Automatische beeldverwerking om de gemeenschapsgroottestructuur van riverine macro-ongewervelde dieren te bepalen
Summary
Het artikel is gebaseerd op de creatie van een aangepast protocol voor het scannen, detecteren, sorteren en identificeren van gedigitaliseerde objecten die overeenkomen met benthische riviermabrieren met behulp van een semi-automatische beeldvormingsprocedure. Deze procedure maakt het mogelijk om de individuele grootteverdelingen en groottemetingen van een macro-ongewervelde gemeenschap in ongeveer 1 uur te verwerven.
Abstract
Lichaamsgrootte is een belangrijke functionele eigenschap die kan worden gebruikt als een bio-indicator om de effecten van verstoringen in natuurlijke gemeenschappen te beoordelen. De structuur van de gemeenschapsgrootte reageert op biotische en abiotische gradiënten, waaronder antropogene verstoringen in taxa en ecosystemen. De handmatige meting van kleine organismen zoals benthische macro-ongewervelde dieren (bijvoorbeeld >500 μm tot enkele centimeters lang) is echter tijdrovend. Om de schatting van de structuur van de gemeenschapsgrootte te versnellen, hebben we hier een protocol ontwikkeld om semi-automatisch de individuele lichaamsgrootte van geconserveerde riviermabrieren te meten, die een van de meest gebruikte bio-indicatoren zijn voor het beoordelen van de ecologische status van zoetwaterecosystemen. Dit protocol is aangepast aan een bestaande methodologie die is ontwikkeld om marien mesozooplankton te scannen met een scansysteem dat is ontworpen voor watermonsters. Het protocol bestaat uit drie hoofdstappen: (1) het scannen van subsamples (fijne en grove monstergroottefracties) van riviermacro-ongewervelde dieren en het verwerken van de gedigitaliseerde afbeeldingen om elk gedetecteerd object in elke afbeelding te individualiseren; (2) het creëren, evalueren en valideren van een leerset door middel van kunstmatige intelligentie om de individuele beelden van macro-ongewervelde dieren semi-automatisch te scheiden van afval en artefacten in de gescande monsters; en (3) het weergeven van de groottestructuur van de macro-ongewervelde gemeenschappen. Naast het protocol omvat dit werk de kalibratieresultaten en somt het verschillende uitdagingen en aanbevelingen op om de procedure aan te passen aan macro-ongewervelde monsters en om verdere verbeteringen te overwegen. Over het algemeen ondersteunen de resultaten het gebruik van het gepresenteerde scansysteem voor de automatische meting van de lichaamsgrootte van riviermacro-ongewervelde dieren en suggereren ze dat de weergave van hun groottespectrum een waardevol hulpmiddel is voor de snelle biobeoordeling van zoetwaterecosystemen.
Introduction
Benthische macro-ongewervelde dieren worden op grote schaal gebruikt als bio-indicatoren om de ecologische toestand van waterlichamen te bepalen1. De meeste indices om macro-ongewervelde gemeenschappen te beschrijven, richten zich op taxonomische statistieken. Nieuwe biobeoordelingsinstrumenten die lichaamsgrootte integreren, worden echter aangemoedigd om een alternatief of complementair perspectief te bieden aan taxonomische benaderingen 2,3.
Lichaamsgrootte wordt beschouwd als een metatrait die gerelateerd is aan andere vitale eigenschappen zoals metabolisme, groei, ademhaling en beweging4. Bovendien kan de lichaamsgrootte de trofische positie en interacties bepalen5. De relatie tussen individuele lichaamsgrootte en de genormaliseerde biomassa (of abundantie) per grootteklasse in een gemeenschap wordt gedefinieerd als het groottespectrum6 en volgt het algemene patroon van een lineaire afname van genormaliseerde biomassa naarmate de individuele grootte toeneemt op een logaritmische schaal7. De helling van deze lineaire relatie is uitgebreid theoretisch bestudeerd en empirische studies in ecosystemen hebben het gebruikt als een ecologische indicator van de structuur van de gemeenschapsgrootte4. Een andere synthetische indicator van de gemeenschapsgroottestructuur die met succes is gebruikt in studies naar het functioneren van biodiversiteit en ecosysteem, is de diversiteit van de gemeenschapsgrootte, die wordt weergegeven als de Shannon-index van de grootteklassen van het groottespectrum of het analoge, die wordt berekend op basis van de individuele grootteverdelingen8.
