Preklinische geneesmiddelentests in schaalbare 3D-gemanipuleerde spierweefsels

1. Celkweekprotocol Primaire menselijke myoblastcultuurVerdun de extracellulaire matrix (ECM) in een verhouding van 1:100 in 8 ml DMEM/F12 medium op ijs. Breng 8 ml ECM-oplossing aan op één T175-kolf en incubeer bij 37 °C gedurende ten minste 1 uur voorafgaand aan het zaaien van de cel, maar niet langer dan 24 uur. Zorg ervoor dat de ECM-oplossing de gehele bodem van de kolf bedekt. Aliquot 5 ml van het skeletspiergroeimedium tot een conische buis van 15 ml. Ontdooi een bevroren injectieflacon met cellen (5,0 x 105 myoblasten) in een waterbad bij 37 °C gedurende 2 minuten of totdat het ijs net is gesmolten. Spuit de injectieflacon in met 70% ethanol en breng deze over in een bioveiligheidskast (BSC). Breng de cellen over in het gealiquoteerde medium met behulp van een P1000. Niet tritureren. Centrifugeer de cellen op 300 x g gedurende 3 min. Zuig het supernatant op en resuspensie de cellen in 1 ml van het groeimedium met behulp van een P1000-pipet om een enkele celsuspensie te verkrijgen. Was de erlenmeyer met ECM-coating met 15 ml DPBS. Zuig DPBS aan en voeg vervolgens 30 ml van het groeimedium toe aan de kolf. Voeg 4 ml van het groeimedium toe aan de cellen, meng en verdeel de celsuspensie in de T-175-kolf. Zorg ervoor dat het totale volume 35 ml is. Schuif de kolf 5-6 keer voorzichtig langs het werkoppervlak naar links en rechts, gevolgd door 5-6 keer naar voren en naar achteren om een gelijkmatige verdeling van de cellen op het oppervlak van de kolf te garanderen. Plaats de T-175-kolf in een celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2. Kweek de cellen gedurende 3 dagen of totdat ze niet meer dan 70% confluency bereiken en passeer vervolgens de cellen. Het passeren van primaire menselijke myoblastenVerdun de ECU in een verhouding van 1:100 in 30 ml DMEM/F12 medium op ijs. Breng 10 ml van de ECM-oplossing aan op drie T225-kolven en incubeer bij 37 °C gedurende ten minste 1 uur voorafgaand aan het zaaien, maar niet meer dan 24 uur. Zorg ervoor dat de ECM-oplossing de gehele bodem van de kolf bedekt. Was de cellen met 15 ml DPBS. Zuig het dissociatiereagens op en voeg het toe volgens het protocol van de leverancier. Zodra de cellen zijn opgeheven, stopt u de reactie volgens het protocol van de leverancier en verzamelt u de cellen in een conische buis. Centrifugeer de cellen op 300 x g gedurende 3 min. Zuig het supernatant op en resuspensie de cellen in 1 ml van het groeimedium met behulp van een P1000-pipet om een enkele celsuspensie te verkrijgen. Was de erlenmeyer met ECM-coating met 15 ml DPBS. Zuig DPBS aan en voeg vervolgens 40 ml van het groeimedium toe aan elke T225-kolf. Voeg 14 ml van het groeimedium toe aan de celsuspensie, meng en verdeel 5 ml van de celsuspensie over elke T225-kolf. Zorg ervoor dat het totale volume in elke kolf 45 ml bedraagt. Schuif de kolf 5-6 keer voorzichtig langs het werkoppervlak naar links en rechts, gevolgd door 5-6 keer vooruit en terug om een gelijkmatige verdeling te garanderen. Plaats de kolven in de celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2. Kweek cellen gedurende 2-3 dagen of totdat ze niet meer dan 70% confluency bereiken en dan passage. Splits de cellen op 1:3 of 1:4 bij elke passage en zaai tussen 3 x 103 en 1 x 104 cellen/cm2. hiPSC-afgeleide cardiomyocytencultuurVerdun de ECU in een verhouding van 1:60 in 12 ml DMEM/F12 medium op ijs. Breng 1 ml ECM-oplossing aan op elk putje