עיבוד תמונה אוטומטי לקביעת מבנה גודל הקהילה של מקרו-חסרי חוליות בנהרות
Summary
המאמר מבוסס על יצירת פרוטוקול מותאם לסריקה, זיהוי, מיון וזיהוי אובייקטים דיגיטליים המתאימים למקרו-חסרי חוליות של נהרות בנטיים באמצעות הליך הדמיה חצי אוטומטי. הליך זה מאפשר רכישה של התפלגויות הגודל האינדיבידואליות ומדדי הגודל של קהילת מקרו-חסרי חוליות תוך כשעה.
Abstract
גודל הגוף הוא תכונה פונקציונלית חשובה שיכולה לשמש כביו-אינדיקטור להערכת ההשפעות של הפרעות בקהילות טבעיות. מבנה גודל הקהילה מגיב לשיפועים ביוטיים וא-ביוטיים, כולל הפרעות אנתרופוגניות בין טקסונים ומערכות אקולוגיות. עם זאת, המדידה הידנית של אורגניזמים בעלי גוף קטן כגון מקרו-חסרי חוליות בנטיים (למשל, >500 מיקרומטר עד כמה סנטימטרים אורך) גוזלת זמן רב. כדי לזרז את ההערכה של מבנה גודל הקהילה, כאן, פיתחנו פרוטוקול למדידה אוטומטית למחצה של גודל הגוף האינדיבידואלי של מקרו-חסרי חוליות בנהרות שהשתמרו, שהם אחד הביו-אינדיקטורים הנפוצים ביותר להערכת המצב האקולוגי של מערכות אקולוגיות של מים מתוקים. פרוטוקול זה מותאם ממתודולוגיה קיימת שפותחה לסריקת מזוזואופלנקטון ימי באמצעות מערכת סריקה המיועדת לדגימות מים. הפרוטוקול מורכב משלושה שלבים עיקריים: (1) סריקת תת-דגימות (שברים בגודל דגימה עדין וגס) של מקרו-חוליות בנהר ועיבוד התמונות הדיגיטליות כדי להתאים אישית כל אובייקט שזוהה בכל תמונה; (2) יצירה, הערכה ואימות של מערך למידה באמצעות בינה מלאכותית כדי להפריד באופן אוטומטי למחצה את התמונות הבודדות של מקרו-חוליות מדטריטוס וממצאים בדגימות הסרוקות; ו-(3) תיאור מבנה הגודל של קהילות המקרו-חסרי חוליות. בנוסף לפרוטוקול, עבודה זו כוללת את תוצאות הכיול ומפרטת מספר אתגרים והמלצות להתאמת ההליך לדגימות מקרו-חסרי חוליות ולשקול שיפורים נוספים. בסך הכל, התוצאות תומכות בשימוש במערכת הסריקה המוצגת למדידת גודל הגוף האוטומטית של מקרו-חסרי חוליות בנהרות ומציעות כי תיאור ספקטרום הגודל שלהם הוא כלי רב ערך להערכה ביולוגית מהירה של מערכות אקולוגיות של מים מתוקים.
Introduction
מקרו-חסרי חוליות בנטיים נמצאים בשימוש נרחב כביו-אינדיקטורים כדי לקבוע את המצב האקולוגי של גופי מים1. רוב המדדים לתיאור קהילות מקרו-חסרי חוליות מתמקדים במדדים טקסונומיים. עם זאת, כלי הערכה ביולוגית חדשים המשלבים את גודל הגוף מעודדים לספק נקודת מבט חלופית או משלימה לגישות טקסונומיות 2,3.
