Analyses de l’expression génique dans les follicules humains
Summary
Ici, nous décrivons un protocole décrivant comment isoler les follicules ovariens humains du tissu cortical gelé-décongelé pour effectuer des analyses d’expression génique.
Abstract
L’ovaire est un organe hétérogène composé de différents types de cellules. Pour étudier les mécanismes moléculaires se produisant au cours de la folliculogenèse, la localisation des protéines et l’expression des gènes peuvent être effectuées sur des tissus fixes. Cependant, pour évaluer correctement les niveaux d’expression génique dans un follicule humain, cette structure complexe et délicate doit être isolée. Par conséquent, un protocole adapté précédemment décrit par le laboratoire de Woodruff a été développé pour séparer les follicules (l’ovocyte et les cellules de la granulosa) de leur environnement. Le tissu cortical ovarien est d’abord traité manuellement pour obtenir de petits fragments à l’aide de deux outils: une trancheuse de tissu et un hachoir à tissus. Le tissu est ensuite digéré enzymatiquement avec 0,2% de collagénase et 0,02% de DNase pendant au moins 40 min. Cette étape de digestion est réalisée à 37 °C et 5% de CO2 et s’accompagne d’un pipetage mécanique du milieu toutes les 10 min. Après incubation, les follicules isolés sont collectés manuellement à l’aide d’une pipette microcapillaire calibrée sous grossissement au microscope. Si les follicules sont toujours présents dans les morceaux de tissu, la procédure est complétée par une microdissection manuelle. Les follicules sont recueillis sur de la glace dans un milieu de culture et sont rincés deux fois dans des gouttelettes de solution saline tamponnée au phosphate. Cette procédure de digestion doit être soigneusement contrôlée pour éviter la détérioration du follicule. Dès que la structure des follicules semble compromise ou après un maximum de 90 min, la réaction est arrêtée avec une solution bloquante à 4 °C contenant 10% de sérum bovin fœtal. Un minimum de 20 follicules isolés (de moins de 75 μm) doit être recueilli pour obtenir une quantité adéquate d’ARN total après extraction de l’ARN pour la réaction en chaîne quantitative en chaîne de la polymérase en temps réel (RT-qPCR). Après extraction, la quantification de l’ARN total de 20 follicules atteint une valeur moyenne de 5 ng/μL. L’ARN total est ensuite rétrotranscrit en ADNc, et les gènes d’intérêt sont analysés plus en détail à l’aide de la RT-qPCR.
Introduction
L’ovaire est un organe complexe composé d’unités fonctionnelles et structurelles, y compris les follicules dans le cortex et le stroma. La folliculométrie, le processus d’activation, de croissance et de maturation des follicules d’un état de repos primordial à un follicule mature capable d’être fécondé et de soutenir le développement embryonnaire précoce, est largement étudiée dans la recherche1. Démêler les mécanismes à l’origine de ce phénomène pourrait améliorer les soins de fertilité pour les femmes2. Les analyses sur tissus humains fixes permettent d’évaluer l’expression des protéines et la localisation des gènes au sein des unités fonctionnelles de l’ovaire 3,4. Cependant, des techniques spécifiques sont nécessaires pour dissocier les follicules du cortex environnant afin d’évaluer avec précision les niveaux d’expression génique dans les follicules ovariens. Ainsi, dans une étude précédente, une technique d’isolement des follicules a été développée pour permettre des analyses de l’expression génique directement à partir de l’unité fonctionnelle de l’ovaire5. Différentes approches ont été développées, telles que la digestion enzymatique et/ou l’isolation mécanique, ainsi que la microdissection par capture laser, qui permettent l’isolation du follicule dans un morceau de tissu 6,7,8,9. L’isolement des follicules est largement utilisé, que ce soit avec du tissu ovarien humain ou animal, pour évaluer les profils d’expression génique des follicules à tous les stades de développement10,11,12. Cependant, une procédure d’isolement optimale doit tenir compte de la structure fragile du follicule dans le cortex dense et, par conséquent, doit être effectuée avec soin pour éviter tout dommage7. Ce manuscrit décrit une procédure, adaptée d’un protocole décrit par le laboratoire de Woodruff, pour isoler des follicules humains du cortex ovarien gelé-décongelé afin d’effectuer des analyses d’expression génique13.
