Modélisation du développement cérébelleux humain in vitro en structure 2D
Summary
Le présent protocole explique la génération d’une monocouche 2D de cellules cérébelleuses à partir de cellules souches pluripotentes induites pour étudier les premiers stades du développement cérébelleux.
Abstract
Le développement précis et opportun du cervelet est crucial non seulement pour une coordination motrice et un équilibre précis, mais aussi pour la cognition. En outre, la perturbation du développement cérébelleux a été impliquée dans de nombreux troubles neurodéveloppementaux, notamment l’autisme, le trouble déficitaire de l’attention avec hyperactivité (TDAH) et la schizophrénie. Les études sur le développement cérébelleux chez l’homme n’étaient auparavant possibles que par des études post-mortem ou la neuroimagerie, mais ces méthodes ne sont pas suffisantes pour comprendre les changements moléculaires et cellulaires qui se produisent in vivo au cours du développement précoce, qui est à l’origine de nombreux troubles neurodéveloppementaux. L’émergence de techniques pour générer des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPi) à partir de cellules somatiques et la capacité de redifférencier davantage les CSPi en neurones ont ouvert la voie à la modélisation in vitro du développement précoce du cerveau. La présente étude fournit des étapes simplifiées vers la génération de cellules cérébelleuses pour des applications nécessitant une structure monocouche en 2 dimensions (2D). Les cellules cérébelleuses représentant les premiers stades de développement sont dérivées de CSPi humaines via les étapes suivantes: premièrement, les corps embryoïdes sont fabriqués en culture 3 dimensions (3D), puis ils sont traités avec FGF2 et insuline pour promouvoir la spécification du devenir cérébelleux, et enfin, ils sont différenciés en phase terminale en tant que monocouche sur des substrats recouverts de poly-l-ornithine (PLO) / laminine. À 35 jours de différenciation, les cultures de cellules cérébelleuses dérivées de l’iPSC expriment des marqueurs cérébelleux, notamment ATOH1, PTF1α, PAX6 et KIRREL2, ce qui suggère que ce protocole génère des précurseurs neuronaux cérébelleux glutamatergiques et GABAergiques, ainsi que des progéniteurs cellulaires de Purkinje. De plus, les cellules différenciées présentent une morphologie neuronale distincte et sont positives pour les marqueurs d’immunofluorescence de l’identité neuronale tels que TUBB3. Ces cellules expriment des molécules de guidage axonal, y compris la sémaphorine-4C, la plexine-B2 et la neuropiline-1, et pourraient servir de modèle pour étudier les mécanismes moléculaires de la croissance des neurites et de la connectivité synaptique. Cette méthode génère des neurones cérébelleux humains utiles pour des applications en aval, y compris l’expression génique, les études physiologiques et morphologiques nécessitant des formats monocouches 2D.
Introduction
Comprendre le développement cérébelleux humain et les fenêtres temporelles critiques de ce processus est important non seulement pour décoder les causes possibles des troubles neurodéveloppementaux, mais aussi pour identifier de nouvelles cibles pour une intervention thérapeutique. La modélisation du développement cérébelleux humain in vitro a été difficile, mais au fil du temps, de nombreux protocoles différenciant les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) ou les CSPi avec le destin de la lignée cérébelleuse ont émergé 1,2,3,4,5,6,7,8 . De plus, il est important de développer des protocoles qui génèrent des résultats reproductibles, qui sont relativement simples (pour réduire les erreurs) et qui ne sont pas lourds en coûts monétaires.
Les premiers protocoles de différenciation cérébelleuse ont été générés à partir de cultures 2D de corps embryoïdes plaqués (EB), induisant le devenir cérébelleux avec divers facteurs de croissance similaires au développement in vivo, y compris WNT, BMP et FGF 1,9. Des protocoles publiés plus récents ont induit une différenciation principalement dans la culture organoïde 3D avec FGF2 et insuline, suivie de FGF19 et SDF1 pour les structures rhombiques ressemblant à des lèvres3,4, ou ont utilisé une combinaison de FGF2, FGF4 et FGF85. Les deux méthodes d’induction organoïde cérébelleuse ont abouti à des organoïdes cérébelleux 3D similaires, car les deux protocoles ont rapporté une expression similaire du marqueur cérébelleux à des moments identiques. Holmes et Heine ont étendu leur protocole 3D5 pour montrer que les cellules cérébelleuses 2D peuvent être générées à partir d’hESCs et d’iPSCs, qui commencent sous forme d’agrégats 3D. En outre, Silva et al.7 ont démontré que les cellules représentant des neurones cérébelleux matures en 2D peuvent être générées avec une approche similaire à celle de Holmes et Heine, en utilisant un point temporel différent pour passer de la 3D à la 2D et prolonger le temps de croissance et de maturation.
