | PHOSS-RO | |
| Plate reader | Perkin Elmer | HH34000000 | Any plate reader or ELISA reader is sufficient; must be able to read absorbance at 492 nm |
| RIPA buffer (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0.5% deoxycholate; 0.1% SDS; 1% NP40) | Thermo Fisher | 89990 | Can prep in-house or purchase |
| RNeasy Plus Kit | Qiagen | 74134 | |
| SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020) | BEI Resources | NR-52281 | |
| SARS-CoV-2 nucleocapsid antibody | Genetex | GTX135357 | |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151100 | |
| Type IV β- tubulin antibody | Abcam | ab11315 | |
| VeroCCL81 cells | ATCC | CCL-81 | To titrate MERS-CoV |
| VeroE6 cells | ATCC | CRL-1586 | To titrate SARS-CoV-2 |
References
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