La première étape de l’isolement du follicule ovarien à partir de tissus humains congelés est la procédure de décongélation. Ce processus est réalisé sur la base du protocole clinique utilisé pour la greffe de tissu ovarien cryoconservé, tel que décrit précédemment14,15. Le procédé vise à éliminer les agents cryoprotecteurs en rinçant le cortex ovarien à des concentrations décroissantes du milieu. Ensuite, le tissu est fragmenté avant isolement enzymatique et mécanique pour récupérer les follicules. Les follicules à différents stades peuvent être distingués à l’aide d’un stéréomicroscope à fort grossissement et à optique de bonne qualité afin d’isoler ceux qui vous intéressent. Chaque follicule isolé est mesuré à l’aide d’une règle intégrée au microscope, et les follicules peuvent être regroupés en fonction de leur stade de développement : follicules primordiaux (30 μm), follicules primaires (60 μm), follicules secondaires (120-200 μm) et follicules antraux (>200 μm)16. Une classification plus poussée peut être effectuée en fonction de la morphologie des follicules: les follicules primordiaux ont une couche de cellules granulosa aplaties (GC), les follicules primaires ont une couche de GC cuboïdes, les follicules secondaires ont au moins deux couches de GC cuboïdes et la présence d’une cavité parmi les GC caractérise le stade antral. Lorsque les follicules d’intérêt sont sélectionnés, une extraction d’ARN est effectuée. La quantité et la qualité de l’ARN sont évaluées avant la réaction quantitative en chaîne de la polymérase en temps réel (RT-qPCR) (Figure 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
La cryoconservation du tissu ovarien est une approche prometteuse pour préserver la fertilité des patientes atteintes de cancer. En clinique, le tissu cortical décongelé est greffé à la patiente après la rémission, permettant la reprise de la fonction ovarienne et de la fertilité19,20. Outre l’utilisation clinique, des fragments ovariens résiduels peuvent également être donnés pour la recherche à la fin de la période de stockage afin d’étudier…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention d’excellence scientifique (EOS) (ID: 30443682). I.D. est chercheur associé au Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).
Materials
| 2 mm gridded Petri dish | Corning | 430196 | |
| 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
| 2100 Expert software | Agilent | version B.02.08.SI648 | |
| 4-wells plate | Sigma Aldrich | D6789 | |
| 6-wells plate | Carl Roth | EKX5.1 | |
| Agilent total RNA 6000 pico kit | Agilent | 5067-1513 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| Aspirator tube assemblies for microcapillary pipettes | Sigma Aldrich | A5177 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Collagenase IV | LifeTechnologies | 17104-019 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DNase | Sigma Aldrich | D4527-10kU | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| GoScript reverse transcriptase | Promega | A5003 | |
| HSA | CAF DCF | LC4403-41-080 | |
| Leibovitz-15 | LifeTechnologies | 11415-049 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| McCoy’s 5A + bicarbonate + Hepes | LifeTechnologies | 12330-031 | |
| McIlwain tissue chopper | Stoelting | 51350 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 200 µm | CooperSurgical | 7-72-2200/1 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 75 µm | CooperSurgical | 7-72-2075/1 | |
| NanoDrop 2000/2000c operating software | ThermoFisher | version 1.6 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | 2000/2000c | |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | P3032 | |
| PowerTrack SYBR green master mix | ThermoFisher | A46109 | |
| Primers: GDF9 | F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG | ||
| Primers: HPRT | F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA | ||
| Primers: Kit Ligand | F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT | ||
| Real-Time qPCR Quantstudio 3 | ThermoFisher | A33779 | |
| RNAqueous-micro total RNA isolation kit | ThermoFisher | AM1931 | |
| Selenium | Sigma Aldrich | S9133 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Streptomycine sulfate | Sigma Aldrich | S1277 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
| Thermo Scientific Forma Series II water-jacketed CO2 incubators | ThermoFisher | 3110 | |
| Thomas Stadie-Riggs tissue slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | |
| Transferrin | Roche | 10652202001 |
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