בדיקות פרה-קליניות של תרופות ברקמות שריר מהונדסות תלת-ממדיות ניתנות להרחבה
Summary
פרוטוקול זה מספק שיטות ליצירת רקמות שרירי לב ושלד מהונדסות-תלת-ממדיות ומתאר את השימוש בהן בשיטות סינון תרופות פרה-קליניות. השיטות המתוארות משתמשות במערכת חישה מגנטית כדי להקל על הערכה בו זמנית של 24 רקמות במקביל.
Abstract
מידול מדויק של מצבים בריאים ומחלות במבחנה חיוני לפיתוח אסטרטגיות טיפול וטיפולים חדשים. עבור מחלות לב ושרירי שלד, כוח התכווצות וקינטיקה מהווים מדדי מפתח להערכת תפקוד השרירים. שיטות חדשות ומשופרות ליצירת רקמות שריר מהונדסות (EMTs) מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים הפכו מודלים של מחלות חוץ גופיות לאמינים יותר עבור רקמות התכווצות; עם זאת, ייצור רקמות מתרביות תאים מרחפים ומדידת ההתכווצות שלהן הוא מאתגר. טכניקות כאלה סובלות לעתים קרובות משיעורי כישלון גבוהים ודורשות מכשור מורכב ושגרות ניתוח נתונים מותאמות אישית. פלטפורמה ומכשיר חדשים המשתמשים בחובשים תלת-ממדיים בשילוב עם בדיקת חוזיות נטולת תוויות, מקבילית מאוד וידידותית לאוטומציה עוקפים רבים מהמכשולים הללו. הפלטפורמה מאפשרת ייצור קל וניתן לשחזור של חובשים תלת-ממדיים באמצעות כמעט כל מקור סלולרי. לאחר מכן נמדדת התכווצות הרקמה באמצעות מכשיר המודד בו זמנית 24 רקמות ללא צורך בשגרות ניתוח תוכנה מורכבות. המכשיר יכול למדוד באופן אמין שינויים בכוח המיקרוניוטון, ומאפשר בדיקת תרכובת תלוית מינון כדי למדוד את ההשפעה של תרופה או טיפול על תפוקת התכווצות. רקמות מהונדסות, המיוצרות באמצעות מכשיר זה, מתפקדות באופן מלא, מייצרות התכווצויות עוויתות וטטניות על גירוי חשמלי, וניתן לנתח אותן לאורך זמן בתרבית במשך שבועות או חודשים. כאן, אנו מציגים נתונים מחובשים של שרירי לב במינון חריף וכרוני עם רעילים ידועים, כולל תרופה (BMS-986094) שנמשכה מניסויים קליניים לאחר מקרי מוות של מטופלים עקב רעילות לב בלתי צפויה. כמו כן מוצג שינוי בתפקוד שרירי השלד ברקמות מהונדסות, בתגובה לטיפול במעכב מיוזין. פלטפורמה זו מאפשרת לחוקר לשלב מערכות מודל מורכבות ועשירות במידע ביולוגי בתהליך העבודה של גילוי התרופות שלו עם מינימום הכשרה נוספת או מיומנויות נדרשות.
Introduction
מודלים של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) הופכים יותר ויותר לשחקני מפתח בצנרת הפרה-קלינית לגילוי ופיתוח טיפולי, כמו גם מחקר ביולוגי בסיסי ומידול מחלות 1,2,3,4,5. רקמות התכווצות, כגון שרירי לב ושלד שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים טומנים בחובם פוטנציאל גדול לשיפור כוח הניבוי של מחקרי מבחנה אנושיים, שכן הערכה ישירה של כוח התכווצות השרירים והקינטיקה הם מדדים כמותיים לחקר תפקוד הרקמה הכולל 4,6,7,8. בדרך כלל, מדידות של כוח התכווצות הושגו בעקיפין על ידי מעקב אופטי של סטיית המצע9,10 או ישירות על ידי חיבור של תאים/רקמות למתמר כוח 4,11,12. שיטות אלה, למרות שהן מדויקות, הן בעלות תפוקה נמוכה מטבען ובדרך כלל דורשות מפעילים מיומנים מאוד לאסוף ולנתח נתונים.
עבודות קודמות הראו כי חישת שדה מגנטי עוקפת מכשולים אלה ומספקת שיטה חלופית להערכת תפקוד שרירים מהונדסים בו זמנית על פני מבני רקמות מרובים13. פלטפורמת ההתכווצות התלת-ממדית Mantarray (Magnetometric Analyzer for eNgineered Tissue ARRAY) מתבססת על טכנולוגיה זו באמצעות מכשיר המסוגל למדוד את ההתכווצות של רקמות שריר מהונדסות באופן מקביל מאוד הממנף את המורכבות של מודלים סלולריים תלת-ממדיים עם סינון בתפוקה גבוהה יותר14. הפלטפורמה מאפשרת ניטור כמותי ובזמן אמת ללא תוויות של תפקוד ההתכווצות ברקמות שרירי הלב והשלד בתוך או מחוץ לאינקובטור סטנדרטי של תרביות תאים, ומבטלת את הצורך בהדמיה וניתוח כיווץ אופטיים. טכנולוגיה זו מאפשרת השוואה ישירה של קווי תאים בריאים וחולים ומאפשרת מדידה של השפעת התרופה על רקמות התכווצות, תוך קביעת נתוני בטיחות ויעילות הניתנים לכימות, במבחנה, עבור תרכובות טיפוליות חדשות וקיימות.
רקמות שריר תלת-ממדיות מהונדסות-יכולות להיות מיוצרות בין שני עמודים באופן שניתן לשכפל באמצעות לוח יציקה מתכלה של Mantarray בעל 24 בארות (איור 1). עמוד אחד קשיח, ואילו המוצב השני גמיש ומכיל מגנט קטן. כאשר מבנה הרקמה מתכווץ, הוא מחליף את העמוד הגמיש ואת המגנט המשובץ. לוחית החובש ממוקמת בתוך המכשיר, והתזוזה לאחר מכן נמדדת באמצעות מערך חיישנים מגנטיים על לוח מעגלים מתחת למחזיק הצלחת. השינויים הנמדדים בשדה המגנטי מומרים לכוח כיווץ מוחלט באמצעות אלגוריתם מתמטי. המכשיר משתמש בקצב דגימת נתונים מהיר כדי לאפשר איסוף מידע מפורט על היכולת התפקודית והבשלות של סוגי התאים הנבדקים, כולל תדירות התכווצות, מהירות וזמן דעיכה. מדידות פונקציונליות אלה ניתנות להשגה בכל 24 הבארות בו זמנית באמצעות פלטפורמת החישה המגנטית או בנפרד וברצף בשיטות אופטיות מסורתיות.
מחקר זה מתאר שיטה בעלת יכולת שחזור גבוהה להנדסת שרירי שלד תלת-ממדיים ומיקרו-רקמות לב בהידרוג’ל מבוסס פיברין. במהלך תגובה קצרה, בת 80 דקות, תרומבין מזרז את הפיכת הפיברינוגן לפיברין, ומספק פיגום לתאי שריר להתפתח בתרבית מרחפת15. תאי סטרומה עוזרים לעצב מחדש את המטריצה והרקמות מתכווצות כאשר תאי שריר יוצרים סינקיטיום בתוך ההידרוג’ל. ההתכווצות של רקמות אלה נותחה באמצעות גישת החישה המגנטית, הן לפני והן אחרי חשיפה לתרכובת, ואישרה שיטה זו לשימוש במחקרי תרופות במינון תגובה. מיובלסטים אנושיים ראשוניים מביופסיה בריאה של תורם הושגו באופן מסחרי וגודלו בתרבית בדו-ממד על פי הפרוטוקולים של הספק. התאים הורחבו באמצעות מדיום צמיחת שרירי השלד דרך שלושה מעברים כדי ליצור מספר תאים מספיק כדי לייצר רקמות תלת-ממדיות. תאי סטרומה וקרדיומיוציטים שמקורם ב-hiPSC גודלו בתרבית על פי פרוטוקול הספק במשך 3 ימים כדי לאפשר התאוששות משימור בהקפאה לפני יציקת תאים לרקמות. תוצאות מייצגות מסופקות הממחישות את סוגי ערכות הנתונים שניתן לאסוף באמצעות פלטפורמת החישה המגנטית. מלכודות נפוצות הקשורות לייצור רקמות מהונדסות באמצעות שיטות אלה מטופלות גם הן.