In zoetwaterecosystemen wordt de groottestructuur van verschillende faunagroepen gebruikt als een ataxische indicator om de respons van biotische gemeenschappen op milieugradiënten 9,10,11 en op antropogene verstoringen 12,13,14,15,16 te beoordelen. Macro-ongewervelde dieren zijn geen uitzondering en hun groottestructuur reageert ook op veranderingen in het milieu17,18 en antropogene verstoringen, zoals mijnbouw19, landgebruik20 of stikstof (N) en fosfor (P) verrijking20,21,22. Het meten van honderden individuen om de structuur van de gemeenschapsgrootte te beschrijven, is echter een vervelende en tijdrovende taak die vaak wordt vermeden als een routinemeting in laboratoria vanwege een gebrek aan tijd. Zo zijn verschillende semi-automatische of automatische beeldvormingsmethoden ontwikkeld om monsters te classificeren en te meten 23,24,25,26. De meeste van deze methoden zijn echter meer gericht op taxonomische classificatie dan op de individuele grootte van de organismen en zijn niet klaar voor gebruik voor alle soorten macro-ongewervelde dieren. In de mariene planktonecologie is een scanbeeldanalysesysteem op grote schaal gebruikt om de grootte en taxonomische samenstelling van zoöplanktongemeenschappen te bepalen 27,28,29,30,31. Dit instrument is te vinden in verschillende mariene instituten over de hele wereld en wordt gebruikt om geconserveerde zoöplanktonmonsters te scannen om digitale beelden met hoge resolutie van het hele monster te verkrijgen. Het huidige protocol past het gebruik van dit instrument aan om het spectrum van de grootte van de macro-ongewervelde gemeenschap in rivieren op een snelle automatische manier te schatten zonder te investeren in het creëren van een nieuw apparaat.
Het protocol bestaat uit het scannen van een monster en het verwerken van de hele afbeelding om automatisch afzonderlijke afbeeldingen (d.w.z. vignetten) van de objecten in het voorbeeld te verkrijgen. Verschillende metingen van vorm, grootte en grijsniveau kenmerken elk object en maken de automatische classificatie van de objecten in categorieën mogelijk, die vervolgens door een expert worden gevalideerd. De individuele grootte van elk organisme wordt berekend met behulp van het ellipsoïdale biovolume (mm3), dat is afgeleid van het gebied van het organisme gemeten in pixels. Dit maakt het mogelijk om het groottespectrum van het monster op een snelle manier te verkrijgen. Voor zover we weten, is dit scanbeeldvormingssysteem alleen gebruikt om mesozoöplanktonmonsters te verwerken, maar het apparaat kan mogelijk werken met zoetwater benthische macro-ongewervelde dieren.
Het algemene doel van deze studie is dan ook om een methode te introduceren om snel de individuele grootte van geconserveerde riviermacro ongewervelde dieren te verkrijgen door een bestaand protocol aan te passen dat eerder werd gebruikt met marien mesozoöplankton 27,32,33. De procedure bestaat uit het gebruik van een semi-automatische aanpak die werkt met een scanapparaat om watermonsters te scannen en drie open software om de gescande afbeeldingen te verwerken. Een aangepast protocol om gedigitaliseerde riviermacro-ongewervelde dieren te scannen, detecteren en identificeren om automatisch de structuur van de gemeenschapsgrootte en gerelateerde groottestatistieken te verkrijgen, wordt hierin gepresenteerd. De beoordeling van de procedure en richtlijnen om de efficiëntie te verbeteren, wordt ook gepresenteerd op basis van 42 gescande afbeeldingen van riviermacro-ongewervelde monsters verzameld uit drie stroomgebieden op het noordoostelijke (NE) Iberisch schiereiland (Ter, Segre-Ebre en Besòs).
