Моделирование развития мозжечка человека in vitro в 2D структуре
Summary
Настоящий протокол объясняет генерацию 2D-монослоя мозжечковых клеток из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для исследования ранних стадий развития мозжечка.
Abstract
Точное и своевременное развитие мозжечка имеет решающее значение не только для точной координации и равновесия движений, но и для познания. Кроме того, нарушение развития мозжечка было связано со многими расстройствами нервного развития, включая аутизм, синдром дефицита внимания и гиперактивности (СДВГ) и шизофрению. Исследования развития мозжечка у людей ранее были возможны только с помощью посмертных исследований или нейровизуализации, но этих методов недостаточно для понимания молекулярных и клеточных изменений, происходящих in vivo во время раннего развития, когда возникают многие нарушения нервного развития. Появление методов генерации индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) из соматических клеток и способность к дальнейшей редифференцировке иПСК в нейроны проложили путь для моделирования in vitro раннего развития мозга. Настоящее исследование предлагает упрощенные шаги к созданию мозжечковых клеток для приложений, требующих 2-мерной (2D) монослойной структуры. Мозжечковые клетки, представляющие ранние стадии развития, получают из человеческих ИПСК с помощью следующих этапов: сначала эмбриоидные тела создаются в 3-мерной (3D) культуре, затем их обрабатывают FGF2 и инсулином для содействия спецификации мозжечковой судьбы, и, наконец, они терминально дифференцируются как монослой на поли-l-орнитиновых (PLO) / ламининовых субстратах. Через 35 дней дифференцировки культуры мозжечковых клеток, полученные из iPSC, экспрессируют мозжечковые маркеры, включая ATOH1, PTF1α, PAX6 и KIRREL2, предполагая, что этот протокол генерирует глутаматергические и ГАМКергические предшественники мозжечковых нейронов, а также предшественников клеток Пуркинье. Кроме того, дифференцированные клетки демонстрируют отчетливую морфологию нейронов и являются положительными для иммунофлуоресцентных маркеров нейронной идентичности, таких как TUBB3. Эти клетки экспрессируют аксональные направляющие молекулы, включая семафорин-4C, плексин-B2 и нейропилин-1, и могут служить моделью для исследования молекулярных механизмов роста нейритов и синаптической связности. Этот метод генерирует мозжечковые нейроны человека, полезные для последующих применений, включая экспрессию генов, физиологические и морфологические исследования, требующие 2D-монослойных форматов.
Introduction
Понимание развития мозжечка человека и критических временных окон этого процесса важно не только для расшифровки возможных причин нарушений развития нервной системы, но и для выявления новых целей терапевтического вмешательства. Моделирование развития мозжечка человека in vitro было сложной задачей, но со временем появилось множество протоколов, дифференцирующих человеческие эмбриональные стволовые клетки (hESCs) или IPSCs с судьбами мозжечковой линии, 1,2,3,4,5,6,7,8 . Кроме того, важно разработать протоколы, которые генерируют воспроизводимые результаты, относительно просты (для уменьшения ошибок) и не являются тяжелыми для денежных затрат.
Первые протоколы дифференцировки мозжечка были сгенерированы из 2D-культур из покрытых эмбриоидных тел (ЭБ), вызывая судьбу мозжечка с различными факторами роста, аналогичными развитию in vivo, включая WNT, BMP и FGF 1,9. Более поздние опубликованные протоколы индуцировали дифференцировку в основном в 3D органоидной культуре с FGF2 и инсулином, за которыми следовали FGF19 и SDF1 для ромбических губоподобных структур 3,4, или использовали комбинацию FGF2, FGF4 и FGF85. Оба метода индукции мозжечковых органоидов привели к получению аналогичных 3D-органоидов мозжечка, поскольку оба протокола сообщали о сходной экспрессии мозжечковых маркеров в одинаковые моменты времени. Холмс и Гейне расширили свой 3D-протокол5, чтобы показать, что 2D-мозжечковые клетки могут быть сгенерированы из hESCs и iPSCs, которые начинаются как 3D-агрегаты. Кроме того, Silva et al.7 продемонстрировали, что клетки, представляющие зрелые мозжечковые нейроны в 2D, могут быть сгенерированы с помощью аналогичного подхода Холмса и Гейне, используя другую точку времени для переключения с 3D на 2D и продления времени роста и созревания.