Protocol
1. פרוטוקול תרבית תאים תרבות מיובלסט אנושית ראשוניתלדלל את המטריצה החוץ תאית (ECM) ביחס של 1:100 ב-8 מ”ל של תווך DMEM/F12 על קרח. יש למרוח 8 מ”ל של תמיסת ECM על בקבוק T175 אחד ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך שעה לפחות אחת לפני זריעת תאים, אך לא יותר מ-24 שעות. ודא שתמיסת ECM מכסה את כל תחתית הבקבוק. Aliquot 5 מ”ל של מדיום צמיחת שרירי השלד עד צינור חרוטי 15 מ”ל. הפשיר בקבוקון קפוא של תאים (5.0 x 10,5 מיובלסטים) באמבט מים ב 37 ° C במשך 2 דקות או עד הקרח הוא פשוט נמס. רססו את הבקבוקון באתנול 70% והעבירו אותו לארון בטיחות ביולוגית (BSC). העבר את התאים לתוך המדיום aliquoted באמצעות P1000. אל תטריטורציה. צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם במשך 3 דקות. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים ב-1 מ”ל של מדיום הגידול באמצעות פיפטה P1000 כדי להשיג תרחיף של תא יחיד. לשטוף את בקבוק מצופה ECM עם 15 מ”ל של DPBS. שואפים DPBS, ולאחר מכן להוסיף 30 מ”ל של מדיום הגידול לצלוחית. הוסף 4 מ”ל של מדיום הגידול לתאים, ערבב והפיץ את תרחיף התא לתוך צלוחיות T-175. ודא כי נפח הכולל הוא 35 מ”ל. החליקו את הבקבוק בעדינות לאורך משטח העבודה שמאלה וימינה 5-6 פעמים ולאחר מכן קדימה ואחורה 5-6 פעמים כדי להבטיח פיזור אחיד של התאים על משטח הבקבוק. הכניסו את בקבוק T-175 לאינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2. תרבית את התאים במשך 3 ימים או עד שהם מגיעים לא יותר מ 70% מפגש, ולאחר מכן לעבור את התאים. העברת מיובלסטים אנושיים ראשונייםלדלל את ECM ביחס של 1:100 ב 30 מ”ל של DMEM/F12 בינוני על קרח. יש למרוח 10 מ”ל של תמיסת ECM על שלוש צלוחיות T225 ולדגור בטמפרטורה של 37°C לפחות שעה אחת לפני זריעת תאים, אך לא יותר מ-24 שעות. ודא שתמיסת ECM מכסה את כל תחתית הבקבוק. לשטוף את התאים עם 15 מ”ל של DPBS. לשאוף ולהוסיף את מגיב הדיסוציאציה בהתאם לפרוטוקול של הספק. לאחר הסרת התאים, עצרו את התגובה בהתאם לפרוטוקול של הספק ואספו את התאים לתוך צינור חרוט. צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם במשך 3 דקות. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים ב-1 מ”ל של מדיום הגידול באמצעות פיפטה P1000 כדי להשיג תרחיף של תא יחיד. לשטוף את בקבוק מצופה ECM עם 15 מ”ל של DPBS. שאפו DPBS, ולאחר מכן הוסיפו 40 מ”ל של מדיום הגידול לכל בקבוק T225. הוסף 14 מ”ל של מדיום הגידול לתרחיף התא, ערבב והפץ 5 מ”ל של תרחיף התא לכל בקבוק T225. ודא כי נפח הכולל בכל בקבוק הוא 45 מ”ל. החליקו את הבקבוק בעדינות לאורך משטח העבודה שמאלה וימינה 5-6 פעמים ולאחר מכן קדימה ואחורה 5-6 פעמים כדי להבטיח פיזור אחיד. הכניסו את הצלוחיות לאינקובטור תרבית התאים בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2. תאי תרבית במשך 2-3 ימים או עד שהם מגיעים לא יותר מ 70% מפגש, ולאחר מכן מעבר. לפצל את התאים ב- 1:3 או 1:4 בכל מעבר ולזרע בין 3 x 103 ו- 1 x 104 תאים לס”מ2. תרבית קרדיומיוציטים הנגזרים מ-hiPSCיש לדלל את ה-ECM ביחס של 1:60 ב-12 מ”ל של מדיום DMEM/F12 על קרח. החל 1 מ”ל של תמיסת ECM על כל באר של שתי צלחות 6 בארות ודגר ב 37 ° C לפחות 1 שעה לפני זריעת תאים, אבל לא יותר מ 24 שעות. הפשיר בקבוקון קפוא של cardiomyocytes באמבט מים ב 37 ° C במשך 2 דקות או עד הקרח הוא פשוט נמס. רססו את הבקבוקון באתנול 70% והעבירו אותו ל-BSC. השתמש פיפטה p1000 כדי להעביר את התאים מופשרים לתוך צינור חרוטי 50 מ”ל. שטפו את הקריוביאל הריק עם 1 מ”ל של ציפוי בטמפרטורת החדר (RT) כדי לשחזר את התאים הנותרים. שחררו באיטיות את 1 מ”ל של אמצעי השטיפה טיפה (טיפה אחת כל 5 שניות) לתוך הצינור החרוטי של התאים במשך 90 שניות. מערבלים ללא הרף את הצינור כדי לערבב את התאים במהלך הוספת המדיה האיטית. להוסיף לאט 8 מ”ל של מדיום ציפוי באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ”ל צינור חרוטי 50 מ”ל של תאים. לאחר כל המדיה הוא חילק, פיפטה בעדינות למעלה ולמטה 3 פעמים כדי לערבב את התאים ביסודיות. ספירת תאים באמצעות hemacytometer ו trypan כחול. צנטריפוגה את התאים בצינור החרוטי 50 מ”ל ב 300 x גרם במשך 3 דקות. לאחר הטלת התאים, שאפו את הסופרנטנט. השתמש פיפטה p1000 להעביר 1 מ”ל של מדיום ציפוי לצינור בעדינות לפרק את הגלולה על ידי pipeting איטי למעלה ולמטה 3-5 פעמים. השהה מחדש את התאים עם אמצעי ציפוי נוסף. זרעים בין 2-4 x 10 6 תאים לכל באר של צלחת6 באר ב 2 מ”ל של מדיום הציפוי. שטפו את צלחות 6 הבארות מצופות ECM עם DPBS (2 מ”ל/באר). פיפטה 2 מ”ל של השעיית תאים לכל באר של צלחת 6 באר. הזיזו את הלוחות בעדינות לאורך משטח העבודה שמאלה וימינה 5-6 פעמים ולאחר מכן קדימה ואחורה 5-6 פעמים כדי להבטיח פיזור אחיד של התאים על משטחי הצלחת. הכניסו את הצלחת לאינקובטור תרביות התאים בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2. חזור על שלבים 1.3.3-1.3.16 כדי שכל בקבוקוני התאים יופתרו. יש להחליף ל-3-5 מ”ל (תלוי בקו התא ובצפיפותו) של מדיום התחזוקה למחרת לאחר הציפוי, ולאחר מכן להחליף את המדיום אחת ליומיים. תרבית תאים במשך 3-4 ימים לפני יציקה לתוך רקמות 3D. תרבית תאי סטרומהיש למרוח 30 מ”ל של תמיסת ECM על בקבוק T175 ולדגור בטמפרטורה של 37°C לפחות שעה אחת לפני זריעת תאים, אך לא יותר מ-24 שעות. Aliquot 5 מ”ל של מדיום תא סטרומה לתוך צינור חרוטי 15 מ”ל. הפשירו בקבוקון קפוא של תאי סטרומה באמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך 2 דקות או עד שהקרח פשוט נמס. רססו את הבקבוקון באתנול 70% והעבירו אותו ל-BSC. השתמש פיפטה p1000 כדי להוסיף לאט 1 מ”ל של תווך תא סטרומה לתאים מופשרים בבקבוקון. מעבירים את תרחיף התא מהבקבוקון למדיית ההפשרה הנותרת בצינור החרוט. השתמש