De monsters werden verzameld op 100 m riviertrajecten volgens het protocol voor veldbemonstering en laboratoriumanalyse van benthische riviermabrieren in doorwaadbare rivieren van de Spaanse regering34. De monsters werden verzameld met een surber sampler (frame: 0,3 m x 0,3 m, mesh: 250 μm) na een multi-habitat onderzoek. In het laboratorium werden de monsters gereinigd en gezeefd door een maas van 5 mm en een maas van 500 μm om twee submonsters te verkrijgen: een grove substeekproef (5 mm maas) en een fijne substeekproef (500 μm mesh), die werden opgeslagen in afzonderlijke injectieflacons en bewaard in 70% ethanol. Het scheiden van het monster in twee groottefracties zorgt voor een betere schatting van de structuur van de grootte van de gemeenschap, omdat grote organismen zeldzamer en minder zijn dan de kleine organismen. Anders heeft het gescande monster een bevooroordeelde weergave van de grote fractie.
Protocol
Representative Results
Discussion
De aanpassing van de methodologie beschreven door Gorsky et al. 2010 voor riviermacro-ongewervelde dieren maakt een hoge classificatienauwkeurigheid mogelijk bij het schatten van de structuur van de gemeenschapsgrootte in zoetwatermabrieren. De resultaten suggereren dat het protocol de tijd voor het schatten van de individuele groottestructuur in een steekproef kan verkorten tot ongeveer 1 uur. Het voorgestelde protocol is dus bedoeld om het routinematige gebruik van macro-ongewervelde groottespectra te bevorderen als ee…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Spaanse ministerie van Wetenschap, Innovatie en Universiteiten (subsidienummer RTI2018-095363-B-I00). We bedanken de CERM-UVic-UCC-leden Èlia Bretxa, Anna Costarrosa, Laia Jiménez, María Isabel González, Marta Jutglar, Francesc Llach en Núria Sellarès voor hun werk in macro-ongewervelde veldbemonstering en laboratoriumsortering en David Albesa voor hun medewerking aan het scannen van monsters. Tot slot bedanken we Josep Maria Gili en het Institut de Ciències del Mar (ICM-CSIC) voor het gebruik van de laboratoriumfaciliteiten en het scannerapparaat.
Materials
| Beaker | Labbox | Other containers could be used | |
| Dionized water | Icopresa | 8420239600123 | To dilute the ethanol |
| Funnel | Vitlab | 41094 | |
| Glass vials 8 ml | Labbox | SVSN-C10-195 | 1 vial/subsample |
| ImageJ Software | Free access | Version 4.41o/ Image processing software | |
| Large frame | Hydroptic | Provided by ZooScan | 24.5 cm x 15.8 cm |
| Monalcol 96 (Ethanol 96) | Montplet | 1050JE001 | |
| Plankton Identifier Software | Free access | Version 1.2.6/ Automatic identification software | |
| Sieve | Cisa | 26852.2 | Nominal aperture 500µ and nominal aperture 0,5 cm |
| Tweezers | Bondline | B5SA | Stainless, anti-magnetic, anti-acid |
| VueScan 9 x 64 (9.5.09) Software | Hydroptic | Version 9.0.51/ Sacn software | |
| Wooden needle | Any plastic or wood needle can be used | ||
| Zooprocess Software | Free access | Version 7.14/Image processing software | |
| ZooScan | Hydroptic | 54 | Version III/ Scanner |
References
- Birk, S., et al. Three hundred ways to assess Europe’s surface waters: An almost complete overview of biological methods to implement the Water Framework Directive. Ecological Indicators. 18, 31-41 (2012).
- Basset, A., Sangiorgio, F., Pinna, M. Monitoring with benthic macroinvertebrates: advantages and disadvantages of body size descriptors. Aquatic Conservation: Marine and Freshwater Ecosystems. 14, S43-S58 (2004).
