اختبار الأدوية قبل السريرية في أنسجة العضلات المهندسة 3D القابلة للتطوير
Summary
يوفر هذا البروتوكول طرقا لتوليد أنسجة العضلات القلبية والهيكلية المهندسة 3D ويصف استخدامها في طرق فحص الأدوية قبل السريرية. تستخدم الطرق الموصوفة نظام استشعار مغناطيسي لتسهيل التقييم المتزامن ل 24 نسيجا بالتوازي.
Abstract
يعد النمذجة الدقيقة للظروف الصحية والمرضية في المختبر أمرا حيويا لتطوير استراتيجيات علاجية وعلاجات جديدة. بالنسبة لأمراض القلب والعضلات والهيكل العظمي ، تشكل قوة الانقباض والحركية مقاييس رئيسية لتقييم وظيفة العضلات. جعلت الطرق الجديدة والمحسنة لتوليد أنسجة العضلات المهندسة (EMTs) من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات نمذجة الأمراض في المختبر أكثر موثوقية للأنسجة المقلصة ؛ ومع ذلك ، فإن تصنيع الأنسجة بشكل متكرر من مزارع الخلايا المعلقة وقياس انقباضها يمثل تحديا. غالبا ما تعاني هذه التقنيات من معدلات فشل عالية وتتطلب أجهزة معقدة وإجراءات تحليل بيانات مخصصة. منصة جديدة وجهاز يستخدم 3D EMTs جنبا إلى جنب مع مقايسة انقباض خالية من الملصقات ، متوازية للغاية ، وصديقة للأتمتة تتحايل على العديد من هذه العقبات. تتيح المنصة التصنيع السهل والقابل للتكرار ل 3D EMTs باستخدام أي مصدر خلوي تقريبا. ثم يتم قياس انقباض الأنسجة عبر أداة تقيس في وقت واحد 24 نسيجا دون الحاجة إلى إجراءات تحليل البرامج المعقدة. يمكن للأداة قياس التغيرات الميكرونيوتنية في القوة بشكل موثوق ، مما يسمح بفحص مركب يعتمد على الجرعة لقياس تأثير الدواء أو العلاج على الناتج المقلص. الأنسجة المهندسة المصنوعة من هذا الجهاز تعمل بكامل طاقتها ، وتولد ارتعاش وانقباضات كزازية عند التحفيز الكهربائي ، ويمكن تحليلها طوليا في الثقافة على مدى أسابيع أو أشهر. هنا ، نعرض بيانات من EMTs عضلة القلب تحت الجرعات الحادة والمزمنة مع المواد السامة المعروفة ، بما في ذلك دواء (BMS-986094) الذي تم سحبه من التجارب السريرية بعد وفيات المرضى بسبب سمية القلب غير المتوقعة. كما يتم تقديم وظيفة العضلات الهيكلية المتغيرة في الأنسجة المهندسة استجابة للعلاج بمثبط الميوسين. تمكن هذه المنصة الباحث من دمج أنظمة النماذج المعقدة والغنية بالمعلومات في سير عمل اكتشاف الأدوية مع الحد الأدنى من التدريب الإضافي أو المهارات المطلوبة.
Introduction
أصبحت نماذج الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) بشكل متزايد لاعبين رئيسيين في خط الأنابيب قبل السريري للاكتشاف والتطوير العلاجي ، بالإضافة إلى الأبحاث البيولوجية الأساسية ونمذجة الأمراض1،2،3،4،5. الأنسجة المقلصة ، مثل عضلة القلب والهيكل العظمي المشتقة من iPSCs تحمل إمكانات كبيرة لتحسين القوة التنبؤية للإنسان في الدراسات المختبرية كتقييم مباشر لقوة انقباض العضلات والحركية هي مقاييس كمية لدراسة وظيفة الأنسجة الكلية4،6،7،8. عادة ، تم الحصول على قياسات قوة الانقباض إما بشكل غير مباشر عن طريق التتبع البصري لانحراف الركيزة 9,10 أو مباشرة عن طريق ربط الخلايا / الأنسجة بمحول قوة4,11,12. هذه الطرق ، على الرغم من دقتها ، هي بطبيعتها منخفضة الإنتاجية وعادة ما تتطلب مشغلين ذوي مهارات عالية لجمع البيانات وتحليلها.