Текущий протокол индуцирует мозжечковую судьбу в IPSC без кормушек путем генерации свободно плавающих эмбриональных тел (ЭБ) с использованием инсулина и FGF2, а затем покрытия ЭБ на посуде с покрытием PLO / ламинином на 14-й день для 2D-роста и дифференцировки. К 35 дню получают клетки с мозжечковой идентичностью. Способность повторять ранние стадии развития мозжечка, особенно в 2D-среде, позволяет исследователям отвечать на конкретные вопросы, требующие экспериментов с однослойной структурой. Этот протокол также поддается дальнейшим модификациям, таким как микроструктурированные поверхности, анализы аксонального роста и сортировка клеток для обогащения желаемых клеточных популяций.
Protocol
Representative Results
Discussion
Способность моделировать развитие мозжечка человека in vitro важна для моделирования заболеваний, а также для дальнейшего понимания нормального развития мозга. Менее сложные и экономичные протоколы создают больше возможностей для генерации реплицируемых данных и широкого внедрен?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Дженни Грингер Ричардс за ее тщательную работу по проверке наших контрольных субъектов, из которых мы создали контрольные iPSC. Эта работа была поддержана NIH T32 MH019113 (D.A.M. и K.A.K.), Nellie Ball Trust (T.H.W. и A.J.W.), NIH R01 MH111578 (V.A.M. и J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (A.J.W.) и Roy J. Carver Charitable Trust (V.A.M., J.A.W. и A.J.W.). Фигуры создавались с BioRender.com.
Materials
| 10 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26D | |
| 1-thio-glycerol | Sigma | M6145 | |
| 2 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26B | |
| 250 mL Filter Unit, 0.2 µm aPES, 50 mm Dia | Fisher Scientific | FB12566502 | |
| 35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish | Falcon | 353001 | |
| 4D Nucleofector core unit | Lonza | 276885 | Nucleofector |
| 5 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-25D | |
| 60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish | Falcon | 353004 | |
| 6-well ultra-low attachment plates | Corning | 3471 | |
| 9" Disposable Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell culture grade water | Cytiva | SH30529.02 | |
| Chemically defined lipid concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Chroman 1 | Cayman | 34681 | |
| Class II, Type A2, Biological safety Cabinet | NuAire, Inc. | NU-540-600 | Hood, UV light |
| Costar 24-well plate, TC treated | Corning | 3526 | |
| Costar 6-well plate, TC treated | Corning | 3516 | |
| DAPI solution | Thermo Scientific | 62248 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO (Dimethly sulfoxide) | Sigma | D2438 | |
| DPBS+/+ | Gibco | 14040133 | |
| Emricasan | Cayman | 22204 | |
| Epi5 episomal iPSC reprogramming kit | Life Technologies | A15960 | |
| Essential 8-Flex | Gibco | A2858501 | PSC medium with heat-stable FGF2 |
| EVOS XL Core Imaging system | Life Technologies | AMEX1000 | |
| Fetal bovine serum – Premium Select | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| GlutaMAX supplement | Gibco | 35050061 | L-alanine-L-glutamine supplement |
| Ham's F12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| HERAcell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Human Anti-EN2, mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-293311 | |
| Human anti-Ki67/MKI67, rabbit | R&D Systems | MAB7617 | |
| Human anti-PTF1a, rabbit | Novus Biologicals | NBP2-98726 | |
| Human anti-TUBB3, mouse | Biolegend | 801213 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Insulin | Gibco | 12585 | |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| MEM-NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Mini Centrifuge | Labnet International | C1310 | Benchtop mini centrifuge |
| Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg) | New England BioLabs | T2040 | Silica spin columns |
| Monarch Total RNA Miniprep Kit | New England BioLabs | T2010 | Silica spin columns |
| N-2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| PFA 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polyamine supplement | Sigma | P8483 | |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | 3655 | |
| Potassium chloride | Sigma | 746436 | |
| SB431542 | Sigma | 54317 | |
| See through self-sealable pouches | Steriking | SS-T2 (90×250) | Autoclave pouches |
| Sodium citrate dihydrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Syringe filters, sterile, PES 0.22 µm, 30 mm Dia | Research Products International | 256131 | |
| Trans-ISRIB | Cayman | 16258 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | Phenol and guanidine isothiocyanate |
| TrypLE Express Enzyme (1x) | Gibco | 12604039 | Cell dissociation reagent |
| Vapor pressure osmometer | Wescor, Inc. | Model 5520 | Osmometer |
| Y-27632 | Biogems | 1293823 |
References
- Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2012).
- Erceg, S., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells. Stem Cells and Development. 19 (11), 1745-1756 (2010).
- Muguruma, K. 3D culture for self-formation of the cerebellum from human pluripotent stem cells through induction of the isthmic organizer. Methods in Molecular Biology. 1597, 31-41 (2017).
- Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
- Holmes, D. B., Heine, V. M. Streamlined 3D cerebellar differentiation protocol with optional 2D modification. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56888 (2017).
- Holmes, D. B., Heine, V. M. Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium. Biology Open. 6 (3), 402-406 (2017).
- Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 70 (2020).
- Nayler, S., Agarwal, D., Curion, F., Bowden, R., Becker, E. B. E. High-resolution transcriptional landscape of xeno-free human induced pluripotent stem cell-derived cerebellar organoids. Scientific Reports. 11, 12959 (2021).
- Salero, E., Hatten, M. E. Differentiation of ES cells into cerebellar neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2997-3002 (2007).
- Nie, Y., Walsh, P., Clarke, D. L., Rowley, J. A., Fellner, T. Scalable passaging of adherent human pluripotent stem cells. PLoS One. 9 (1), 88012 (2014).
- Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48 (1), 17-24 (2005).
- Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48 (1), 31-43 (2005).
- Hoshino, M., et al. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47 (2), 201-213 (2005).
- Mizuhara, E., et al. Purkinje cells originate from cerebellar ventricular zone progenitors positive for Neph3 and E-cadherin. Developmental Biology. 338 (2), 202-214 (2010).
- Ferreira, A., Caceres, A. Expression of the Class III β-tubulin isotype in developing neurons in culture. Journal of Neuroscience Research. 32 (4), 516-529 (1992).
- Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. Identification of conserved isotype-defining variable region sequences for four vertebrate beta tubulin polypeptide classes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (12), 4327-4331 (1986).
- Joyner, A. L. Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain-hindbrain development. Trends in Genetics. 12 (1), 15-20 (1996).
- Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer. Current Opinion in Cell Biology. 12 (6), 736-741 (2000).
- Minaki, Y., Nakatani, T., Mizuhara, E., Inoue, T., Ono, Y. Identification of a novel transcriptional corepressor, Corl2, as a cerebellar Purkinje cell-selective marker. Gene Expression Patterns. 8 (6), 418-423 (2008).
- Aldinger, K. A., et al. Spatial and cell type transcriptional landscape of human cerebellar development. Nature Neuroscience. 24 (8), 1163-1175 (2021).
- Fossat, N., Courtois, V., Chatelain, G., Brun, G., Lamonerie, T. Alternative usage of Otx2 promoters during mouse development. Developmental Dynamics. 233 (1), 154-160 (2005).
- Akbarian, S., et al. The PsychENCODE project. Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).
- Aijaz, S., et al. Expression analysis of SIX3 and SIX6 in human tissues reveals differences in expression and a novel correlation between the expression of SIX3 and the genes encoding isocitrate dehyhrogenase and cadherin 18. Genomics. 86 (1), 86-99 (2005).
- Conte, I., Morcillo, J., Bovolenta, P. Comparative analysis of Six3 and Six6 distribution in the developing and adult mouse brain. Developmental Dynamics. 234 (3), 718-725 (2005).
- Andreasen, N. C., Pierson, R. The role of the cerebellum in schizophrenia. Biological Psychiatry. 64 (2), 81-88 (2008).
- Nopoulos, P. C., Ceilley, J. W., Gailis, E. A., Andreasen, N. C. An MRI study of cerebellar vermis morphology in patients with schizophrenia: Evidence in support of the cognitive dysmetria concept. Biological Psychiatry. 46 (5), 703-711 (1999).
- Jacobsen, L. K., et al. Quantitative morphology of the cerebellum and fourth ventricle in childhood-onset schizophrenia. American Journal of Psychiatry. 154 (12), 1663-1669 (1997).
- Saywell, V., Cioni, J. -. M., Ango, F. Developmental gene expression profile of axon guidance cues in Purkinje cells during cerebellar circuit formation. The Cerebellum. 13 (3), 307-317 (2014).
- Kim, D., Ackerman, S. L. The UNC5C netrin receptor regulates dorsal guidance of mouse hindbrain axons. Journal of Neuroscience. 31 (6), 2167-2179 (2011).
- Maier, V., et al. Semaphorin 4C and 4G are ligands of Plexin-B2 required in cerebellar development. Molecular and Cellular Neuroscience. 46 (2), 419-431 (2011).
- Telley, L., et al. Dual function of NRP1 in axon guidance and subcellular target recognition in cerebellum. Neuron. 91 (6), 1276-1291 (2016).
- Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Scientific Reports. 5, 9232 (2015).
- Shabanipour, S., et al. Primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (152), e60168 (2019).