גודל הגוף נחשב למטא-טראיט הקשור לתכונות חיוניות אחרות כגון חילוף חומרים, גדילה, נשימה ותנועה4. יתר על כן, גודל הגוף יכול לקבוע מיקום טרופי ואינטראקציות5. הקשר בין גודל הגוף האינדיבידואלי לבין הביומסה המנורמלת (או השפע) לפי גודל בקהילה מוגדר כספקטרום הגודל6 ועוקב אחר התבנית הכללית של ירידה ליניארית בביומסה המנורמלת ככל שגודל הפרט גדל בסולם לוגריתמי7. השיפוע של מערכת יחסים ליניארית זו נחקר בהרחבה באופן תיאורטי, ומחקרים אמפיריים על פני מערכות אקולוגיות השתמשו בו כאינדיקטור אקולוגי למבנה גודל הקהילה4. אינדיקטור סינתטי נוסף למבנה גודל הקהילה ששימש בהצלחה במחקרי תפקוד של מגוון ביולוגי-מערכות אקולוגיות הוא מגוון גודל הקהילה, המיוצג כמדד שאנון של מחלקות הגודל של ספקטרום הגודל או האנלוגי שלו, המחושב על סמך התפלגויות הגודל האינדיבידואליות8.
במערכות אקולוגיות של מים מתוקים, מבנה הגודל של קבוצות חיות שונות משמש כאינדיקטור אטקסי להערכת התגובה של קהילות ביוטיות לשיפועים סביבתיים 9,10,11 ולהפרעות אנתרופוגניות 12,13,14,15,16. מקרו-חסרי חוליות אינם יוצאי דופן, ומבנה גודלם מגיב גם לשינויים סביבתיים17,18 ולהפרעות אנתרופוגניות, כגון כרייה 19, שימוש בקרקע 20, או העשרת חנקן (N) וזרחן (P)20,21,22. עם זאת, מדידת מאות אנשים כדי לתאר את מבנה גודל הקהילה היא משימה מייגעת וגוזלת זמן, שלעתים קרובות נמנעת ממנה כמדידה שגרתית במעבדות בשל חוסר זמן. לפיכך, מספר שיטות הדמיה חצי אוטומטיות או אוטומטיות לסיווג ומדידת דגימות פותחו23,24,25,26. עם זאת, רוב השיטות הללו מתמקדות בסיווג טקסונומי יותר מאשר בגודל הפרט של האורגניזמים ואינן מוכנות לשימוש עבור כל מיני מקרו-חסרי חוליות. באקולוגיה של פלנקטון ימי, נעשה שימוש נרחב במערכת ניתוח תמונות סורקת כדי לקבוע את הגודל וההרכב הטקסונומי של קהילות זואופלנקטון 27,28,29,30,31. ניתן למצוא מכשיר זה במספר מכונים ימיים ברחבי העולם, והוא משמש לסריקת דגימות זואופלנקטון שהשתמרו כדי לקבל תמונות דיגיטליות ברזולוציה גבוהה של הדגימה כולה. הפרוטוקול הנוכחי מתאים את השימוש במכשיר זה כדי להעריך את ספקטרום גודל קהילת המקרו-חסרי חוליות בנהרות באופן אוטומטי מהיר מבלי להשקיע ביצירת מכשיר חדש.
הפרוטוקול מורכב מסריקת דגימה ועיבוד התמונה כולה כדי לקבל באופן אוטומטי תמונות בודדות (כלומר, vignettes) של האובייקטים בדגימה. מספר מדדים של צורה, גודל ותכונות ברמת האפור מאפיינים כל אובייקט ומאפשרים סיווג אוטומטי של האובייקטים לקטגוריות, אשר מאומתות לאחר מכן על ידי מומחה. הגודל האינדיבידואלי של כל אורגניזם מחושב באמצעות הביו-נפח האליפסואידי (מ”מ3), הנגזר משטח האורגניזם הנמדד בפיקסלים. זה מאפשר לקבל את ספקטרום הגודל של המדגם בצורה מהירה. למיטב ידיעתנו, מערכת הדמיית סריקה זו שימשה רק לעיבוד דגימות מזוזואופלנקטון, אך המכשיר עשוי לאפשר עבודה עם מקרו-חסרי חוליות בנטיים במים מתוקים.