أظهرت الأعمال السابقة أن استشعار المجال المغناطيسي يتحايل على هذه العقبات ويوفر طريقة بديلة لتقييم وظيفة العضلات المهندسة في وقت واحد عبر تركيبات الأنسجةالمتعددة 13. تعتمد منصة Mantarray (محلل المغناطيسية لمصفوفة الأنسجة eNgineered) ثلاثية الأبعاد على هذه التقنية باستخدام جهاز قادر على قياس انقباض أنسجة العضلات المهندسة بطريقة متوازية للغاية تستفيد من تعقيد النماذج الخلوية ثلاثية الأبعاد مع فحص عالي الإنتاجية14. تتيح المنصة مراقبة كمية في الوقت الفعلي خالية من الملصقات لوظيفة الانقباض في أنسجة عضلة القلب والهيكل العظمي داخل أو خارج حاضنة زراعة الخلايا القياسية ، مما يلغي الحاجة إلى التصوير والتحليل المقلص القائم على البصريات. تسهل هذه التقنية المقارنة المباشرة لخطوط الخلايا السليمة والمريضة وتمكن من قياس تأثير الدواء على الأنسجة المقلصة ، وإنشاء بيانات قابلة للقياس الكمي ، في المختبر ، والسلامة ، والفعالية للمركبات العلاجية الجديدة والحالية.
يمكن تصنيع أنسجة العضلات ثلاثية الأبعاد المهندسة بين عمودين بطريقة قابلة للتكرار بدرجة عالية باستخدام لوحة Mantarray الاستهلاكية القابلة للاستهلاك و 24 بئرا (الشكل 1). وظيفة واحدة صلبة ، في حين أن العمود الآخر مرن ويحتوي على مغناطيس صغير. عندما ينقبض بناء الأنسجة ، فإنه يحل محل العمود المرن والمغناطيس المضمن. يتم وضع لوحة EMT داخل الجهاز ، ويتم قياس ما بعد الإزاحة عبر مجموعة من أجهزة الاستشعار المغناطيسية على لوحة دائرة أسفل حامل اللوحة. يتم تحويل التغييرات المقاسة في المجال المغناطيسي إلى قوة انقباض مطلقة باستخدام خوارزمية رياضية. تستخدم الأداة معدلات أخذ عينات سريعة من البيانات لتمكين جمع معلومات مفصلة حول القدرة الوظيفية ونضج نوع (أنواع) الخلية التي يتم فحصها ، بما في ذلك تردد الانكماش والسرعة ووقت الاضمحلال. يمكن الحصول على هذه القياسات الوظيفية عبر جميع الآبار ال 24 في وقت واحد مع منصة الاستشعار المغناطيسي أو بشكل فردي ومتسلسل باستخدام الطرق البصرية التقليدية.
تصف هذه الدراسة طريقة قابلة للتكرار بدرجة عالية لهندسة العضلات الهيكلية 3D والأنسجة الدقيقة القلبية في هيدروجيل قائم على الفيبرين. خلال تفاعل قصير مدته 80 دقيقة ، يحفز الثرومبين تحويل الفيبرينوجين إلى الفيبرين ، مما يوفر سقالة لخلايا العضلات لتتطور في الثقافة المعلقة15. تساعد الخلايا اللحمية في إعادة تشكيل المصفوفة وتصبح الأنسجة قابلة للانقباض حيث تشكل الخلايا العضلية خلية مخلوية داخل الهيدروجيل. تم تحليل انقباض هذه الأنسجة باستخدام نهج الاستشعار المغناطيسي ، قبل وبعد التعرض للمركب ، للتحقق من صحة هذه الطريقة لاستخدامها في دراسات الأدوية استجابة الجرعة. تم الحصول على الخلايا العضلية البشرية الأولية من خزعة من متبرع سليم تجاريا واستزراعها في 2D وفقا لبروتوكولات البائع. تم توسيع الخلايا باستخدام وسط نمو العضلات الهيكلية من خلال ثلاثة ممرات لتوليد أعداد كافية من الخلايا لتصنيع أنسجة 3D. تم استزراع الخلايا اللحمية والخلايا العضلية القلبية المشتقة من hiPSC وفقا لبروتوكول البائع لمدة 3 أيام للسماح بالتعافي من الحفظ بالتبريد قبل صب الخلايا في الأنسجة. وتقدم نتائج تمثيلية توضح أنواع مجموعات البيانات التي يمكن جمعها باستخدام منصة الاستشعار المغناطيسي. كما يتم تناول المزالق الشائعة المرتبطة بتوليد الأنسجة المهندسة باستخدام هذه الطرق.