- Reyjol, Y., et al. Assessing the ecological status in the context of the European Water Framework Directive: Where do we go now. Science of the Total Environment. 497-498, 332-344 (2014).
- Brown, J. H., Gillooly, J. F., Allen, A. P., Savage, V. M., West, G. B. Toward a metabolic theory of ecology. Ecology. 85 (7), 1771-1789 (2004).
- Woodward, G., et al. Body size in ecological networks. Trends in Ecology & Evolution. 20 (7), 402-409 (2005).
- Sprules, W. G., Barth, L. E. Surfing the biomass size spectrum: Some remarks on history, theory, and application. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (4), 477-495 (2016).
- White, E. P., Ernest, S. K. M., Kerkhoff, A. J., Enquist, B. J. Relationships between body size and abundance in ecology. Trends in Ecology & Evolution. 22 (6), 323-330 (2007).
- Quintana, X. D., et al. A nonparametric method for the measurement of size diversity with emphasis on data standardization. Limnology and Oceanography – Methods. 6 (1), 75-86 (2008).
- Blanchard, J. L., Heneghan, R. F., Everett, J. D., Trebilco, R., Richardson, A. J. From bacteria to whales: Using functional size spectra to model marine ecosystems. Trends in Ecology & Evolution. 32 (3), 174-186 (2017).
- Petchey, O. L., Belgrano, A. Body-size distributions and size-spectra: Universal indicators of ecological status. Biology Letters. 6 (4), 434-437 (2010).
- Emmrich, M., et al. Geographical patterns in the body-size structure of European lake fish assemblages along abiotic and biotic gradients. Journal of Biogeography. 41 (12), 2221-2233 (2014).
- Arranz, I., Brucet, S., Bartrons, M., García-Comas, C., Benejam, L. Fish size spectra are affected by nutrient concentration and relative abundance of non-native species across streams on the NE Iberian Peninsula. Science of the Total Environment. 795, 148792 (2021).
- Vila-Martínez, N., Caiola, N., Ibáñez, C., Benejam, L. l., Brucet, S. Normalized abundance spectra of the fish community reflect hydropeaking on a Mediterranean large river. Ecological Indicators. 97, 280-289 (2019).
- Benejam, L. l., Tobes, I., Brucet, S., Miranda, R. Size spectra and other size-related variables of river fish communities: systematic changes along the altitudinal gradient on pristine Andean streams. Ecological Indicators. 90, 366-378 (2018).
- Sutton, I. A., Jones, N. E. Measures of fish community size structure as indicators for stream monitoring programs. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 77 (5), 824-835 (2019).
- Murry, B. A., Farrell, J. M. Resistance of the size structure of the fish community to ecological perturbations in a large river ecosystem. Freshwater Biology. 59, 155-167 (2014).
- Townsend, C. R., Thompson, R. M., Hildrew, A. G., Raffaelli, D. G., Edmonds-Brown, R. Body size in streams: Macroinvertebrate community size composition along natural and human-induced environmental gradients. In Body Size: The Structure and Function of Aquatic Ecosystems. , (2007).
- Gjoni, V., et al. Patterns of functional diversity of macroinvertebrates across three aquatic ecosystem types, NE Mediterranean. Mediterranean Marine Science. 20 (4), 703-717 (2019).
- Pomeranz, J. P. F., Warburton, H. J., Harding, J. S. Anthropogenic mining alters macroinvertebrate size spectra in streams. Freshwater Biology. 64 (1), 81-92 (2019).
- García-Girón, J., et al. Anthropogenic land-use impacts on the size structure of macroinvertebrate assemblages are jointly modulated by local conditions and spatial processes. Environmental Research. 204, 112055 (2022).
- Demi, L. M., Benstead, J. P., Rosemond, A. D., Maerz, J. C. Experimental N and P additions alter stream macroinvertebrate community composition via taxon-level responses to shifts in detrital resource stoichiometry. Functional Ecology. 33 (5), 855-867 (2019).