פיפטה סרולוגית 5 מ”ל כדי לערבב את התאים. פיפטה למעלה ולמטה 3 פעמים. לספור את התאים באמצעות hemacytometer ו trypan כחול. אין לסובב תאים. שטפו את בקבוק T175 המצופה ECM עם 15 מ”ל של DPBS. מעבירים את תאי הסטרומה לבקבוק בצפיפות של 3-4 x 103 תאים לסמ”ק2. החליקו את הבקבוק בעדינות לאורך משטח העבודה שמאלה וימינה 5-6 פעמים ולאחר מכן קדימה ואחורה 5-6 פעמים כדי להבטיח פיזור אחיד של התאים על משטח הבקבוק. שנה מדיה למחרת עם 45 מ”ל של תווך תא סטרומה מחומם. תרבית את התאים במשך 3-4 ימים לפני יציקה לתוך רקמות 3D. 2. הכנת החומר פיברינוגןהערה: בעת בנייה מחדש של פיברינוגן, יש להקפיד למקסם את שטח הפנים שעליו אבקת הפיברינוגן מונחת בשכבות. בפרוטוקול זה, כמות המדלל בה נעשה שימוש הותאמה לגודל המיכל בו נעשה שימוש, כלומר, נעשה שימוש במספיק מדלל כדי לכסות את תחתית המנה. לדוגמה, שכבה 0.5 גרם של פיברינוגן מעל 10 מ”ל של PBS בצלחת 100 מ”מ במקום צינור צנטריפוגה 50 מ”ל. מקסום שטח הפנים של המדלל יפחית את משך הזמן הדרוש לבנייה מחדש של הפיברינוגן ויפחית את פוטנציאל ההתגבשות של החלבון.חוקה מחדשמעבירים 10 מ”ל PBS לצלחת תרבית תאים בקוטר 100 מ”מ ומחממים ל-37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרביות תאים. יש להניח 0.5 גרם אבקת פיברינוגן על כל פני השטח של PBS חם ולשמור על טמפרטורה של 37°C עד לפיברינוגן מומס במלואו. זה אמור לקחת לא יותר מ 2 שעות. ניתן לערבל בעדינות את האבקה המומסת, אך אין לנער במרץ את המנה. סינון סטרילילאחר שהאבקה התמוססה במלואה, העבירו את התמיסה דרך מסנן של 100 מיקרומטר ואספו אותה לתוך צינור חרוטי של 50 מ”ל כדי להסיר גושים של פיברינוגן ג’ל. יוצקים את התמיסה המסוננת לתוך מזרק 10 מ”ל מכוסה עם מסנן 0.2 מיקרומטר. לדחוף את הפתרון דרך המסנן ולאסוף אותו לתוך צינור חרוטי חדש 50 מ”ל. ייתכן שיהיה צורך להחליף את המסנן יותר מפעם אחת כדי לעקר את כל 10 מ”ל של תמיסה. Aliquot 300 מ”ל של פיברינוגן סטרילי לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ”ל ולאחסן ב -20 ° C. הפשירו את האליציטוטים על קרח או בטמפרטורה של 4°C לפי הצורך. יש להימנע מהקפאה/הפשרה חוזרת. טרומביןהוסף 6 מ”ל של PBS ו 4 מ”ל של diH2O ישירות לתוך בקבוקון אחד של תרומבין (1 KU) כדי ליצור פתרון מלאי תרומבין 100 U/mL. מסננים לעקר עם מסנן 0.2 מיקרומטר, aliquot, ולאחסן ב -20 ° C ב 1.5 מ”ל צינורות מיקרוצנטריפוגות פלסטיק כמו טרומבין סופח זכוכית. יש להימנע מהקפאה/הפשרה חוזרת. פתרון פולי(אתילן) (PEI)זהירות: PEI רעיל. השתמש בציוד הגנה אישי מתאים כפי שנקבע על-ידי היצרן.הערה: PEI מסופק כפתרון 50% w/v. הוא צמיג מאוד וקשה לפיפטה. צור פתרון של 0.1% מתמיסת מלאי של 10% ולא ישירות מתמיסת 50% w/v.מדוד 5 מ”ל של תמיסת 50% w/v PEI בצינור חרוטי של 50 מ”ל. הוסף 20 מ”ל של diH2O וערבב כדי להניב פתרון מלאי של 10%. פתרון מלאי מרוכז מאוד זה אינו יכול להיות מסונן סטרילי. כדי ליצור פתרון של 0.1% לתרבית תאים, הוסף 5 מ”ל של 10% מלאי ל 495 מ”ל diH2O. מסנן סטרילי באמצעות בקבוק מסנן 500 מ”ל ואחסן ב- RT לא יותר משבוע אחד. גלוטראלדהידזהירות: גלוטראלדהיד רעיל. השתמש בציוד הגנה אישי מתאים כפי שנקבע על-ידי היצרן.גלוטראלדהיד מסופק כתמיסה של 25%. כדי ליצור פתרון 0.01%, הוסף 40 μL ל 99.6 מ”ל של diH2O. מסנן סטרילי ואחסן ב 4 ° C לא יותר משבוע אחד. לאחר ההכנההניחו ערכת יציקת רקמות מתכלה בתוך מכסה מנוע סטרילי של תרבית. ערכת היציקה מכילה מכסה, סריג דואר המכיל 24 זוגות עמודים (זוג עמודים אחד לכל באר של צלחת בת 24 בארות), ותחתית צלחת מיוחדת בת 24 בארות המכילה 24 בארות יציקה. כל באר יציקה מכילה תעלה בתחתית הבאר כדי להחזיק את רכיבי התא/הידרוג’ל ולעצב אותם לרקמה בצורת צינור בזמן שההידרוג’ל מתפלמר (איור 1B). מלאו את הבארות של צלחת בת 24 בארות ב-1.5 מ”ל/באר של תמיסת PEI 0.1% והניחו עמודים בצלחת כך שהקצוות של כל זוג עמודים יהיו שקועים. תן לזה לשבת במשך 10 דקות. PEI יפקיד מטען חיובי על העמודים, כך חלבונים בהידרוג’ל להיצמד היטב לעמודים במהלך יציקת רקמות. ממלאים את הבארות של צלחת שנייה בת 24 בארות ב-2 מ”ל/באר של diHסטרילי 2O ומעבירים את העמודים. תן לזה לשבת במשך 1 דקה. בצלחת שלישית בת 24 בארות, ממלאים את הבארות ב-1.5 מ”ל/באר של 0.01% גלוטראלדהיד (GA) ומעבירים את העמודים. תן לזה לשבת במשך 30 דקות. GA יתקן את המטען החיובי מ- PEI לפוסטים. בזמן שהעמודים יושבים בגלוטראלדהיד, שואפים את בארות diH 2 O,שוטפים עם 2 מ”ל / באר של diH סטרילי 2 O, שואפים וממלאים מחדש עם 2 מ”ל / באר של diHסטרילי 2O. ניתן להשתמש בצלחת טרייה עם 24 בארות במקום לשטוף. כאשר 30 דקות נגמר, להעביר את ההודעות 2 מ”ל / באר של סטרילי diH2O. תן לזה לשבת במשך 1 דקה. שואפים את diH 2 O ומוסיפים עוד 2 מ”ל/באר של diHסטרילי 2O. תן לזה לשבת במשך 5 דקות. מעבירים את העמודים לצלחת בת 24 בארות לייבוש (כ-15 דקות). לאחר הייבוש, הרכיבו מחדש את ערכת היציקה. פרפילם את הקצוות כדי לאטום את המכסה ואת הצלחת יחד, ולאחר מכן לאחסן ב 4 ° C עד 72 שעות לפני זריעת התא. סביר להניח שזמני אחסון ארוכים יותר אפשריים אך לא נבדקו. 3. פרוטוקול יציקת רקמות הכנת צלחת יציקהמצננים מראש את ערכת יציקת הרקמה ב-4°C. מעבירים דלי קרח לתוך ה-BSC. על קרח, להכין 50 μL של תמיסת תרומבין (3 μL של מלאי תרומבין + 47 μL של מדיום EMT) לכל באר להיות יצוק.הערה: ראה שלב 3.2.1 לקבלת פרטים על מדיום EMT. הוציאו את ערכת היציקה המצוננת מהמקרר והניחו אותה על גוש קר או קרח בתוך מכסה המנוע של תרבית התא. הניחו את צלחת היציקה שטוחה על קרח והעבירו את סריג העמוד מצלחת היציקה לצלחת חדשה וסטרילית בת 24 בארות. פיפטה 50 μL של תמיסת טרומבין לתוך כל באר מצוננת מראש של צלחת היציקה. מרכיבים מחדש את הערכה ומחזירים אותה למקרר עד לצורך יציקת רקמות. יצקו את הרקמות בתוך 3 שעות של תרומבין בנוסף הבארות. הכנת תאיםהכינו פילטר בינוני וסטרילי של בסיס EMT והשאירו על קרח.