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصف هذه الدراسة طرق توليد أنسجة العضلات القلبية والهيكلية المهندسة 3D داخل مجموعة صب قابلة للاستهلاك 24 بئرا. باتباع هذه الطرق ، من الممكن تحقيق مجموعة كاملة من 24 نسيجا باستمرار دون أي فشل في الصب لفحص الأدوية اللاحق. تتمثل الاعتبارات الحاسمة لتحقيق مثل هذه النتيجة في التأكد من أنه أثناء الصب يتم تنفيذ جميع الخطوات على الجليد لمنع البلمرة المبكرة للهلاميات المائية ، وإزالة كاشف تفكك الخلايا قبل صب الأنسجة ، والخلط الشامل للخلية وتعليق الهيدروجيل لكل نسيج ، واستبدال أطراف الماصة بين الأنسجة ، واستخدام FBS المعطل بالحرارة (إذا تم استخدامه على الإطلاق). أيضا ، من المهم التأكد من عدم تحريك الشبكة البريدية بمجرد بدء الصب ونقلها برفق بمجرد تكوين الهلاميات المائية.
تشمل التعديلات الرئيسية استخدام أنواع مختلفة من الخلايا لتحقيق EMTs القلبية مقابل الهيكل العظمي وتعاطي المنشطات من الهلاميات المائية بتركيزات متغيرة من بروتينات الغشاء القاعدي لتعزيز النضج الخلوي واستقرار الأنسجة. يجب اختبار الآثار المفيدة لمثل هذه المنشطات على أساس كل حالة على حدة ، ولكن ثبت أنها تحسن النتائج الوظيفية وطول عمر الأنسجة في ظل ظروف معينة14،16،22. من الجدير بالذكر أيضا أن كثافات الخلايا المدرجة هي دليل وقد تحتاج إلى تحسين لخطوط الخلايا المختلفة. يمكن أيضا اعتبار تركيبات الهيدروجيل البديلة وسيلة لتعديل الخصائص الهيكلية والوظيفية ل EMTsالمحققة 23،24،25. تحتوي البيئة المكروية للعضلات الأصلية أيضا على أنواع خلايا داعمة لتعزيز الأوعية الدموية والتعصيب وترسب المصفوفة لدعم الخلايا العضلية في الشكل والوظيفة26,27. في حين أن النظام الموصوف هنا يدمج حاليا الخلايا الليفية في أنسجة القلب 3D ، فإن أنواع الخلايا الإضافية قد تخلق نموذجا أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية لدراسة سلامة وفعالية المركبات العلاجية في المختبر. في السابق ، تم دمج مجموعة من أنواع الخلايا الداعمة بنجاح في الأنسجة المهندسة ثلاثية الأبعاد مما يوفر نموذجا مثيرا للدراسة المستقبلية باستخدام منصة انقباض الاستشعار المغناطيسي28،29،30.
يركز استكشاف الأخطاء وإصلاحها لهذا البروتوكول على تكوين أنسجة غير موثوقة أو غير متسقة أثناء عملية الصب. يجب توخي الحذر لتجنب تكوين الفقاعات في الهلاميات المائية أثناء صبها مع الاستمرار في تسهيل التوزيع المتساوي للخلايا أثناء الخلط. من المحتمل أن تكون هناك حاجة إلى تجارب التحسين لكل نوع جديد من الخلايا لتحديد كثافة الخلايا المثالية ونسب الخلايا وتكوين المصفوفة.
أحد القيود الرئيسية لهذه التقنية هو العدد الكبير من الخلايا المطلوبة لإنشاء لوحة كاملة من 24 EMTs. بالنسبة للبيانات المقدمة هنا ، تم استخدام 15 مليون خلية عضلية قلبية و 18 مليون خلية عضلية هيكلية لكل لوحة. قد لا يتمكن بعض الباحثين من الوصول إلى مثل هذه المجموعات الكبيرة من المواد الخلوية ، مما قد يمنع قدرتهم على استخدام هذه المنصة إلى أقصى حد. إذا لم يكن لدى المستخدمين النهائيين إمكانية الوصول إلى أجهزة الاستشعار المغناطيسي ، فيجب إجراء قياسات الانحرافات اللاحقة بصريا ، مما يقلل بشكل كبير من الإنتاجية ويمنع التسجيل المتزامن لتقلصات العضلات عبر آبار متعددة. ومع ذلك ، فإن أجهزة Mantarray تتغلب على هذه القيود لتقديم أول نظام تجاري قادر على التحليل المستمر وغير الجراحي لانكماش EMT في وقت واحد عبر تركيبات متعددة.