Le protocole actuel induit le devenir cérébelleux dans les CSPi sans alimentation en générant des corps embryoïdes flottants à l’aide d’insuline et de FGF2, puis en plaquant les EB sur des plats enrobés de PLOL / laminine au jour 14 pour une croissance et une différenciation 2D. Au jour 35, les cellules ayant une identité cérébelleuse sont obtenues. La capacité de récapituler les premières étapes du développement cérébelleux, en particulier dans un environnement 2D, permet aux chercheurs de répondre à des questions spécifiques nécessitant des expériences avec une structure monocouche. Ce protocole se prête également à d’autres modifications telles que des surfaces micropatternées, des tests de croissance axonale et le tri cellulaire pour enrichir les populations cellulaires souhaitées.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacité de modéliser le développement cérébelleux humain in vitro est importante pour la modélisation de la maladie ainsi que pour approfondir la compréhension du développement normal du cerveau. Des protocoles moins compliqués et moins rentables créent plus d’opportunités pour la génération de données reproductibles et une large mise en œuvre dans plusieurs laboratoires scientifiques. Un protocole de différenciation cérébelleuse est décrit ici en utilisant une méthode modifiée de gén…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Jenny Gringer Richards pour son travail approfondi dans la validation de nos sujets témoins, à partir desquels nous avons généré les CSPi de contrôle. Ce travail a été soutenu par NIH T32 MH019113 (à D.A.M. et K.A.K.), le Nellie Ball Trust (à T.H.W. et A.J.W.), NIH R01 MH111578 (à V.A.M. et J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (à A.J.W.) et le Roy J. Carver Charitable Trust (à V.A.M., J.A.W. et A.J.W.). Les figurines ont été créées avec BioRender.com.
Materials
| 10 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26D | |
| 1-thio-glycerol | Sigma | M6145 | |
| 2 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26B | |
| 250 mL Filter Unit, 0.2 µm aPES, 50 mm Dia | Fisher Scientific | FB12566502 | |
| 35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish | Falcon | 353001 | |
| 4D Nucleofector core unit | Lonza | 276885 | Nucleofector |
| 5 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-25D | |
| 60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish | Falcon | 353004 | |
| 6-well ultra-low attachment plates | Corning | 3471 | |
| 9" Disposable Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell culture grade water | Cytiva | SH30529.02 | |
| Chemically defined lipid concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Chroman 1 | Cayman | 34681 | |
| Class II, Type A2, Biological safety Cabinet | NuAire, Inc. | NU-540-600 | Hood, UV light |
| Costar 24-well plate, TC treated | Corning | 3526 | |
| Costar 6-well plate, TC treated | Corning | 3516 | |
| DAPI solution | Thermo Scientific | 62248 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO (Dimethly sulfoxide) | Sigma | D2438 | |
| DPBS+/+ | Gibco | 14040133 | |
| Emricasan | Cayman | 22204 | |
| Epi5 episomal iPSC reprogramming kit | Life Technologies | A15960 | |
| Essential 8-Flex | Gibco | A2858501 | PSC medium with heat-stable FGF2 |
| EVOS XL Core Imaging system | Life Technologies | AMEX1000 | |
| Fetal bovine serum – Premium Select | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| GlutaMAX supplement | Gibco | 35050061 | L-alanine-L-glutamine supplement |
| Ham's F12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| HERAcell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Human Anti-EN2, mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-293311 | |
| Human anti-Ki67/MKI67, rabbit | R&D Systems | MAB7617 | |
| Human anti-PTF1a, rabbit | Novus Biologicals | NBP2-98726 | |
| Human anti-TUBB3, mouse | Biolegend | 801213 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Insulin | Gibco | 12585 | |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| MEM-NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Mini Centrifuge | Labnet International | C1310 | Benchtop mini centrifuge |
| Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg) | New England BioLabs | T2040 | Silica spin columns |
| Monarch Total RNA Miniprep Kit | New England BioLabs | T2010 | Silica spin columns |
| N-2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| PFA 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polyamine supplement | Sigma | P8483 | |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | 3655 | |
| Potassium chloride | Sigma | 746436 | |
| SB431542 | Sigma | 54317 | |
| See through self-sealable pouches | Steriking | SS-T2 (90×250) | Autoclave pouches |
| Sodium citrate dihydrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Syringe filters, sterile, PES 0.22 µm, 30 mm Dia | Research Products International | 256131 | |
| Trans-ISRIB | Cayman | 16258 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | Phenol and guanidine isothiocyanate |
| TrypLE Express Enzyme (1x) | Gibco | 12604039 | Cell dissociation reagent |
| Vapor pressure osmometer | Wescor, Inc. | Model 5520 | Osmometer |
| Y-27632 | Biogems | 1293823 |
References
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