van twee 6-putplaten en incubeer bij 37 °C gedurende ten minste 1 uur voorafgaand aan het zaaien van de cel, maar niet meer dan 24 uur. Ontdooi een bevroren injectieflacon met cardiomyocyten in een waterbad bij 37 °C gedurende 2 minuten of totdat het ijs net is gesmolten. Spuit de injectieflacon in met 70% ethanol en breng deze over in de BSC. Gebruik een p1000-pipet om de ontdooide cellen over te brengen in een conische buis van 50 ml. Spoel de lege cryovial met 1 ml kamertemperatuur (RT) plating medium om eventuele resterende cellen te herstellen. Doseer langzaam de 1 ml spoelmedia druppelsgewijs (één druppel om de 5 s) in de conische buis van cellen in de loop van 90 s. Draai de buis continu rond om de cellen te mengen tijdens de langzame mediatoevoeging. Voeg langzaam 8 ml van het platingmedium toe met behulp van een serologische pipet van 10 ml aan de conische buis van 50 ml cellen. Nadat alle media zijn afgegeven, pipet u voorzichtig 3 keer op en neer om de cellen grondig te mengen. Tel cellen met behulp van een hemacytometer en trypan blauw. Centrifugeer de cellen in de 50 ml conische buis op 300 x g gedurende 3 min. Nadat de cellen zijn gepelletiseerd, zuigt u het supernatant op. Gebruik een p1000-pipet om 1 ml van het beplatingsmedium over te brengen naar de buis en breek de pellet voorzichtig af door 3-5 keer langzaam op en neer te pipetteren. Resuspensie van de cellen met een extra beplatingsmedium. Zaad tussen 2-4 x 10 6 cellen per put van een 6-putplaat in 2 ml van het platingmedium. Was de ECM-gecoate 6-well platen met DPBS (2 ml/put). Pipetteer 2 ml celsuspensie per putje van een 6-putplaat. Beweeg de platen voorzichtig langs het werkoppervlak naar links en rechts 5-6 keer gevolgd door 5-6 keer vooruit en terug om een gelijkmatige verdeling van de cellen op de plaatoppervlakken te garanderen. Plaats de plaat in de celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2. Herhaal stap 1.3.3-1.3.16 voor alle injectieflacons van de cellen die moeten worden ontdooid. Verander de volgende dag na het plateren naar 3-5 ml (afhankelijk van de cellijn en dichtheid) van het onderhoudsmedium en verander het medium om de andere dag. Kweek cellen gedurende 3-4 dagen voordat ze in 3D-weefsels worden gegoten. Stromale celkweekBreng 30 ml van de ECM-oplossing aan op een T175-kolf en incubeer bij 37 °C gedurende ten minste 1 uur voorafgaand aan het zaaien van de cel, maar niet langer dan 24 uur. Aliquot 5 ml van het stromale celmedium in een conische buis van 15 ml. Ontdooi een bevroren injectieflacon met stromale cellen in een waterbad bij 37 °C gedurende 2 minuten of totdat het ijs net is gesmolten. Spuit de injectieflacon in met 70% ethanol en breng deze over in de BSC. Gebruik een p1000-pipet om langzaam 1 ml stromale celmedium toe te voegen aan de ontdooide cellen in de injectieflacon. Breng de celsuspensie over van de injectieflacon naar de resterende dooimedia in de conische buis. Gebruik een serologische pipet van 5 ml om de cellen te mengen. Pipetteer 3 keer op en neer. Tel de cellen met behulp van een hemacytometer en trypan blauw. Draai geen cellen af. Was de met ECM beklede T175-kolf met 15 ml DPBS. Breng de stromale cellen over in de kolf met een dichtheid van 3-4 x 103 cellen/cm2. Schuif de kolf 5-6 keer voorzichtig langs het werkoppervlak naar links en rechts, gevolgd door 5-6 keer naar voren en naar achteren om een gelijkmatige verdeling van de cellen op het oppervlak van de kolf te garanderen. Verander het medium de volgende dag met 45 ml verwarmd stromaal celmedium. Kweek de cellen gedurende 3-4 dagen voordat ze in 3D-weefsels worden gegoten. 