Modellering van menselijke cerebellaire ontwikkeling in vitro in 2D-structuur
Summary
Het huidige protocol verklaart de generatie van een 2D-monolaag van cerebellaire cellen uit geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het onderzoeken van de vroege stadia van cerebellaire ontwikkeling.
Abstract
De precieze en tijdige ontwikkeling van het cerebellum is niet alleen cruciaal voor een nauwkeurige motorische coördinatie en balans, maar ook voor cognitie. Bovendien is verstoring van de cerebellaire ontwikkeling betrokken bij veel neurologische ontwikkelingsstoornissen, waaronder autisme, attention deficit-hyperactivity disorder (ADHD) en schizofrenie. Onderzoek naar cerebellaire ontwikkeling bij mensen was voorheen alleen mogelijk door postmortale studies of neuroimaging, maar deze methoden zijn niet voldoende om de moleculaire en cellulaire veranderingen te begrijpen die in vivo optreden tijdens de vroege ontwikkeling, wanneer veel neurologische ontwikkelingsstoornissen ontstaan. De opkomst van technieken om door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s) te genereren uit somatische cellen en het vermogen om iPSC’s verder te differentiëren in neuronen hebben de weg vrijgemaakt voor in vitro modellering van vroege hersenontwikkeling. De huidige studie biedt vereenvoudigde stappen in de richting van het genereren van cerebellaire cellen voor toepassingen die een 2-dimensionale (2D) monolaagstructuur vereisen. Cerebellaire cellen die vroege ontwikkelingsstadia vertegenwoordigen, worden afgeleid van menselijke iPSC’s via de volgende stappen: ten eerste worden embryoïde lichamen gemaakt in 3-dimensionale (3D) cultuur, vervolgens worden ze behandeld met FGF2 en insuline om cerebellaire lotspecificatie te bevorderen, en ten slotte worden ze terminaal gedifferentieerd als een monolaag op poly-l-ornithine (PLO) / laminine-gecoate substraten. Na 35 dagen differentiatie drukken iPSC-afgeleide cerebellaire celculturen cerebellaire markers uit, waaronder ATOH1, PTF1α, PAX6 en KIRREL2, wat suggereert dat dit protocol glutamaterge en GABAerge cerebellaire neuronale voorlopers genereert, evenals Purkinje-celvoorlopers. Bovendien vertonen de gedifferentieerde cellen een duidelijke neuronale morfologie en zijn ze positief voor immunofluorescentiemarkers van neuronale identiteit zoals TUBB3. Deze cellen drukken axonale geleidingsmoleculen uit, waaronder semafoor-4C, plexine-B2 en neuropiline-1, en kunnen dienen als een model voor het onderzoeken van de moleculaire mechanismen van neurietuitgroei en synaptische connectiviteit. Deze methode genereert menselijke cerebellaire neuronen die nuttig zijn voor downstream-toepassingen, waaronder genexpressie, fysiologische en morfologische studies die 2D-monolaagformaten vereisen.
Introduction
Het begrijpen van de ontwikkeling van menselijke cerebellen en de kritieke tijdvensters van dit proces is niet alleen belangrijk voor het decoderen van de mogelijke oorzaken van neurologische ontwikkelingsstoornissen, maar ook voor het identificeren van nieuwe doelen voor therapeutische interventie. Het modelleren van de menselijke cerebellaire ontwikkeling in vitro is een uitdaging geweest, maar in de loop van de tijd zijn er veel protocollen ontstaan die menselijke embryonale stamcellen (hESCs) of iPSC’s met cerebellaire afstammingsnadommen onderscheiden 1,2,3,4,5,6,7,8 . Verder is het belangrijk om protocollen te ontwikkelen die reproduceerbare resultaten genereren, relatief eenvoudig zijn (om fouten te verminderen) en niet zwaar zijn voor de geldkosten.
De eerste protocollen voor cerebellaire differentiatie werden gegenereerd uit 2D-culturen van vergulde embryoïde lichamen (EV’s), waardoor cerebellair lot werd geïnduceerd met verschillende groeifactoren vergelijkbaar met in vivo ontwikkeling, waaronder WNT, BMP’s en FFGF’s 1,9. Meer recent gepubliceerde protocollen induceerden differentiatie voornamelijk in 3D organoïde cultuur met FGF2 en insuline, gevolgd door FGF19 en SDF1 voor rhombische lipachtige structuren 3,4, of gebruikten een combinatie van FGF2, FGF4 en FGF85. Beide cerebellaire organoïde inductiemethoden resulteerden in vergelijkbare 3D cerebellaire organoïden, aangezien beide protocollen vergelijkbare cerebellaire markerexpressie op identieke tijdstippen rapporteerden. Holmes en Heine breidden hun 3D-protocol5 uit om aan te tonen dat 2D-cerebellaire cellen kunnen worden gegenereerd uit hESCs en iPSC’s, die beginnen als 3D-aggregaten. Bovendien toonden Silva et al.7 aan dat cellen die volwassen cerebellaire neuronen in 2D vertegenwoordigen, kunnen worden gegenereerd met een vergelijkbare benadering als Holmes en Heine, waarbij een ander tijdspunt wordt gebruikt om over te schakelen van 3D naar 2D en de tijd van groei en rijping wordt verlengd.
