ヒト卵胞の遺伝子発現解析

卵巣は、皮質内の卵胞および間質を含む機能的および構造的単位からなる複雑な器官である。卵胞形成は、卵胞の活性化、成長、および原始静止状態から受精し、初期の胚発生をサポートすることができる成熟卵胞への成熟までのプロセスであり、研究¹で広く研究されています。この現象を引き起こすメカニズムを解明することで、女性の不妊治療を改善する可能性があります²。固定されたヒト組織の分析により、卵巣の機能単位内のタンパク質発現と遺伝子局在の評価が可能になります^3,4。ただし、卵胞内の遺伝子発現レベルを正確に評価するには、卵胞を周囲の皮質から分離するための特定の技術が必要です。したがって、以前の研究では、卵巣^の機能単位から直接遺伝子発現を分析できるように卵胞分離技術が開発されました5。酵素消化および/または機械的単離、ならびにレーザー捕捉マイクロダイセクションなど、組織片内の卵胞の分離を可能にするさまざまなアプローチが開発されています⁶、^7、8、9。卵胞単離は、ヒトまたは動物の卵巣組織のいずれかで、発生のすべての段階で卵胞の遺伝子発現プロファイルを評価するために広く使用されています^10、11、12。ただし、最適な分離手順は、密な皮質内の卵胞の脆弱な構造を考慮に入れるべきであり、したがって、損傷を避けるために注意して実行する必要があります⁷。この原稿は、Woodruffの研究室によって記述されたプロトコルから適応された、遺伝子発現分析を実行するために凍結融解卵巣皮質からヒト卵胞を分離する手順を説明しています¹³。

凍結ヒト組織からの卵巣卵胞単離の最初のステップは解凍手順です。このプロセスは、前述のように、凍結保存された卵巣組織の移植に使用される臨床プロトコルに基づいて実行されます^14、15。このプロセスは、培地の濃度を下げて卵巣皮質をすすぐことにより、凍結保護剤を除去することを目的としています。次に、卵胞を回収するために酵素的および機械的単離の前に組織を断片化する。異なる段階の卵胞は、関心のあるものを分離するために、高倍率および高品質の光学系を備えた実体顕微鏡を使用して区別することができる。単離された各卵胞は、顕微鏡に統合された定規を使用して測定され、卵胞は、原始卵胞(30 μm)、一次卵胞(60 μm)、二次卵胞(120-200 μm)、および胞状卵胞(>200 μm)の発達段階に応じてプールできます¹⁶。卵胞の形態に従ってさらなる分類を行うことができます:原始卵胞は1層の平らな顆粒膜細胞(GC)を有し、一次卵胞は1層の直方体GCを有し、二次卵胞は少なくとも2層の直方体GCを有し、そしてGC間の空洞の存在は胞状段階を特徴付ける。目的の卵胞が選択されると、RNA抽出が行われます。RNAの量と質は、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)の前に評価されます(図1)。