2. Materiaalvoorbereiding FibrinogeenOPMERKING: Zorg er bij het reconstitueren van fibrinogeen voor dat u de hoeveelheid oppervlak waarop het fibrinogeenpoeder wordt gelaagd, maximaliseert. In dit protocol werd de hoeveelheid gebruikt verdunningsmiddel geoptimaliseerd voor de grootte van de gebruikte container, d.w.z. er werd net genoeg verdunningsmiddel gebruikt om de bodem van de schaal te bedekken. Leg bijvoorbeeld 0,5 g fibrinogeen over 10 ml PBS in een schaal van 100 mm in plaats van een centrifugebuis van 50 ml. Het maximaliseren van de hoeveelheid oppervlakte van het verdunningsmiddel vermindert de hoeveelheid tijd die nodig is om het fibrinogeen te reconstitueren en vermindert potentiële klontering van eiwitten.ReconstitutieBreng 10 ml PBS over in een celkweekschaal van 100 mm en warm tot 37 °C in een celkweekincubator. Leg 0,5 g fibrinogeenpoeder over het gehele oppervlak van warme PBS en houd bij 37 °C totdat fibrinogeen volledig is opgelost. Dit mag niet meer dan 2 uur duren. Het oplossende poeder kan voorzichtig worden gezwenkt, maar schud het gerecht niet krachtig. Steriele filtratieZodra het poeder volledig is opgelost, laat u de oplossing door een filter van 100 μm lopen en verzamelt u deze in een conische buis van 50 ml om eventuele klonten gelled fibrinogeen te verwijderen. Giet de gefilterde oplossing in een spuit van 10 ml met een filter van 0,2 μm. Duw de oplossing door het filter en vang deze op in een nieuwe conische buis van 50 ml. Het filter moet mogelijk meer dan eens worden vervangen om alle 10 ml oplossing te steriliseren. Aliquot 300 ml steriel fibrinogeen in 1,5 ml microcentrifugebuizen en bewaren bij -20 °C. Ontdooi de aliquots op ijs of bij 4 °C indien nodig. Vermijd herhaaldelijk bevriezen/ontdooien. TrombineVoeg 6 ml PBS en 4 ml diH2O rechtstreeks toe aan één injectieflacon trombine (1 KU) om een trombinestockoplossing van 100 U/ml te maken. Filter steriliseren met een 0,2 μm filter, aliquot, en bewaren bij -20 °C in 1,5 ml plastic microcentrifugebuizen als trombine adsorbeert aan glas. Vermijd herhaaldelijk bevriezen/ontdooien. Poly(ethyleenimine)oplossing (PEI)LET OP: PEI is giftig. Gebruik geschikte PBM’s zoals aangegeven door de fabrikant.OPMERKING: PEI wordt geleverd als een 50% w/v-oplossing. Het is zeer stroperig en moeilijk te pipetteren. Maak een 0,1% oplossing van een 10% voorraadoplossing in plaats van rechtstreeks van de 50% w/v-oplossing.Meet 5 ml 50% w/v PEI-oplossing in een conische buis van 50 ml. Voeg 20 ml diH2O toe en meng tot een 10% stockoplossing. Deze sterk geconcentreerde stamoplossing kan niet steriel worden gefilterd. Om een 0,1% oplossing voor celkweek te maken, voegt u 5 ml 10% bouillon toe aan 495 ml diH2O. Steriel filter met behulp van een 500 ml filterkolf en bewaar bij RT niet langer dan 1 week. GlutaaraldehydeLET OP: Glutaaraldehyde is giftig. Gebruik geschikte PBM’s zoals aangegeven door de fabrikant.Glutaaraldehyde wordt geleverd als een 25% oplossing. Om een 0,01% oplossing te maken, voegt u 40 μL toe aan 99,6 ml diH2O. Steriel filter en bewaar bij 4 °C gedurende niet langer dan 1 week. Na de voorbereidingPlaats de verbruiksset voor het gieten van vloeistoffen in een steriele kweekkap. De gietset bevat een deksel, een paalrooster met 24 paar palen (één paar palen per put van een plaat met 24 putten) en een gespecialiseerde 24-putplaatbodem