הערה: אם מדיום יציקה ספציפי לתא מכיל FBS, השתמש ב- FBS מומת חום מכיוון שהוא עלול לקיים אינטראקציה עם פיברינוגן ולגרום לפילמור מוקדם.הכן מדיום חובש לב: הוסף 500 מ”ל של מדיום סל”ד, 10 מ”ל של B27, ו 2.5 גרם של חומצה אמינוקפרואית. (אופציונלי) הוסף מעכב ROCK 10 mM (הוסף רק למדיום EMT המשמש ליציקת רקמות ולא לכל נפח 500 מ”ל). הכן מדיום EMT שלד: הוסף 50 מ”ל של מדיום F10 ו- 0.25 גרם של חומצה אמינוקפרואית (ACA) עבור EMT ראשוניים ו- 0.1 גרם של ACA עבור EMT הנגזרים מ- iPSC. לחמם את מגיב דיסוציאציה כיתה תרבית התא ל 37 ° C. לחמם נפח שווה של מדיום EMT כדי לדלל את מגיב הדיסוציאציה.הערה: קריטי שהפרוטאז שבו נעשה שימוש יושבת לחלוטין. פרוטאז פעיל יפריע להיווצרות רקמות תלת ממדיות ולהידבקות לאחר מכן. שטפו את התאים (איור 1A) עם PBS. השתמש 2 מ”ל / באר עבור צלחת 6 באר. השתמש ב- 6 מ”ל, 15 מ”ל ו- 15 מ”ל עבור צלחת 100 מ”מ, צלוחיות T175 ו- T225, בהתאמה. הוסף את מגיב הדיסוציאציה בדרגת תרבית תאים מחוממת כדי להרים את התאים ולדגור ב 37 ° C במשך 5 דקות או עד שהתאים התרוממו. עבור תרביות לב, השתמש מגיב דיסוציאציה 10x. עבור תאי סטרומה ומיובלסטים של שרירי השלד, השתמש מגיב דיסוציאציה 1x. יש להשתמש ב-1 מ”ל/באר עבור צלחת בעלת 6 בארות, 3 מ”ל עבור צלחת של 100 מ”מ, 8 מ”ל עבור צלוחיות T175 ו-10 מ”ל עבור צלוחיות T225. בדוק את התרביות כל 2-3 דקות על ידי הקשה על הצד של הצלחת. לאחר שהתאים התרוממו, העבירו אותם לצינור חרוטי בנפח 50 מ”ל ובצעו טריטורציה עם פיפטה P1000 כדי להבטיח השעיה חד-תאית. שטפו את הצלחת או הבקבוק עם מדיום EMT נוסף כדי לאסוף את התאים הנותרים ולהוסיף אותם לצינור החרוט. השתמש 1 מ”ל / באר של מדיום EMT עבור צלחת 6 בארות, 2 מ”ל עבור צלחת 100 מ”מ, 5 מ”ל עבור בקבוק T175, ו 5 מ”ל עבור בקבוק T225. שלשו את התאים כדי להבטיח השעיה של תא יחיד. הוסף מדיום EMT כדי לסיים את תהליך הדיסוציאציה, ולאחר מכן לקחת דגימות של השעיית התא עבור ספירת תאים. יש להשתמש ב-1 מ”ל/באר עבור צלחת בעלת 6 בארות, 3 מ”ל עבור צלחת של 100 מ”מ, 8 מ”ל עבור צלוחיות T175 ו-10 מ”ל עבור צלוחיות T225. סובב את התאים ב 200 x גרם במשך 4 דקות. בצע ספירת תאים באמצעות hemacytometer ו trypan כחול בזמן המתלים הם צנטריפוגה. לשאוף את supernatant ולהשהות מחדש את התאים ב 5 מ”ל של מדיום בסיס EMT כדי להסיר את מגיב דיסוציאציה שיורית. צנטריפוגה את התאים ב 200 x גרם במשך 4 דקות. שאפו את הסופרנאטנט והכינו את מתלי התא בצפיפויות המתאימות. הגדל את תוחלת החיים והתפקוד של EMT שרירי שלד 3D עם תוספת של 10%-20% חלבוני ECM בתווך EMT14,16. קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע זרעים ותאי הסטרומה שלהם ב 5 x 105 תאים ו 7.5 x 104 תאים לכל מבנה רקמה, בהתאמה. זרעו את שרירי השלד מיובלסטים ב 7.5 x 105 תאים לכל מבנה רקמה. רקמות לבשאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את תאי הסטרומה בצפיפות של 2.5 x 106 תאים למ”ל בתווך EMT והניחו אותם על קרח. השתמש 30 μL של השעיה זו לכל EMT. שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את CMs בצפיפות של 8.3 x 106 תאים למ”ל בתווך EMT והניחו אותם על קרח. השתמש 60 μL של השעיה זו לכל EMT. רקמות שרירי השלדשאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את תאי שריר השלד בצפיפות של 8.3 x 106 תאים למ”ל בתווך EMT והניחו אותם על קרח. השתמש 90 μL של השעיה זו לכל EMT. חשב את הנפחים של כל תמיסת תאים הנדרשת כדי להרכיב את מספר הרקמות הרצוי (למשל, 60 מיקרוליטר של CMs מוכנים ו 30 μL של תאי סטרומה מוכנים או 90 μL של תאי שריר השלד לכל EMT). פיפטה את הכרכים המחושבים של תאים לתוך צינור חרוטי 15 מ”ל. הוסף 10 μL של פיברינוגן לכל EMT לתרחיף התא ושמור אותו על קרח. סך כל ריאגנטים ונפחי תאים לכל EMT: ודא שלכל EMT יש 90 μL תאים, 10 μL של פיברינוגן, ו 50 μL של תמיסת תרומבין. יציקת רקמותמעבירים את ערכת יציקת הרקמה למכסה מנוע של תרבית תאים ומסירים את המכסה (סריג פוסט המכיל עמודים גמישים וקשיחים צריך להישאר על צלחת היציקה; איור 1B). שמור את צלחת היציקה עם סריג פוסט מונח שטוח על קרח. ערבבו את תערובת התא/פיברינוגן וציירו 100 μL עם פיפטה P200. מוסיפים 100 μL של התערובת לבארות שהוכנו עם 50 μL של תמיסת טרומבין ו triturate 5 פעמים כדי לערבב היטב. אין לדחוף את הפיפטה מעבר לתחנה הראשונה ולהסיר את הקצה לאחר הטריטורציה כדי למנוע יצירת בועות. בשלב זה, ועד שהסריג יהיה מוכן להרמה מלוח היציקה (שלב 3.3.10), כל תזוזה של הסריג עלולה לפגוע בחיבור ארוך הטווח של הרקמה לעמודים. החזיקו את הסריג ואת צלחת היציקה בו זמנית באמצעות אצבע מצביעה ואגודל של יד אחת כדי למנוע כל תזוזה של הסריג. חזור על הפעולה עם קצה P200 טרי לכל רקמה עד שכל הרקמות יצוקות. ערבבו את תרחיף התאים בצינור חרוטי של 15 מ”ל לפני יציקת כל רקמה כאשר התאים מתיישבים במהירות. מעבירים בזהירות את ערכת הזרעים לאינקובטור, ומקפידים לא להזיז את הסריג. תזוזה של הסריג לאחר הזריעה עלולה לגרום לירידה בהצלחה בהעברת רקמות אל מחוץ לבארות היציקה. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 80 דקות, ללא קשר לסוג התא. זה יתחיל פילמור של הידרוג’ל ולאפשר חלבונים להתחבר לפוסטים. בינתיים, להכין צלחת 24 באר טרי עם 2 מ”ל / באר של מדיום EMT עבור רקמות הלב. ניתן להוסיף מעכב ROCK 10 mM למדיום החובש במידת הצורך. לדגור על הצלחת ב 37 ° C כדי לחמם את המדיום. הכן 2 מ”ל / באר של מדיום גידול המכיל 5 גרם / ליטר חומצה aminocaproic (0.2 מ”מ סטרילי מסונן) עבור רקמות שריר השלד הראשוני או 2 גרם / L ACA עבור EMT נגזר iPSC. לדגור על הצלחת ב 37 ° C כדי לחמם את המדיום. לאחר הדגירה, להוסיף בעדינות 1 מ”ל של מדיום EMT לקצה בארות הליהוק לדגור עוד 10 דקות ב 37 ° C, ללא קשר לסוג התא. פעולה זו תעקור את ההידרוג’ל משולי יציקת היציקה היטב ותאפשר העברה קלה של הרקמה. לאחר 10 דקות, הרימו בזהירות את הסריג והעבירו את הרקמות מצלחת היציקה לצלחת מוכנה בת 24 בארות עם מדיום (איור 1C). להחזיר את הצלחות עם רקמות לאינקובטור תרבית התא ב 37 °C (77 °F). אחזקהלאחר 24 שעות, להעביר את רקמות הגבס צלחת 24 באר טרי עם 2 מ”ל / באר של מדיה EMT (ללא מעכב ROCK אם זה נכלל) לדגור ב 37 ° C. עבור תאי שריר השלד, העבר את מדיום הגידול למדיום ההתמיינות כדי לקדם איחוי מיובלסט. העבר את רקמות הלב לבארות טריות עם 2 מ”ל / באר של מדיום EMT כל 2-3 ימים. מעבירים את רקמות שרירי השלד לבארות טריות עם מדיום התמיינות של 2 מ”ל/באר המכיל 5 גרם/ליטר חומצה אמינוקפרואית (0.2 מ”מ סטרילית מסוננת) כל 2-3 ימים. יש להשתמש ב-ACA של 2 גרם/ליטר עבור רקמות שמקורן ב-iPSC. כדי לסייע בשינויים בינוניים, העבירו את הסריג לצלחת טרייה בת 24 בארות במקום להחליף את המדיום באותה צלחת כדי למנוע פגיעה ברקמות התלת-ממדיות. הכינו צלחת שנייה של 24 בארות עם מדיום החובש והעבירו את הרקמות למדיום הטרי. שמור את הצלחת עם המדיום הישן לצד התרבות הפעילה לשימוש לשינוי המדיום הבא. העבירו את הסריג הלוך ושוב בין שני הלוחות לאורך תקופת התרבות. לחלופין, השתמשו בצלחת טרייה לכל שינוי בינוני. מדוד את התכווצות החובשים באמצעות מעקב אופטי אחר סטייה לאחר (איור 1D) או חומרת חישה מגנטית13,14. רקמות הלב מתחילות לפעום באופן ספונטני לאחר 3-4 ימים בתרבית. רקמות שרירי השלד בדרך כלל מתכווצות עם גירוי שדה חשמלי לאחר 7 ימים בתרבית.
Representative Results
תאים נוצקו לתוך רקמות שריר מהונדסות בלוח המתכלה בעל 2 העמודים (איור 1). חובשים מוצלחים ייראו אחידים, והמטריצה תחולק באופן שווה בין העמדות (איור 2A). המטריצה צריכה גם לעטוף את שני העמודים, ולייצר נקודות עיגון שוות ערך לרקמה. כשלים בליהוק הם נדירים בשיטה זו והם בדרך כלל ברורים עם בדיקה חזותית. ייצור לא מוצלח של EMT יכול לנוע בין כשלים קטסטרופליים, כמו ניתוק רקמות מהעמודים (איור 2B) לפגמים מבניים עדינים יותר, כמו בועות אוויר וחיבור רופף לעמודים (איור 2C,D). רקמות עם פגמים קלים עדיין עשויות להיות בנות קיימא, אך יש לבחון את הנתונים מרקמות אלה בקפידה כדי להבטיח שניתן להשוות אותם לחובשים ללא פשרות. לדוגמה, בועות אוויר בתוך EMT עשויות להיסחט החוצה כאשר הרקמה נדחסת עם הזמן, מה שהופך מבנה פונקציונלי מלא ללא ליקויים התכווצות. רקמות אלה חייבות להיות מוערכות על בסיס כל מקרה לגופו, עם זאת, כמו המיקום של בועות האוויר עשוי להשפיע על התאוששות תפקודית. בועות אוויר הנוצרות בעמדות, למשל, עלולות להשפיע על חיבור רקמות, מה שעלול לעכב היצמדות ארוכת טווח לעמוד. רקמות מתחילות להידחס בתוך 24 השעות הראשונות כאשר תאים מעצבים מחדש את המטריצה בתוך ההידרוג’ל (איור 3). קומפקציה היא תהליך הדרגתי ובדרך כלל נמשכת על פני 2-4 השבועות הראשונים של התרבות. באופן כללי, דחיסת רקמות עקבית בין שכפולים טכניים וביולוגיים (איור 4). זה נורמלי עבור קווי תאים מסוימים לדחוס את המטריצה יותר מאחרים כמו רקמות להבשיל עם הזמן. אחוז התאים המיוגניים בתוך מבנה משפיע על קצב ומידת דחיסת החובשים. התכולה המיוגנית הכוללת של קווי תאי שריר הלב והשלד צריכה להיות מעל 80% כדי למזער את השונות בין רקמות מהונדסות. זה חשוב במיוחד כאשר משווים כוחות כיווץ וקינטיקה על פני קווי תאים. בימים הראשונים לאחר הליהוק, קרדיומיוציטים מתחילים לפעום באופן ספונטני בתרבית, לכופף בקצב את העמוד הגמיש עם כל כיווץ שריר. מבני שרירי השלד מתכווצים בתגובה לגירוי חשמלי ביום השביעי לאחר תחילת ההתמיינות. גירוי שדה הוחל על רקמות שרירי השלד באמצעות ממריץ חיצוני המחובר למכסה אלקטרודה מותאם אישית של 24 בארות. המכסה, המיוצר עם זוג אלקטרודות פחמן לכל באר, יושב על גבי צלחת 24 בארות של רקמות, ובו זמנית מגרה כל חובש לגרום להתכווצויות שרירים. הרקמות עברו קצב באמצעות גירוי של 10 וולט למשך 10 מילישניות פעימות ב-1 הרץ במהלך מדידות פונקציונליות. רקמות התכווצות מצביעות על מיובלסטים של השלד שהתמזגו, ויוצרים צינורות מיו שלמים עם סרקומרים פונקציונליים ומכונות התכווצות. כתם של חובשי שלד חיובי לשרשרת כבדה של מיוזין (MyHC) ודיסטרופין ממוקם בקרום המיו-צינור וחושף צורת טבעת קלאסית בניתוח אימונוהיסטוכימי בחתך רוחב (איור 5). ברגע שהחובשים מתפקדים, ניתן למדוד את ההתכווצות מדי יום במכשיר החישה המגנטי, כוח המעקב והקינטיקה ככל שהמבנים מתפתחים ומבשילים עם הזמן. גם רקמות שרירי הלב וגם שרירי השלד נשארות מכווצות במשך שבועות עד חודשים בתרבית תלת-ממדית (איור 6), וניתן להשתמש בהן למגוון רחב של מחקרי התכווצות. ניתן להשתמש בגישת הזיהוי המגנטי כדי למדוד בו-זמנית השפעות אקוטיות וכרוניות של חומרים קרדיוטוקסיים מבניים, כמו דוקסורוביצין (איור 7) ו-BMS-986094 (איור 8), כמו גם תרופות אחרות שמשפיעות על התכווצות שרירים. ניתן להשתמש גם בשיטות מעקב אופטיות של זיהוי התכווצות, אך יש לנקוט בזהירות כאשר לומדים השפעות סמים חריפות מכיוון שיש לבצע מדידות ברצף. תוחלת החיים הארוכה יותר של חובשי לב ושלד בתרבית תלת-ממדית מאפשרת מחקרים תרופתיים ארוכי טווח ברקמות אלה. זה מאפשר למשתמשים לחקור את ההשפעות של מינון חוזר, כמו גם חשיפה מתמשכת לטווח ארוך לתרכובות שעשויות להראות השפעות קרדיוטוקסיות לאורך זמן, כפי שקורה עם דוקסורוביצין. דוקסורוביצין (Dox) היא תרופה כימותרפית נגד סרטן17. כמות התרופה הניתנת לחולים משתנה, בהתאם לסוג הסרטן, גיל המטופל, גובה ומשקל המטופל, כמו גם גורמים אחרים. מסיבה זו, חשוב לבדוק את ההשפעה של dox על פני מגוון רחב של ריכוזים ולוחות זמנים למשלוח. כאן, חובשי