המטרה הכוללת של מחקר זה היא, אם כן, להציג שיטה להשגת הגודל האינדיבידואלי של מקרו-חסרי חוליות בנהר שהשתמרו על ידי התאמת פרוטוקול קיים ששימש בעבר עם מזוזואופלנקטון ימי 27,32,33. ההליך מורכב משימוש בגישה חצי אוטומטית הפועלת עם מכשיר סריקה לסריקת דגימות מים ושלוש תוכנות פתוחות לעיבוד התמונות הסרוקות. פרוטוקול מותאם לסריקה, זיהוי וזיהוי של מקרו-חסרי חוליות בנהרות שעברו דיגיטציה כדי לרכוש באופן אוטומטי את מבנה גודל הקהילה ומדדי גודל קשורים מוצג כאן. הערכת הנוהל וההנחיות לשיפור היעילות מוצגות גם על סמך 42 תמונות סרוקות של דגימות מקרו-חוליות בנהרות שנאספו משלושה אגנים בחצי האי האיברי הצפון-מזרחי (NE) (Ter, Segre-Ebre ו-Besòs).
הדגימות נאספו בקטעי נהרות בגובה 100 מטרים בעקבות פרוטוקול לדיגום שדה וניתוח מעבדה של מקרו-חולייתנים של נהרות בנטיים בנהרות יבשתיים מממשלת ספרד34. הדגימות נאספו באמצעות סמפלר סורבר (מסגרת: 0.3 מ’ x 0.3 מ’, רשת: 250 מיקרומטר) בעקבות סקר רב-בתי גידול. במעבדה, הדגימות נוקו וסוננו באמצעות רשת של 5 מ”מ ו-500 מיקרומטר כדי לקבל שתי תת-דגימות: תת-דגימה גסה (רשת 5 מ”מ) ותת-דגימה עדינה (רשת של 500 מיקרומטר), שאוחסנו בבקבוקונים נפרדים ונשמרו ב-70% אתנול. הפרדת הדגימה לשני שברים בגודל מאפשרת הערכה טובה יותר של מבנה גודל הקהילה, שכן אורגניזמים גדולים הם נדירים יותר ופחות מהאורגניזמים הקטנים. אחרת, למדגם הסרוק יש ייצוג מוטה של שבר הגודל הגדול.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההתאמה של המתודולוגיה שתוארה על ידי Gorsky et al. 2010 עבור מקרו-חסרי חוליות של נהרות מאפשרת דיוק סיווג גבוה בהערכת מבנה גודל הקהילה במקרו-חסרי חוליות של מים מתוקים. התוצאות מצביעות על כך שהפרוטוקול יכול לקצר את הזמן להערכת מבנה הגודל הבודד במדגם לכשעה. לפיכך, הפרוטוקול המוצע נועד לקדם את השימוש ה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי משרד המדע, החדשנות והאוניברסיטאות הספרדי (מענק מספר RTI2018-095363-B-I00). אנו מודים לחברי CERM-UVic-UCC אליה ברטקסה, אנה קוסטרוסה, לאיה חימנס, מריה איזבל גונזלס, מרתה יוטגלר, פרנצ’סק לאך ונוריה סלארס על עבודתם בדגימת שדה מקרו-חסרי חוליות ומיון מעבדה ולדוד אלבסה על שיתוף הפעולה בסריקת הדגימות. לבסוף אנו מודים לג’וזפ מריה גילי ולמכון Ciències del Mar (ICM-CSIC) על השימוש במתקני המעבדה ובמכשיר הסורק.
Materials
| Beaker | Labbox | Other containers could be used | |
| Dionized water | Icopresa | 8420239600123 | To dilute the ethanol |
| Funnel | Vitlab | 41094 | |
| Glass vials 8 ml | Labbox | SVSN-C10-195 | 1 vial/subsample |
| ImageJ Software | Free access | Version 4.41o/ Image processing software | |
| Large frame | Hydroptic | Provided by ZooScan | 24.5 cm x 15.8 cm |
| Monalcol 96 (Ethanol 96) | Montplet | 1050JE001 | |
| Plankton Identifier Software | Free access | Version 1.2.6/ Automatic identification software | |
| Sieve | Cisa | 26852.2 | Nominal aperture 500µ and nominal aperture 0,5 cm |
| Tweezers | Bondline | B5SA | Stainless, anti-magnetic, anti-acid |
| VueScan 9 x 64 (9.5.09) Software | Hydroptic | Version 9.0.51/ Sacn software | |
| Wooden needle | Any plastic or wood needle can be used | ||
| Zooprocess Software | Free access | Version 7.14/Image processing software | |
| ZooScan | Hydroptic | 54 | Version III/ Scanner |
References
- Birk, S., et al. Three hundred ways to assess Europe’s surface waters: An almost complete overview of biological methods to implement the Water Framework Directive. Ecological Indicators. 18, 31-41 (2012).