met 24 gietputten. Elke gietput bevat een sleuf in de bodem van de put om de cel / hydrogelcomponenten vast te houden en ze in een buisvormig weefsel te vormen terwijl de hydrogel polymeriseert (figuur 1B). Vul de putjes van een 24-putplaat met 1,5 ml/put van een 0,1% PEI-oplossing en plaats palen in de plaat zodat de uiteinden van elk paar palen onder water staan. Laat het 10 minuten zitten. PEI zal een positieve lading op de palen afzetten, zodat eiwitten in de hydrogel zich stevig aan de palen hechten tijdens het werpen van weefsel. Vul de putjes van een tweede 24-putplaat met 2 ml/put steriel diH2O en breng de palen over. Laat het 1 minuut staan. Vul in een derde plaat met 24 putten de putten met 1,5 ml / put van 0,01% glutaaraldehyde (GA) en breng de palen over. Laat het 30 minuten zitten. GA zal de positieve lading van PEI op de palen fixeren. Terwijl de palen in glutaaraldehyde zitten, zuigt u de diH 2 O-putten op, wast u met 2 ml / put steriel diH2 O, aspirateer en vult u deze bij met 2 ml / put steriel diH2O. Een verse, 24-well plaat kan worden gebruikt in plaats van te spoelen. Wanneer 30 minuten voorbij is, breng je de palen over naar de 2 ml / put van steriel diH2O. Laat het 1 minuut staan. Zuig de diH 2 Oaan en voeg nog eens 2 ml/putje steriel diH2O toe. Laat het 5 min zitten. Breng de palen over op een plaat met 24 putten om te drogen (ongeveer 15 min). Eenmaal droog, monteer je de gietkit opnieuw. Parafilm de randen om het deksel en de plaat samen af te sluiten en bewaar vervolgens bij 4 °C gedurende maximaal 72 uur voorafgaand aan het zaaien van de cel. Langere opslagtijden zijn waarschijnlijk mogelijk, maar zijn niet getest. 3. Weefselgietprotocol Voorbereiding van gietplatenKoel de weefselgietset voor op 4 °C. Breng een emmer ijs over in het BSC. Bereid op ijs 50 μL trombineoplossing (3 μL trombinebouillon + 47 μL EMT-medium) per te gieten put.OPMERKING: Zie stap 3.2.1 voor meer informatie over EMT-medium. Haal de gekoelde gietset uit de koelkast en plaats deze op een koud blok of ijs in de celkweekkap. Leg de gietplaat plat op ijs en verplaats het paalrooster van de gietplaat naar een nieuwe, steriele plaat met 24 putten. Pipetteer 50 μL trombineoplossing in elke voorgekoelde put van de gietplaat. Monteer de kit opnieuw en breng deze terug naar de koelkast totdat deze nodig is voor het gieten van weefsel. Giet de weefsels binnen 3 uur na trombine naast de putjes. CelvoorbereidingBereid EMT-basismedium, steriel filter voor en laat het op ijs staan.OPMERKING: Als celspecifiek gietmedium FBS bevat, gebruik dan warmte-geïnactiveerde FBS omdat het kan interageren met fibrinogeen en voortijdige polymerisatie kan veroorzaken.Bereid cardiaal EMT-medium voor: voeg 500 ml RPMI-medium, 10 ml B27 en 2,5 g aminocapronzuur toe. (Optioneel) Voeg 10 mM ROCK-remmer toe (voeg alleen toe aan het EMT-medium dat wordt gebruikt voor het gieten van weefsels en niet aan het volledige volume van 500 ml). Bereid skelet-EMT-medium voor: Voeg 50 ml F10-medium en 0,25 g aminocapronzuur (ACA) toe voor primaire EMT’s en 0,1 g ACA voor iPSC-afgeleide EMT’s. Verwarm het dissociatiereagens van celkweekkwaliteit tot 37 °C. Verwarm een gelijk volume EMT-medium om het dissociatiereagens te verdunnen.OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat het gebruikte protease volledig is geïnactiveerd. Actieve protease zal interfereren met 3D-weefselvorming en post-hechting. Was de cellen (figuur 1A) met PBS. Gebruik 2 ml/put voor een plaat met 6 