- Basset, A., et al. A benthic macroinvertebrate size spectra index for implementing the Water Framework Directive in coastal lagoons in Mediterranean and Black Sea ecoregions. Ecological Indicators. 12 (1), 72-83 (2012).
- Ärje, J., et al. Automatic image-based identification and biomass estimation of invertebrates. Methods in Ecology and Evolution. 11 (8), 922-931 (2020).
- Raitoharju, J., et al. Benchmark database for fine-grained image classification of benthic macroinvertebrates. Image and Vision Computing. 78, 73-83 (2018).
- Lytle, D. A., et al. Automated processing and identification of benthic invertebrate samples. Journal of the North American Benthological Society. 29 (3), 867-874 (2010).
- Serna, J. P., Fernández, D. S., Vélez, F. J., Aguirre, N. J. An image processing method for recognition of four aquatic macroinvertebrates genera in freshwater environments in the Andean region of Colombia. Environmental Monitoring and Assessment. 192, 617 (2020).
- Gorsky, G., et al. Digital zooplankton image analysis using the ZooScan integrated system. Journal of Plankton Research. 32 (3), 285-303 (2010).
- Marcolin, C. R., Schultes, S., Jackson, G. A., Lopes, R. M. Plankton and seston size spectra estimated by the LOPC and ZooScan in the Abrolhos Bank ecosystem (SE Atlantic). Continental Shelf Research. 70, 74-87 (2013).
- Silva, N., Marcolin, C. R., Schwamborn, R. Using image analysis to assess the contributions of plankton and particles to tropical coastal ecosystems. Estuarine, Coast and Shelf Science. 219, 252-261 (2019).
- Vandromme, P., et al. Assessing biases in computing size spectra of automatically classified zooplankton from imaging systems: A case study with the ZooScan integrated system. Methods in Oceanography. 1-2, 3-21 (2012).
- Naito, A., et al. Surface zooplankton size and taxonomic composition in Bowdoin Fjord, north-western Greenland: A comparison of ZooScan, OPC and microscopic analyses. Polar Science. 19, 120-129 (2019).
- . Zooprocess/Plankton Identifier protocol for computer assisted zooplankton sorting Available from: https://manualzz.com/doc/43116355/zooprocess—plankton-identifier-protocol-for (2013)
- Protocolo de muestreo y laboratorio de fauna bentónica de invertebrados en ríos vadeables. CÓDIGO: ML-Rv-I-2013. Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente Available from: https://www.miteco.gob.es/es/agua/temas/estado-y-calidad-de-las-aguas/ML-Rv-I-2013_Muestreo%20y%20laboratorio_Fauna%20bent%C3%B3nica%20de%20de%20invertebrado_%20R%C3%Ados%20vadeables_24_05_2013_tcm30-175284.pdf (2013)
- García-Comas, C., et al. Prey size diversity hinders biomass trophic transfer and predator size diversity promotes it in planktonic communities. Proceedings of the Royal Society Biological Sciences. 283 (1824), 20152129 (2016).
- García-Comas, C., et al. Mesozooplankton size structure in response to environmental conditions in the East China Sea: How much does size spectra theory fit empirical data of a dynamic coastal area. Progress in Oceanography. 121, 141-157 (2014).
- Marquina, D., Buczek, M., Ronquist, F., Lukasik, P. The effect of ethanol concentration on the morphological and molecular preservation of insects for biodiversity studies. PeerJ. 9, 10799 (2021).
- Bell, J. L., Hopcroft, R. R. Assessment of ZooImage as a tool for the classification of zooplankton. Journal of Plankton Research. 30 (12), 1351-1367 (2008).
- Colas, F., et al. The ZooCAM, a new in-flow imaging system for fast onboard counting, sizing and classification of fish eggs and metazooplankton. Progress in Oceanography. 166, 54-65 (2018).
- Bachiller, E., Fernandes, J. A., Irigoien, X. Improving semiautomated zooplankton classification using an internal control and different imaging devices. Limnology and Oceanography Methods. 10 (1), 1-9 (2012).