يسهل الاستشعار المغناطيسي عبر 24 بئرا الدراسات الطولية للتطور الوظيفي EMT في الوقت الفعلي ويسمح بقياس دقيق للاستجابات الحادة للتلاعب الكيميائي أو البيئي أو الجيني. في حين أن الاستشعار المغناطيسي له العديد من المزايا مثل القياس المتزامن عبر أنسجة متعددة ، ولا يتطلب تحليلا معقدا للبيانات ، فإن طرق الكشف البصري تتيح القياس المتزامن للمقاييس الفسيولوجية مثل تدفق الكالسيوم أو رسم خرائط الجهد. ومع ذلك ، فإن مجموعات البيانات مثل تلك الموضحة في قسم النتائج توضح اتساع نطاق تطبيقات هذه التكنولوجيا في مجال تطوير الأدوية. بالنظر إلى أن عددا قليلا من المقايسات في السوق توفر الوسائل لإجراء تقييم مباشر للناتج المقلص في العضلات المهندسة ، فإن هذه الأساليب لديها القدرة على إحداث ثورة في خط أنابيب التطوير قبل السريري.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل جزئيا بتمويل من إدارة الغذاء والدواء (U01 FD006676-01 الممنوحة لمعهد العلوم الصحية والبيئية) وبتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (HL151094 إلى الدكتور جيس). نشكر الدكتور أليك س. ت. سميث على مساعدته في إعداد هذه المخطوطة.
Materials
| 100 µm cell strainer | CELLTREAT | 229485 | |
| 100 mm cell culture dish | ThermoFisher | 150466 | |
| 50 mL Steriflip filter | MilliporeSigma | SCGP00525 | |
| 500 mL filter flask | MilliporeSigma | S2GVU05RE | |
| 6-aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| Cardiosight Maintenance Medium | NEXEL | CM-002A | |
| Cardiosight Plating Medium | NEXEL | CM-020A | |
| C-Pace EM stimulator | IonOptix | EM | |
| Curi Bio Muscle Differentiation Media Kit | Primary – DIFF | ||
| Curi Bio Muscle Maintenance Media Kit | Curi Bio | Primary – MAINT | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Gibco | 10566-016 | |
| Dnase | Sigma | 11284932001 | |
| DPBS | Gibco | 14190-250 | |
| Dystrophin antibody | Abcam | ab154168 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | 10082147 | Must be heat-inactivated |
| Fibrinogen (Bovine) | Sigma | E8630 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
| Ham's F10 | Gibco | 11550043 | |
| Hemacytometer | Sigma | Z359629 | |
| HS-27A Fibroblasts | ATCC | CRL-2496 | |
| Human Skeletal Muscle Myoblasts | Lonza | CC-2580 | |
| Luer Lock 0.2 µm syringe filter | Corning | 431219 | |
| Luer Lock 10 mL syringe | BH Supplies | BH10LL | |
| Mantarray Instrument | Curi Bio | MANTA-24-B1 | System |
| Mantarray Plate Kits | Curi Bio | MA-24-SKM-5 | Pack of 5 kits |
| Mantarray stimulation lid | Curi Bio | EM | |
| Matrigel (ECM) | Corning | 356231 | |
| Nexel Cardiosight-S, Cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
| Optical Microscope | Nikon Ti2E | MEA54000 | |
| Pan Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF-20 | |
| Poly(ethyleneimine) | Sigma | P3143 | |
| ROCK inhibitor | StemCell Technologies | Y-27632 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| Skeletal Muscle Growth Medium (SkGM-2) | Lonza | CC-3245 | |
| Standard 24-well plates | Greiner | M8812 | Other manufacturer's plates will not fit |
| Standard 6-well plates | ThermoFisher | 140675 | |
| Stromal medium (DMEM + 20% FBS) | |||
| T175 Filter Flask | ThermoFisher | 159910 | |
| T225 Filter Flask | ThermoFisher | 159934 | |
| Thrombin | Sigma | T4648 | |
| Trypan Blue solution, 0.4% | ThermoFisher | 15250061 | |
| TrypLE Select Enzyme (10x) | Thermo Scientific | A1217702 | |
| TrypLE Select Enzyme (1x) | Thermo Scientific | 12563011 |
References
- Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening. Stem Cell Research & Therapy. 4, 150 (2013).