putten. Gebruik respectievelijk 6 ml, 15 ml en 15 ml voor een schaal van 100 mm, T175-kolf en T225-kolf. Voeg het verwarmde dissociatiereagens van celkweekkwaliteit toe om de cellen op te tillen en incubeer bij 37 °C gedurende 5 minuten of totdat de cellen zijn opgetild. Gebruik voor hartkweken het 10x dissociatiereagens. Gebruik voor stromale cellen en skeletspiermyoblasten een 1x dissociatiereagens. Gebruik 1 ml/put voor een plaat met 6 putten, 3 ml voor een schaal van 100 mm, 8 ml voor een T175-kolf en 10 ml voor een T225-kolf. Controleer de culturen elke 2-3 minuten door op de zijkant van de plaat te tikken. Zodra de cellen zijn opgetild, brengt u ze over naar een conische buis van 50 ml en tritueert u ze met een P1000-pipet om een eencellige suspensie te garanderen. Was de plaat of kolf met een extra EMT-medium om de resterende cellen te verzamelen en voeg ze toe aan de conische buis. Gebruik 1 ml/put van het EMT-medium voor een plaat met 6 putten, 2 ml voor een schaal van 100 mm, 5 ml voor een T175-kolf en 5 ml voor een T225-kolf. Triturate de cellen om een enkele cel suspensie te garanderen. Voeg EMT-medium toe om het dissociatieproces te beëindigen en neem vervolgens monsters van de celsuspensies voor celtellingen. Gebruik 1 ml/put voor een plaat met 6 putten, 3 ml voor een schaal van 100 mm, 8 ml voor een T175-kolf en 10 ml voor een T225-kolf. Draai de cellen op 200 x g gedurende 4 min. Voer celtellingen uit met behulp van een hemacytometer en trypan blue terwijl suspensies worden gecentrifugeerd. Zuig het supernatant op en resuspensie de cellen in 5 ml EMT-basismedium om het resterende dissociatiereagens te verwijderen. Centrifugeer de cellen op 200 x g gedurende 4 min. Zuig het supernatant op en bereid de celsuspensies voor op de juiste dichtheden. Verhoog de levensduur en functie van 3D-skeletspier-EMT’s met de toevoeging van 10% -20% ECM-eiwitten in het EMT-medium14,16. Zaadstamcel-afgeleide cardiomyocyten en hun stromale cellen op respectievelijk 5 x 10 5 cellen en7,5 x 104 cellen per weefselconstruct. Zaai de skeletspiermyoblasten op 7,5 x 105 cellen per weefselconstructie. HartweefselZuig het supernatant op en resuspensie de stromale cellen met een dichtheid van 2,5 x 106 cellen per ml in EMT-medium en leg ze op ijs. Gebruik 30 μL van deze suspensie per EMT. Zuig het supernatant op en resuspensie de CM’s met een dichtheid van 8,3 x 106 cellen per ml in EMT-medium en leg ze op ijs. Gebruik 60 μL van deze suspensie per EMT. SkeletspierweefselsZuig het supernatant op en resuspendien de skeletspiercellen met een dichtheid van 8,3 x 106 cellen per ml in EMT-medium en leg ze op ijs. Gebruik 90 μL van deze suspensie per EMT. Bereken de volumes van elke celoplossing die nodig zijn om het gewenste aantal weefsels te vormen (bijvoorbeeld 60 μL van de bereide CMs en 30 μL van de bereide stromale cellen of 90 μL van de skeletspiercellen per EMT). Pipetteer de berekende volumes cellen in een conische buis van 15 ml. Voeg 10 μL fibrinogeen per EMT toe aan de celsuspensie en houd het op ijs. Totale reagentia en celvolumes per EMT: Zorg ervoor dat elke EMT 90 μL cellen, 10 μL fibrinogeen en 50 μL trombineoplossing bevat. WeefselgietenBreng de weefselgietset over op een celkweekkap en verwijder het deksel (postrooster met flexibele en stijve palen moet op de gietplaat blijven; Figuur 1B). Houd de gietplaat met paalrooster plat op ijs. Meng het cel/fibrinogeen mengsel en zuig 100 μL op met een P200-pipet. Voeg 100 μL van het mengsel toe