Het huidige protocol induceert het lot van cerebellair in feedervrije iPSC’s door vrij zwevende embryoïde lichamen (EVB’s) te genereren met behulp van insuline en FGF2 en vervolgens de EB’s op PLO / laminine-gecoate gerechten op dag 14 te plaatsen voor 2D-groei en differentiatie. Op dag 35 worden cellen met cerebellaire identiteit verkregen. Het vermogen om de vroege stadia van cerebellaire ontwikkeling samen te vatten, vooral in een 2D-omgeving, stelt onderzoekers in staat om specifieke vragen te beantwoorden die experimenten met een monolaagstructuur vereisen. Dit protocol is ook vatbaar voor verdere wijzigingen zoals microverwerkte oppervlakken, axonale uitgroeitests en celsortering om de gewenste celpopulaties te verrijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het vermogen om de menselijke cerebellaire ontwikkeling in vitro te modelleren is belangrijk voor ziektemodellering en het bevorderen van het begrip van normale hersenontwikkeling. Minder gecompliceerde en kosteneffectieve protocollen creëren meer mogelijkheden voor het genereren van repliceerbare gegevens en brede implementatie in meerdere wetenschappelijke laboratoria. Een cerebellair differentiatieprotocol wordt hier beschreven met behulp van een aangepaste methode voor het genereren van EB’s die geen enzyme…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken Jenny Gringer Richards voor haar grondige werk bij het valideren van onze controlepersonen, waaruit we de controle-iPSC’s hebben gegenereerd. Dit werk werd ondersteund door NIH T32 MH019113 (aan D.A.M. en K.A.K.), de Nellie Ball Trust (aan T.H.W. en A.J.W.), NIH R01 MH111578 (aan V.A.M. en J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (aan A.J.W.), en de Roy J. Carver Charitable Trust (aan V.A.M., J.A.W., en A.J.W.). De figuren zijn gemaakt met BioRender.com.
Materials
| 10 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26D | |
| 1-thio-glycerol | Sigma | M6145 | |
| 2 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26B | |
| 250 mL Filter Unit, 0.2 µm aPES, 50 mm Dia | Fisher Scientific | FB12566502 | |
| 35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish | Falcon | 353001 | |
| 4D Nucleofector core unit | Lonza | 276885 | Nucleofector |
| 5 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-25D | |
| 60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish | Falcon | 353004 | |
| 6-well ultra-low attachment plates | Corning | 3471 | |
| 9" Disposable Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell culture grade water | Cytiva | SH30529.02 | |
| Chemically defined lipid concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Chroman 1 | Cayman | 34681 | |
| Class II, Type A2, Biological safety Cabinet | NuAire, Inc. | NU-540-600 | Hood, UV light |
| Costar 24-well plate, TC treated | Corning | 3526 | |
| Costar 6-well plate, TC treated | Corning | 3516 | |
| DAPI solution | Thermo Scientific | 62248 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO (Dimethly sulfoxide) | Sigma | D2438 | |
| DPBS+/+ | Gibco | 14040133 | |
| Emricasan | Cayman | 22204 | |
| Epi5 episomal iPSC reprogramming kit | Life Technologies | A15960 | |
| Essential 8-Flex | Gibco | A2858501 | PSC medium with heat-stable FGF2 |
| EVOS XL Core Imaging system | Life Technologies | AMEX1000 | |
| Fetal bovine serum – Premium Select | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| GlutaMAX supplement | Gibco | 35050061 | L-alanine-L-glutamine supplement |
| Ham's F12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| HERAcell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Human Anti-EN2, mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-293311 | |
| Human anti-Ki67/MKI67, rabbit | R&D Systems | MAB7617 | |
| Human anti-PTF1a, rabbit | Novus Biologicals | NBP2-98726 | |
| Human anti-TUBB3, mouse | Biolegend | 801213 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Insulin | Gibco | 12585 | |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| MEM-NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Mini Centrifuge | Labnet International | C1310 | Benchtop mini centrifuge |
| Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg) | New England BioLabs | T2040 | Silica spin columns |
| Monarch Total RNA Miniprep Kit | New England BioLabs | T2010 | Silica spin columns |
| N-2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| PFA 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polyamine supplement | Sigma | P8483 | |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | 3655 | |
| Potassium chloride | Sigma | 746436 | |
| SB431542 | Sigma | 54317 | |
| See through self-sealable pouches | Steriking | SS-T2 (90×250) | Autoclave pouches |
| Sodium citrate dihydrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Syringe filters, sterile, PES 0.22 µm, 30 mm Dia | Research Products International | 256131 | |
| Trans-ISRIB | Cayman | 16258 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | Phenol and guanidine isothiocyanate |
| TrypLE Express Enzyme (1x) | Gibco | 12604039 | Cell dissociation reagent |
| Vapor pressure osmometer | Wescor, Inc. | Model 5520 | Osmometer |
| Y-27632 | Biogems | 1293823 |
References
- Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2012).