לב טופלו במשך 27 ימים עם שלושה ריכוזים נפרדים (0.1 מיקרומטר, 1 מיקרומטר ו-10 מיקרומטר) של דוקס (איור 7). הקבוצות רובדו עוד יותר על ידי טיפול בחובשים בכל ריכוז עם טיפול בבולוס או מתן רציף עם שינוי בינוני כל 72 שעות. וולס שקיבל טיפולי בולוס בדוקס נחשף לתרופה בשלוש נקודות זמן נפרדות, מה שאיפשר התאוששות בין המינון. שני המינונים הגבוהים ביותר של בולוס וחשיפה מתמשכת הראו הפסקה מיידית וממושכת של ייצור כוח התכווצות לאורך כל המחקר. לריכוזים האמצעיים והנמוכים ביותר היו השפעות משתנות על הרקמות, בהתאם לשיטת הממשל. בריכוז הנמוך ביותר של התרופה, קבוצת הבולוס לא הראתה הבדל מקבוצת הביקורת. עם זאת, כוח ההתכווצות פחת לאחר שבועיים של חשיפה מתמשכת. לריכוז הבינוני של התרופה הייתה השפעה מעניינת. בעוד מינון מתמשך הפחית את הכוח במהלך היומיים הראשונים של הטיפול ונמשך לאורך כל הניסוי, קבוצת הבולוס הראתה התאוששות של כוח התכווצות בחזרה לרמות הבקרה כאשר התרופה נשטפה לאחר 3 ימים. עם זאת, הבולוס השני של התרופה גרם להפסקה מלאה של הכוח, ואחריו ללא התאוששות (איור 7), מה שמצביע על כך שלמינון חוזר ונשנה בריכוז זה עשויה להיות השפעה קרדיוטוקסית בחולים שטופלו בתרופה זו. ההיקף הרחב של מחקר זה, הן בזמן והן בתנאי ניסוי, מדגיש את התועלת של רקמות מהונדסות-תלת-ממד בסינון רעילות, מכיוון שהן נשארות מתכווצות ומגיבות לחשיפה כימית לאורך תקופות זמן ממושכות, מה שמאפשר מחקרי תרופות ארוכי טווח בתוך קבוצה אחת של רקמות שריר. זה מאפשר לא רק לזהות תרכובות שעשויות להיות השפעה cardiotoxic עם חשיפה כרונית, אלא גם זיהוי תזמון cardiotoxic פוטנציאלי של הממשל. בדיקת רעילות חוץ גופית ברקמות שריר אנושיות מהונדסות, היא אחת הדרכים לסייע בשמירה על בטיחות המטופלים האנושיים בניסויים קליניים. BMS-986094 הוא מעכב נוקלאוטיד פולימראז (NS5B) המשמש לטיפול בהפטיטיס C. התרופה הייתה בשלב II של הפיתוח הקליני כאשר בריסטול-מאיירס סקוויב הפסיקה את הפיתוח עקב מספר מקרים של אי ספיקת לב בלתי צפויה בחולים18,19. כאן, BMS-986094 יושם על חובשי לב כדי לבדוק אם רקמות שריר מהונדסות-תלת-ממד יפתחו תגובה קרדיוטוקסית לתרופה (איור 8). שלושה ריכוזים שונים של התרופה יושמו, ורקמות נוטרו במשך 13 ימים. כוח ההתכווצות ירד עם הוספת התרופה באופן תלוי מינון (איור 8A). תדירות העוויתות הושפעה גם היא באופן משמעותי כאשר קצב הפעימות הואט ובסופו של דבר נעצר כצפוי עם המשך החשיפה לתרכובת קרדיוטוקסית (p < 0.05, איור 8B). תוצאות אלה מדגימות כיצד ניתן להשתמש ברקמות שריר אנושיות מהונדסות-תלת-ממד כדי להקל על הבאת תרופות חדשות לשוק ולסמן תרכובות שבסופו של דבר נכשלות עקב רעילות לב. יתר על כן, טכנולוגיה זו עשויה להציל חיים על ידי חשיפת תרופות מסוכנות לפני שהן מוכנסות לחולים בניסויים קליניים. היכולת למדוד את ההשפעה של תרופות אקוטיות וכרוניות על רקמת התכווצות אנושית היא צעד ראשון חיוני בעת חקירת טיפולים לבטיחות ויעילות. חשוב לדעת, עם זאת, כי ריכוז התרופות המיושמות רלוונטי פיזיולוגית ומתאים לבדיקות חוץ גופיות. רקמות שרירי השלד שימשו כדי לקבוע ערך IC50 עבור 2,3-Butanedione monoxime (BDM) בעקומת מנה-תגובה מלאה. תרופה זו היא מעכב ATPase מאופיין היטב של שריר השלד myosin-II20. BDM מעכב התכווצויות שרירים על ידי מניעת היווצרות מיוזין חוצה גשרים עם חוט האקטין בסרקומרים21. התוצאות המוצגות כאן חושפות ירידה תלוית מינון בכוח האבסולוטי כאשר התרופה מיושמת והתאוששות מלאה של כוח התכווצות כאשר התרופה נשטפת החוצה, מה שמצביע על כך שההשפעה החולפת מונעת התכווצויות שרירים ולא רק הורגת תאים בתוך הרקמה (איור 9A). יתר על כן, עקומת מנה-תגובה מלאה נמדדה בשבעת הריכוזים שנבדקו, וקבעה IC50 של 3.2 מילימטר במיקרו-רקמות האנושיות האלה (איור 9B). איור 1: יציקת EMT בלוח 24 בארות מתכלה של מנטריי . (A) תאים מיוגניים ותאי סטרומה גודלו בתרבית על משטחים דו-ממדיים לפני יציקת הרקמות. (B) תאים מורמים ממשטחים דו-ממדיים ומעורבבים יחד עם חלבוני מטריצה חוץ-תאיים ליצירת הידרוג’לים בבארות יציקת הלוחות הבודדות המוצגות בכניסה. (C) צלחת 24 בארות המכילה רקמות מהונדסות. (D) רקמות מייצגות המראות שריר מהונדס רפוי ומכווץ, תוך השוואת תזוזה של העמוד המגנטי (פסים ירוקים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: יציקת EMT מוצלחת ולא מוצלחת . (A) רקמת שריר מהונדסת אידיאלית 24 שעות לאחר היציקה דחוסה באופן אחיד סביב העמודים עם הרכב תאים / מטריצה הומוגני בכל הרקמה. (B) EMT כושל המראה ניתוק של ההידרוג’ל מהעמדה הגמישה. (C) EMT המכיל בועות אוויר בכל הרקמה. (D) תצהיר רקמות לא שווה סביב שני הפוסטים. הרקמה מעוגנת באופן רופף לעמוד הגמיש בצד אחד. פסי קנה המידה הם 1 מ”מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: דחיסה ברקמת שריר מהונדסת לאורך זמן. (A) מבנה EMT מוצג יום אחד לאחר היציקה. רקמות מועברות למדיום התמיינות, החל מהיום 0 של איחוי תאים ודחיסת הידרוג’ל. (ב-ה) אותו EMT ביום 7 עד יום 21 מראה אורך כולל מעט קצר יותר בין שתי ההודעות לאורך זמן ורוחב קטן יותר כאשר נמדד דרך החלק האמצעי של החובש. פסי קנה המידה הם 1 מ”מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: קוטר החובשים לאורך זמן. ארבעה לוחות של רקמות היו במעקב במשך 21 ימים, השוואת קוטר EMT לאורך דחיסה. כל רקמה נמדדה דרך חתך האמצע מדי שבוע באמצעות מיקרוסקופ אופטי. נקודות זמן מציגות גודל EMT עקבי בין הלוחות. דחיסה מקסימלית מושגת ביום ה -21 כאשר שיפוץ המטריצה מתייצב. הטבלה מציגה את סטיית התקן (% מסך הכל) של הדחיסה בתוך כל צלחת רקמות ואת הסטייה הממוצעת עבור כל הלוחות. פסים צבעוניים הם לוחות בודדים. קווי שגיאה הם SD של EMT בתוך לוחות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 5: אימונוהיסטוכימיה של רקמות