aan putjes bereid met 50 μL trombineoplossing en tritueer 5 keer om goed te mengen. Duw de pipet niet voorbij de eerste stop en verwijder de punt na trituratie om te voorkomen dat er bubbels ontstaan. In dit stadium, en totdat het paalrooster klaar is om van de gietplaat te worden opgetild (stap 3.3.10), kan elke beweging van het rooster de langdurige hechting van het weefsel aan de palen in gevaar brengen. Houd zowel het rooster als de gietputplaat tegelijkertijd vast met de wijsvinger en duim van één hand om beweging van het rooster te voorkomen. Herhaal dit met een verse P200-tip voor elk weefsel totdat alle weefsels zijn gegoten. Meng celsuspensie in een conische buis van 15 ml voordat u elk weefsel giet, omdat cellen snel bezinken. Breng de gezaaide kit voorzichtig over naar de incubator en zorg ervoor dat u het rooster niet verplaatst. Beweging van rooster na het zaaien kan resulteren in verminderd succes bij het overbrengen van weefsels uit de gietputten. Incubeer bij 37 °C gedurende 80 minuten, ongeacht het celtype. Dit zal de polymerisatie van de hydrogel beginnen en eiwitten aan de palen laten hechten. Maak ondertussen een verse plaat met 24 putten met 2 ml / put van het EMT-medium voor hartweefsels. 10 mM ROCK-remmer kan desgewenst aan het EMT-medium worden toegevoegd. Incubeer de plaat bij 37 °C om het medium op te warmen. Bereid 2 ml/put groeimedium met 5 g/l aminocapronzuur (0,2 mm steriel gefilterd) voor primaire skeletspierweefsels of 2 g/l ACA voor van iPSC afgeleide EMT’s. Incubeer de plaat bij 37 °C om het medium op te warmen. Voeg na de incubatie voorzichtig 1 ml van het EMT-medium toe aan de rand van de gietputten en incubeer nog eens 10 minuten bij 37 °C, ongeacht het celtype. Dit zal de hydrogel losmaken van de randen van de gietput en een gemakkelijke overdracht van het weefsel mogelijk maken. Til na 10 minuten voorzichtig het paalrooster op en breng de weefsels over van de gietplaat naar een voorbereide 24-putplaat met medium (figuur 1C). Breng de platen met weefsels terug naar de celkweekincubator bij 37 °C. OnderhoudBreng na 24 uur de gegoten weefsels over naar een verse plaat met 24 ml /put van de EMT-media (zonder de ROCK-remmer als deze was opgenomen) en incubeer bij 37 °C. Voor skeletspiercellen schakelt u het groeimedium over naar het differentiatiemedium om myoblastfusie te bevorderen. Breng de hartweefsels over naar verse putten met 2 ml / put van het EMT-medium om de 2-3 dagen. Breng de skeletspierweefsels over naar verse putten met 2 ml / putdifferentiatiemedium met 5 g / L aminocapronzuur (0, 2 mm steriel gefilterd) om de 2-3 dagen. Gebruik 2 g/L ACA voor iPSC-afgeleide weefsels. Om te helpen bij mediumveranderingen, brengt u het paalrooster over op een verse 24-putplaat in plaats van het medium in dezelfde plaat te veranderen om te voorkomen dat de 3D-weefsels worden beschadigd. Bereid een tweede 24-well plaat met het EMT-medium en breng de weefsels over naar het verse medium. Houd de plaat met het oude medium naast de actieve cultuur om te gebruiken voor de volgende mediumwissel. Breng het paalrooster heen en weer tussen de twee platen gedurende de kweekperiode. U kunt ook een vers bord gebruiken voor elke mediumwissel. Meet de EMT-contractie via optische tracking van post-deflectie (figuur 1D) of magnetische detectiehardware13,14. Hartweefsels beginnen spontaan te kloppen na 3-4 dagen in cultuur. Skeletspierweefsels zijn meestal contractiel met elektrische veldstimulatie na 7 dagen in cultuur.