- Mudera, V., Smith, A. S. T., Brady, M. A., Lewis, M. P. The effect of cell density on the maturation and contractile ability of muscle derived cells in a 3D tissue-engineered skeletal muscle model and determination of the cellular and mechanical stimuli required for the synthesis of a postural phenotype. Journal of Cellular Physiology. 225 (3), 646-653 (2010).
- Vandenburgh, H., et al. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Human Gene Therapy. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).
- Fleming, J. W., et al. Bioengineered human skeletal muscle capable of functional regeneration. BMC Biology. 18 (1), 145 (2020).
- Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 4, 04885 (2015).
- Urciuolo, A., et al. Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale. PLOS One. 15 (5), 0232081 (2020).
- Afshar, M. E., et al. A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength. Scientific Reports. 10, 6918 (2020).
- Sakar, M. S., et al. Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators. Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).
- Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
- Khodabukus, A., Baar, K. Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (5), 349-357 (2011).
- Vandenburgh, H., et al. Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle & Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
- Bielawski, K. S., Leonard, A., Bhandari, S., Murry, C. E., Sniadecki, N. J. Real-time force and frequency analysis of engineered human heart tissue derived from induced pluripotent stem cells using magnetic sensing. Tissue Enineering Part C Methods. 22 (10), 932-940 (2016).
- Smith, A. S. T., et al. High-throughput, real-time monitoring of engineered skeletal muscle function using magnetic sensing. bioRxiv. , 492879 (2022).
- Scheraga, H. A. The thrombin-fibrinogen interaction. Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).
- Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle. Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).
- Carvalho, C., et al. Doxorubicin: the good, the bad and the ugly effect. Current Medicinal Chemistry. 16 (25), 3267-3285 (2009).
- Ahmad, T., et al. Cardiac dysfunction associated with a nucleotide polymerase inhibitor for treatment of hepatitis C. Hepatology. 62 (2), 409-416 (2015).
- Gill, M., et al. From the cover: Investigative nonclinical cardiovascular safety and toxicology studies with BMS-986094, an NS5b RNA-dependent RNA polymerase inhibitor. Toxicological Sciences. 155 (2), 348-362 (2017).
- Ostap, E. M. 2,3-Butanedione monoxime (BDM) as a myosin inhibitor. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 23 (4), 305-308 (2002).
- Fryer, M. W., Gage, P. W., Neering, I. R., Dulhunty, A. F., Lamb, G. D. Paralysis of skeletal muscle by butanedione monoxime, a chemical phosphatase. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 411 (1), 76-79 (1988).
- Fleming, J. W., et al. Functional regeneration of tissue engineered skeletal muscle in vitro is dependent on the inclusion of basement membrane proteins. Cytoskeleton. 76 (6), 371-382 (2019).
- Capel, A. J., et al. Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).
- Tsui, J. H., et al. Tunable electroconductive decellularized extracellular matrix hydrogels for engineering human cardiac microphysiological systems. Biomaterials. 272, 120764 (2021).
- Tsui, J. H., et al. Conductive silk-polypyrrole composite scaffolds with bioinspired nanotopographic cues for cardiac tissue engineering. Journal of Materials Chemistry B. 6 (44), 7185-7196 (2018).
- Gabella, G. Muscle cells, nerves, fibroblasts and vessels in the detrusor of the rat urinary bladder. Journal of Smooth Muscle Research. 55, 34-67 (2019).
- Christov, C., et al. Muscle satellite cells and endothelial cells: close neighbors and privileged partners. Molecular Biology of the Cell. 18 (4), 1397-1409 (2007).
- Bersini, S., et al. Engineering an environment for the study of fibrosis: A 3D human muscle model with endothelium specificity and endomysium. Cell Reports. 25 (13), 3858-3868 (2018).
- Gilbert-Honick, J., et al. Engineering functional and histological regeneration of vascularized skeletal muscle. Biomaterials. 164, 70-79 (2018).
- Maffioletti, S. M., et al. Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering. Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).