שרירי השלד המהונדסות. החובשים תוקנו ביום 10 לתרבית והוטמעו בפרפין. חתכים דקים (7 מיקרומטר) הוכתמו בנוגדנים נגד מיוזין, שרשרת כבדה ודיסטרופין לפני ההדמיה. ירוק = MyHC, אדום = דיסטרופין, כחול = DAPI. הגדלה אובייקטיבית היא פי 40; סרגל קנה המידה הוא 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 6: כוח התכווצות ברקמות שריר מהונדסות לאורך זמן. (A) כוח עווית אבסולוטי ממוצע שנמדד מחובשי לב מהיום השביעי עד היום ה-63 בתרבית; n = 3 לכל קבוצה. (B) כוח עווית אבסולוטי ממוצע בחובשי שלד שמקורו בקו תאים ראשוני ביום 7 עד יום 53 בתרבית; n = 3. קווי שגיאה הם SD עבור שני הגרפים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 7: טיפול דוקסורוביצין אקוטי וכרוני ברקמת השריר המהונדס. שלושה ריכוזי מינון נפרדים של דוקס, 0.1 מיקרומטר, 1 מיקרומטר ו-10 מיקרומטר, ניתנו בבולוס או שניתנו ברציפות לרקמות שריר מהונדסות במשך 27 ימים. מנות בולוס של התרופה נוספו בשינויי מדיה בימים 0, 12 ו -24, שצוינו על ידי החיצים הירוקים על ציר X. התרופה נוספה לתקשורת בכל שינוי מדיה למינון רציף, שצוין על ידי החיצים השחורים והירוקים על ציר ה-X. אחוז השינוי בכוח מערכי הבסיס (טרום טיפול תרופתי) הוא על ציר Y, והזמן בימי הטיפול הוא על ציר X. כתום בהיר = שליטה רציפה DMSO, כתום כהה = בקרת בולוס DMSO, ירוק בהיר = 0.1 מיקרומטר דוקס רציף, ירוק כהה = 0.1 מיקרומטר דוקס בולוס, כחול בהיר = 1 מיקרומטר דוקס רציף, כחול כהה = 1 מיקרומטר דוקס בולוס, צהוב בהיר = 10 מיקרומטר דוקס רציף, צהוב כהה = 10 מיקרומטר דוקס בולוס. קווי שגיאה הם SD; n = 3 לכל תנאי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 8: טיפול כרוני עם BMS-986094 ברקמת שריר מהונדס. החובשים טופלו ב- 0.4 מיקרומטר (ירוק), 2 מיקרומטר (כחול כהה) ו- 10 מיקרומטר (כחול בהיר) BMS-986094 במשך 13 ימים. (A) כוח העווית המתכווץ (ציר Y) יורד בכל ריכוזי התרופות ביומיים הראשונים, בעוד שרקמות הבקרה ב-DMSO ממשיכות להתחזק עם הזמן (ציר X). (B) קצב פעימות הלב, או תדירות העוויתות, נפסק באופן תלוי מינון במקביל להפסקת כוח ההתכווצות המוצג בגרף A. רקמות הבקרה ב-DMSO (אפור) שומרות על קצב פעימות קבוע לאורך כל הניסוי. קווי שגיאה הם SD; n = 3 לכל תנאי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 9: תגובת מינון ל-BDM ברקמות שרירי שלד מהונדסות. (A) כוח העוויתות המוחלט יורד באופן תלוי מינון כאשר חובשים ראשוניים שמקורם בתאים נחשפים ל-2,3-בוטנדיון מונוקסיום (BDM) ביום ה-16 בתרבית תלת-ממדית. כוח עווית מוחלט חוזר לערכים בסיסיים קרובים כאשר התרופה נשטפת. (B) כוח עווית מוחלט המנורמל לערכי הבסיס יורד באופן תלוי מינון כאשר הוא נחשף ל-BDM ומניב עקומת מנה-תגובה מלאה וערך IC50; n = 4 למנה. קווי שגיאה הם SD. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
מחקר זה מתאר שיטות ליצירת רקמות שרירי לב ושלד מהונדסים בתלת ממד בתוך ערכת יציקה מתכלה של 24 בארות. על ידי ביצוע שיטות אלה, ניתן להשיג באופן עקבי מערך שלם של 24 רקמות ללא כשלים יציקה עבור בדיקות סמים לאחר מכן. שיקולים קריטיים להשגת תוצאה כזו הם הבטחת ביצוע כל השלבים על קרח למניעת פילמור מוקדם של ההידרוג’לים, הסרת מגיב דיסוציאציה של התא לפני יציקת רקמות, ערבוב יסודי של התא ותרחיף הידרוג’ל לכל רקמה, החלפת קצות פיפטה בין רקמות, ושימוש ב- FBS מומת חום (אם נעשה בו שימוש בכלל). כמו כן, חשוב לוודא כי הסריג הפוסט אינו זז ברגע שהיציקה מתחילה ומועברת בעדינות לאחר היווצרות הידרוג’לים.
שינויים עיקריים כוללים שימוש בסוגי תאים שונים להשגת EMT לב לעומת שלד וסימום של הידרוג’לים עם ריכוזים משתנים של חלבוני קרום מרתף כדי לקדם את הבשלת התאים ויציבות הרקמות. ההשפעות המועילות של סימום כזה חייבות להיבדק בכל מקרה לגופו, אך הוכח כמשפר את התוצאות התפקודיות ואת תוחלת החיים של רקמות בנסיבות מסוימות14,16,22. ראוי גם לציין כי צפיפויות התאים המפורטות הן מדריך וייתכן שיהיה צורך למטב אותן עבור קווי תאים שונים. הרכבי הידרוג’ל חלופיים יכולים להיחשב גם כאמצעי לשינוי המאפיינים המבניים והפונקציונליים של החובשים שהושגו23,24,25. מיקרו-סביבת השרירים הטבעית מכילה גם סוגי תאים תומכים לקידום וסקולריזציה, עצבוב ושקיעת מטריצה לתמיכה במיוציטים בצורה ובתפקוד26,27. בעוד המערכת המתוארת כאן משלבת כיום פיברובלסטים ברקמות לב תלת-ממדיות, סוגי תאים נוספים עשויים ליצור מודל פיזיולוגי רלוונטי יותר לחקר הבטיחות והיעילות של תרכובות טיפוליות במבחנה. בעבר, מגוון סוגי תאים תומכים שולבו בהצלחה ברקמות מהונדסות-תלת-ממד והציגו תבנית מרגשת למחקר עתידי באמצעות פלטפורמת ההתכווצות של החישה המגנטית28,29,30.
פתרון בעיות עבור פרוטוקול זה מתמקד בהיווצרות רקמות לא אמינות או לא עקביות במהלך תהליך הליהוק. יש להקפיד להימנע מהיווצרות בועות בהידרוג’לים בזמן יציקתם ועדיין להקל על פיזור אחיד של התאים במהלך הערבוב. ניסויי אופטימיזציה יידרשו ככל הנראה עבור כל סוג תא חדש כדי לזהות צפיפויות תאים אידיאליות, יחסי תאים והרכב מטריצה.
מגבלה עיקרית עבור טכניקה זו היא מספר משמעותי של תאים הדרושים כדי להקים צלחת מלאה של 24 EMTs. עבור הנתונים המוצגים כאן, 15 מיליון cardiomyocytes ו 18 מיליון myoblasts השלד שימשו לכל צלחת. ייתכן שלחוקרים מסוימים לא תהיה גישה למאגרים כה גדולים של חומר תאי, מה שעלול לעכב את יכולתם להשתמש בפלטפורמה זו במלואה. אם למשתמשי הקצה אין גישה לחומרת חישה מגנטית, יש לבצע מדידות של סטיות לאחר מכן באופן אופטי, מה שמפחית משמעותית את התפוקה ומונע רישום בו זמנית של התכווצויות שרירים על פני בארות מרובות. עם זאת, חומרת Mantarray מתגברת על מגבלות אלה ומציעה את המערכת המסחרית הראשונה המסוגלת לניתוח רציף ולא פולשני של התכווצות EMT בו זמנית על פני מבנים מרובים.