- Erceg, S., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells. Stem Cells and Development. 19 (11), 1745-1756 (2010).
- Muguruma, K. 3D culture for self-formation of the cerebellum from human pluripotent stem cells through induction of the isthmic organizer. Methods in Molecular Biology. 1597, 31-41 (2017).
- Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
- Holmes, D. B., Heine, V. M. Streamlined 3D cerebellar differentiation protocol with optional 2D modification. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56888 (2017).
- Holmes, D. B., Heine, V. M. Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium. Biology Open. 6 (3), 402-406 (2017).
- Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 70 (2020).
- Nayler, S., Agarwal, D., Curion, F., Bowden, R., Becker, E. B. E. High-resolution transcriptional landscape of xeno-free human induced pluripotent stem cell-derived cerebellar organoids. Scientific Reports. 11, 12959 (2021).
- Salero, E., Hatten, M. E. Differentiation of ES cells into cerebellar neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2997-3002 (2007).
- Nie, Y., Walsh, P., Clarke, D. L., Rowley, J. A., Fellner, T. Scalable passaging of adherent human pluripotent stem cells. PLoS One. 9 (1), 88012 (2014).
- Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48 (1), 17-24 (2005).
- Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48 (1), 31-43 (2005).
- Hoshino, M., et al. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47 (2), 201-213 (2005).
- Mizuhara, E., et al. Purkinje cells originate from cerebellar ventricular zone progenitors positive for Neph3 and E-cadherin. Developmental Biology. 338 (2), 202-214 (2010).
- Ferreira, A., Caceres, A. Expression of the Class III β-tubulin isotype in developing neurons in culture. Journal of Neuroscience Research. 32 (4), 516-529 (1992).
- Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. Identification of conserved isotype-defining variable region sequences for four vertebrate beta tubulin polypeptide classes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (12), 4327-4331 (1986).
- Joyner, A. L. Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain-hindbrain development. Trends in Genetics. 12 (1), 15-20 (1996).
- Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer. Current Opinion in Cell Biology. 12 (6), 736-741 (2000).
- Minaki, Y., Nakatani, T., Mizuhara, E., Inoue, T., Ono, Y. Identification of a novel transcriptional corepressor, Corl2, as a cerebellar Purkinje cell-selective marker. Gene Expression Patterns. 8 (6), 418-423 (2008).
- Aldinger, K. A., et al. Spatial and cell type transcriptional landscape of human cerebellar development. Nature Neuroscience. 24 (8), 1163-1175 (2021).
- Fossat, N., Courtois, V., Chatelain, G., Brun, G., Lamonerie, T. Alternative usage of Otx2 promoters during mouse development. Developmental Dynamics. 233 (1), 154-160 (2005).
- Akbarian, S., et al. The PsychENCODE project. Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).
- Aijaz, S., et al. Expression analysis of SIX3 and SIX6 in human tissues reveals differences in expression and a novel correlation between the expression of SIX3 and the genes encoding isocitrate dehyhrogenase and cadherin 18. Genomics. 86 (1), 86-99 (2005).
- Conte, I., Morcillo, J., Bovolenta, P. Comparative analysis of Six3 and Six6 distribution in the developing and adult mouse brain. Developmental Dynamics. 234 (3), 718-725 (2005).
- Andreasen, N. C., Pierson, R. The role of the cerebellum in schizophrenia. Biological Psychiatry. 64 (2), 81-88 (2008).
- Nopoulos, P. C., Ceilley, J. W., Gailis, E. A., Andreasen, N. C. An MRI study of cerebellar vermis morphology in patients with schizophrenia: Evidence in support of the cognitive dysmetria concept. Biological Psychiatry. 46 (5), 703-711 (1999).
- Jacobsen, L. K., et al. Quantitative morphology of the cerebellum and fourth ventricle in childhood-onset schizophrenia. American Journal of Psychiatry. 154 (12), 1663-1669 (1997).
- Saywell, V., Cioni, J. -. M., Ango, F. Developmental gene expression profile of axon guidance cues in Purkinje cells during cerebellar circuit formation. The Cerebellum. 13 (3), 307-317 (2014).
- Kim, D., Ackerman, S. L. The UNC5C netrin receptor regulates dorsal guidance of mouse hindbrain axons. Journal of Neuroscience. 31 (6), 2167-2179 (2011).
- Maier, V., et al. Semaphorin 4C and 4G are ligands of Plexin-B2 required in cerebellar development. Molecular and Cellular Neuroscience. 46 (2), 419-431 (2011).
- Telley, L., et al. Dual function of NRP1 in axon guidance and subcellular target recognition in cerebellum. Neuron. 91 (6), 1276-1291 (2016).
- Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Scientific Reports. 5, 9232 (2015).
- Shabanipour, S., et al. Primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (152), e60168 (2019).