- Basset, A., Sangiorgio, F., Pinna, M. Monitoring with benthic macroinvertebrates: advantages and disadvantages of body size descriptors. Aquatic Conservation: Marine and Freshwater Ecosystems. 14, S43-S58 (2004).
- Reyjol, Y., et al. Assessing the ecological status in the context of the European Water Framework Directive: Where do we go now. Science of the Total Environment. 497-498, 332-344 (2014).
- Brown, J. H., Gillooly, J. F., Allen, A. P., Savage, V. M., West, G. B. Toward a metabolic theory of ecology. Ecology. 85 (7), 1771-1789 (2004).
- Woodward, G., et al. Body size in ecological networks. Trends in Ecology & Evolution. 20 (7), 402-409 (2005).
- Sprules, W. G., Barth, L. E. Surfing the biomass size spectrum: Some remarks on history, theory, and application. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (4), 477-495 (2016).
- White, E. P., Ernest, S. K. M., Kerkhoff, A. J., Enquist, B. J. Relationships between body size and abundance in ecology. Trends in Ecology & Evolution. 22 (6), 323-330 (2007).
- Quintana, X. D., et al. A nonparametric method for the measurement of size diversity with emphasis on data standardization. Limnology and Oceanography – Methods. 6 (1), 75-86 (2008).
- Blanchard, J. L., Heneghan, R. F., Everett, J. D., Trebilco, R., Richardson, A. J. From bacteria to whales: Using functional size spectra to model marine ecosystems. Trends in Ecology & Evolution. 32 (3), 174-186 (2017).
- Petchey, O. L., Belgrano, A. Body-size distributions and size-spectra: Universal indicators of ecological status. Biology Letters. 6 (4), 434-437 (2010).
- Emmrich, M., et al. Geographical patterns in the body-size structure of European lake fish assemblages along abiotic and biotic gradients. Journal of Biogeography. 41 (12), 2221-2233 (2014).
- Arranz, I., Brucet, S., Bartrons, M., García-Comas, C., Benejam, L. Fish size spectra are affected by nutrient concentration and relative abundance of non-native species across streams on the NE Iberian Peninsula. Science of the Total Environment. 795, 148792 (2021).
- Vila-Martínez, N., Caiola, N., Ibáñez, C., Benejam, L. l., Brucet, S. Normalized abundance spectra of the fish community reflect hydropeaking on a Mediterranean large river. Ecological Indicators. 97, 280-289 (2019).
- Benejam, L. l., Tobes, I., Brucet, S., Miranda, R. Size spectra and other size-related variables of river fish communities: systematic changes along the altitudinal gradient on pristine Andean streams. Ecological Indicators. 90, 366-378 (2018).
- Sutton, I. A., Jones, N. E. Measures of fish community size structure as indicators for stream monitoring programs. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 77 (5), 824-835 (2019).
- Murry, B. A., Farrell, J. M. Resistance of the size structure of the fish community to ecological perturbations in a large river ecosystem. Freshwater Biology. 59, 155-167 (2014).
- Townsend, C. R., Thompson, R. M., Hildrew, A. G., Raffaelli, D. G., Edmonds-Brown, R. Body size in streams: Macroinvertebrate community size composition along natural and human-induced environmental gradients. In Body Size: The Structure and Function of Aquatic Ecosystems. , (2007).
- Gjoni, V., et al. Patterns of functional diversity of macroinvertebrates across three aquatic ecosystem types, NE Mediterranean. Mediterranean Marine Science. 20 (4), 703-717 (2019).
- Pomeranz, J. P. F., Warburton, H. J., Harding, J. S. Anthropogenic mining alters macroinvertebrate size spectra in streams. Freshwater Biology. 64 (1), 81-92 (2019).
- García-Girón, J., et al. Anthropogenic land-use impacts on the size structure of macroinvertebrate assemblages are jointly modulated by local conditions and spatial processes. Environmental Research. 204, 112055 (2022).