חישה מגנטית על פני 24 בארות מאפשרת מחקרי אורך של התפתחות תפקודית EMT בזמן אמת ומאפשרת מדידה מדויקת של תגובות אקוטיות למניפולציה כימית, סביבתית או גנטית. בעוד שלחישה מגנטית יש מספר יתרונות כגון מדידה סימולטנית על פני רקמות מרובות, ואינה דורשת ניתוח נתונים מסובך, שיטות זיהוי אופטיות מאפשרות מדידה בו זמנית של מדדים פיזיולוגיים כגון שטף סידן או מיפוי מתח. עם זאת, מערכי נתונים כמו אלה המתוארים בסעיף התוצאות מדגימים את רוחב היישומים שיש לטכנולוגיה זו בתחום פיתוח התרופות. בהתחשב בכך שבדיקות מעטות בשוק מציעות את האמצעים לבצע הערכה ישירה של תפוקת התכווצות בשרירים מהונדסים, שיטות אלה טומנות בחובן פוטנציאל לחולל מהפכה בצנרת הפיתוח הפרה-קליני.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה חלקית על ידי מימון ממנהל המזון והתרופות האמריקאי (U01 FD006676-01 שהוענק למכון למדעי הבריאות והסביבה) ועל ידי מימון מהמכונים הלאומיים לבריאות (HL151094 לד”ר גייס). אנו מודים לד”ר אלק ס. ט. סמית על עזרתו בהכנת כתב יד זה.
Materials
| 100 µm cell strainer | CELLTREAT | 229485 | |
| 100 mm cell culture dish | ThermoFisher | 150466 | |
| 50 mL Steriflip filter | MilliporeSigma | SCGP00525 | |
| 500 mL filter flask | MilliporeSigma | S2GVU05RE | |
| 6-aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| Cardiosight Maintenance Medium | NEXEL | CM-002A | |
| Cardiosight Plating Medium | NEXEL | CM-020A | |
| C-Pace EM stimulator | IonOptix | EM | |
| Curi Bio Muscle Differentiation Media Kit | Primary – DIFF | ||
| Curi Bio Muscle Maintenance Media Kit | Curi Bio | Primary – MAINT | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Gibco | 10566-016 | |
| Dnase | Sigma | 11284932001 | |
| DPBS | Gibco | 14190-250 | |
| Dystrophin antibody | Abcam | ab154168 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | 10082147 | Must be heat-inactivated |
| Fibrinogen (Bovine) | Sigma | E8630 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
| Ham's F10 | Gibco | 11550043 | |
| Hemacytometer | Sigma | Z359629 | |
| HS-27A Fibroblasts | ATCC | CRL-2496 | |
| Human Skeletal Muscle Myoblasts | Lonza | CC-2580 | |
| Luer Lock 0.2 µm syringe filter | Corning | 431219 | |
| Luer Lock 10 mL syringe | BH Supplies | BH10LL | |
| Mantarray Instrument | Curi Bio | MANTA-24-B1 | System |
| Mantarray Plate Kits | Curi Bio | MA-24-SKM-5 | Pack of 5 kits |
| Mantarray stimulation lid | Curi Bio | EM | |
| Matrigel (ECM) | Corning | 356231 | |
| Nexel Cardiosight-S, Cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
| Optical Microscope | Nikon Ti2E | MEA54000 | |
| Pan Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF-20 | |
| Poly(ethyleneimine) | Sigma | P3143 | |
| ROCK inhibitor | StemCell Technologies | Y-27632 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| Skeletal Muscle Growth Medium (SkGM-2) | Lonza | CC-3245 | |
| Standard 24-well plates | Greiner | M8812 | Other manufacturer's plates will not fit |
| Standard 6-well plates | ThermoFisher | 140675 | |
| Stromal medium (DMEM + 20% FBS) | |||
| T175 Filter Flask | ThermoFisher | 159910 | |
| T225 Filter Flask | ThermoFisher | 159934 | |
| Thrombin | Sigma | T4648 | |
| Trypan Blue solution, 0.4% | ThermoFisher | 15250061 | |
| TrypLE Select Enzyme (10x) | Thermo Scientific | A1217702 | |
| TrypLE Select Enzyme (1x) | Thermo Scientific | 12563011 |
References
- Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening. Stem Cell Research & Therapy. 4, 150 (2013).
- Mudera, V., Smith, A. S. T., Brady, M. A., Lewis, M. P. The effect of cell density on the maturation and contractile ability of muscle derived cells in a 3D tissue-engineered skeletal muscle model and determination of the cellular and mechanical stimuli required for the synthesis of a postural phenotype. Journal of Cellular Physiology. 225 (3), 646-653 (2010).
- Vandenburgh, H., et al. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Human Gene Therapy. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).
- Fleming, J. W., et al. Bioengineered human skeletal muscle capable of functional regeneration. BMC Biology. 18 (1), 145 (2020).
- Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 4, 04885 (2015).
- Urciuolo, A., et al. Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale. PLOS One. 15 (5), 0232081 (2020).
- Afshar, M. E., et al. A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength. Scientific Reports. 10, 6918 (2020).
- Sakar, M. S., et al. Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators. Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).
- Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
- Khodabukus, A., Baar, K. Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (5), 349-357 (2011).
- Vandenburgh, H., et al. Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle & Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
- Bielawski, K. S., Leonard, A., Bhandari, S., Murry, C. E., Sniadecki, N. J. Real-time force and frequency analysis of engineered human heart tissue derived from induced pluripotent stem cells using magnetic sensing. Tissue Enineering Part C Methods. 22 (10), 932-940 (2016).
- Smith, A. S. T., et al. High-throughput, real-time monitoring of engineered skeletal muscle function using magnetic sensing. bioRxiv. , 492879 (2022).
- Scheraga, H. A. The thrombin-fibrinogen interaction. Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).
- Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle. Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).
- Carvalho, C., et al. Doxorubicin: the good, the bad and the ugly effect. Current Medicinal Chemistry. 16 (25), 3267-3285 (2009).
- Ahmad, T., et al. Cardiac dysfunction associated with a nucleotide polymerase inhibitor for treatment of hepatitis C. Hepatology. 62 (2), 409-416 (2015).
- Gill, M., et al. From the cover: Investigative nonclinical cardiovascular safety and toxicology studies with BMS-986094, an NS5b RNA-dependent RNA polymerase inhibitor. Toxicological Sciences. 155 (2), 348-362 (2017).
- Ostap, E. M. 2,3-Butanedione monoxime (BDM) as a myosin inhibitor. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 23 (4), 305-308 (2002).
- Fryer, M. W., Gage, P. W., Neering, I. R., Dulhunty, A. F., Lamb, G. D. Paralysis of skeletal muscle by butanedione monoxime, a chemical phosphatase. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 411 (1), 76-79 (1988).
- Fleming, J. W., et al. Functional regeneration of tissue engineered skeletal muscle in vitro is dependent on the inclusion of basement membrane proteins. Cytoskeleton. 76 (6), 371-382 (2019).
- Capel, A. J., et al. Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).
- Tsui, J. H., et al. Tunable electroconductive decellularized extracellular matrix hydrogels for engineering human cardiac microphysiological systems. Biomaterials. 272, 120764 (2021).
- Tsui, J. H., et al. Conductive silk-polypyrrole composite scaffolds with bioinspired nanotopographic cues for cardiac tissue engineering. Journal of Materials Chemistry B. 6 (44), 7185-7196 (2018).
- Gabella, G. Muscle cells, nerves, fibroblasts and vessels in the detrusor of the rat urinary bladder. Journal of Smooth Muscle Research. 55, 34-67 (2019).
- Christov, C., et al. Muscle satellite cells and endothelial cells: close neighbors and privileged partners. Molecular Biology of the Cell. 18 (4), 1397-1409 (2007).
- Bersini, S., et al. Engineering an environment for the study of fibrosis: A 3D human muscle model with endothelium specificity and endomysium. Cell Reports. 25 (13), 3858-3868 (2018).
- Gilbert-Honick, J., et al. Engineering functional and histological regeneration of vascularized skeletal muscle. Biomaterials. 164, 70-79 (2018).
- Maffioletti, S. M., et al. Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering. Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).
Cite This Article
Berry, B. J., Luttrell, S. M., Moerk, C. T., Macadangdang, J., Perez, J., Gray, K., Ghazizadeh, H., Kharoufeh, S., Nelsen, B., Geisse, N. A. Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues. J. Vis. Exp. (194), e64399, doi:10.3791/64399 (2023).