- Demi, L. M., Benstead, J. P., Rosemond, A. D., Maerz, J. C. Experimental N and P additions alter stream macroinvertebrate community composition via taxon-level responses to shifts in detrital resource stoichiometry. Functional Ecology. 33 (5), 855-867 (2019).
- Basset, A., et al. A benthic macroinvertebrate size spectra index for implementing the Water Framework Directive in coastal lagoons in Mediterranean and Black Sea ecoregions. Ecological Indicators. 12 (1), 72-83 (2012).
- Ärje, J., et al. Automatic image-based identification and biomass estimation of invertebrates. Methods in Ecology and Evolution. 11 (8), 922-931 (2020).
- Raitoharju, J., et al. Benchmark database for fine-grained image classification of benthic macroinvertebrates. Image and Vision Computing. 78, 73-83 (2018).
- Lytle, D. A., et al. Automated processing and identification of benthic invertebrate samples. Journal of the North American Benthological Society. 29 (3), 867-874 (2010).
- Serna, J. P., Fernández, D. S., Vélez, F. J., Aguirre, N. J. An image processing method for recognition of four aquatic macroinvertebrates genera in freshwater environments in the Andean region of Colombia. Environmental Monitoring and Assessment. 192, 617 (2020).
- Gorsky, G., et al. Digital zooplankton image analysis using the ZooScan integrated system. Journal of Plankton Research. 32 (3), 285-303 (2010).
- Marcolin, C. R., Schultes, S., Jackson, G. A., Lopes, R. M. Plankton and seston size spectra estimated by the LOPC and ZooScan in the Abrolhos Bank ecosystem (SE Atlantic). Continental Shelf Research. 70, 74-87 (2013).
- Silva, N., Marcolin, C. R., Schwamborn, R. Using image analysis to assess the contributions of plankton and particles to tropical coastal ecosystems. Estuarine, Coast and Shelf Science. 219, 252-261 (2019).
- Vandromme, P., et al. Assessing biases in computing size spectra of automatically classified zooplankton from imaging systems: A case study with the ZooScan integrated system. Methods in Oceanography. 1-2, 3-21 (2012).
- Naito, A., et al. Surface zooplankton size and taxonomic composition in Bowdoin Fjord, north-western Greenland: A comparison of ZooScan, OPC and microscopic analyses. Polar Science. 19, 120-129 (2019).
- . Zooprocess/Plankton Identifier protocol for computer assisted zooplankton sorting Available from: https://manualzz.com/doc/43116355/zooprocess—plankton-identifier-protocol-for (2013)
- Protocolo de muestreo y laboratorio de fauna bentónica de invertebrados en ríos vadeables. CÓDIGO: ML-Rv-I-2013. Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente Available from: https://www.miteco.gob.es/es/agua/temas/estado-y-calidad-de-las-aguas/ML-Rv-I-2013_Muestreo%20y%20laboratorio_Fauna%20bent%C3%B3nica%20de%20de%20invertebrado_%20R%C3%Ados%20vadeables_24_05_2013_tcm30-175284.pdf (2013)
- García-Comas, C., et al. Prey size diversity hinders biomass trophic transfer and predator size diversity promotes it in planktonic communities. Proceedings of the Royal Society Biological Sciences. 283 (1824), 20152129 (2016).
- García-Comas, C., et al. Mesozooplankton size structure in response to environmental conditions in the East China Sea: How much does size spectra theory fit empirical data of a dynamic coastal area. Progress in Oceanography. 121, 141-157 (2014).
- Marquina, D., Buczek, M., Ronquist, F., Lukasik, P. The effect of ethanol concentration on the morphological and molecular preservation of insects for biodiversity studies. PeerJ. 9, 10799 (2021).
- Bell, J. L., Hopcroft, R. R. Assessment of ZooImage as a tool for the classification of zooplankton. Journal of Plankton Research. 30 (12), 1351-1367 (2008).
- Colas, F., et al. The ZooCAM, a new in-flow imaging system for fast onboard counting, sizing and classification of fish eggs and metazooplankton. Progress in Oceanography. 166, 54-65 (2018).
- Bachiller, E., Fernandes, J. A., Irigoien, X. Improving semiautomated zooplankton classification using an internal control and different imaging devices. Limnology and Oceanography Methods. 10 (1), 1-9 (2012).
