Development of a Uterosacral Ligament Suspension Rat Model

Beverly J. Miller; Brian K. Jones; Jonathan S. Turner; Steven R. Caliari; Monique H. Vaughan

doi:10.3791/64311

JoVE Journal > Medicine

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Medicine

子宮仙靭帯サスペンションラットモデルの開発

Published: August 17, 2022

doi:

10.3791/64311

Beverly J. Miller¹, Brian K. Jones², Jonathan S. Turner³, Steven R. Caliari^1,3, Monique H. Vaughan⁴

¹Department of Chemical Engineering,University of Virginia, ²Electrophysiology Division,Abbott, ³Department of Biomedical Engineering,University of Virginia, ⁴Department of Obstetrics and Gynecology, Division of Pelvic Medicine and Reconstructive Surgery,University of Virginia

Summary

骨盤臓器脱は世界中の何百万人もの女性に影響を及ぼしていますが、それでもいくつかの一般的な外科的介入の失敗率は40%にもなります。この状態を調査するための標準的な動物モデルの欠如は、進歩を妨げます。子宮仙靭帯懸垂および in vivo 引張試験のモデルとして、以下のプロトコルを提案します。

Abstract

骨盤臓器脱(POP)は、女性の生活の質に大きな影響を与える可能性のある一般的な骨盤底障害(PFD)です。米国では、女性の約10%〜20%が脱出症を治療するために骨盤底修復手術を受けています。PFDのケースは、米国だけで年間263億ドルの費用をもたらします。この多因子状態は生活の質に悪影響を及ぼしますが、治療の選択肢は最近減少しているだけです。一般的な外科的選択肢の1つは、子宮仙靭帯懸濁液(USLS)であり、これは通常、膣冠を骨盤内の子宮仙靭帯に固定することによって行われる。この修復は、メッシュ増強を伴うものと比較して合併症の発生率が低いですが、最大40%の比較的高い故障率で注目に値します。骨盤底機能障害を研究するための標準的な動物モデルがないことを考えると、費用効果が高くアクセスしやすい動物モデルの開発に焦点を当てたこの分野での革新の緊急の臨床的必要性があります。この原稿では、子宮全摘出術とそれに続く残りの膣金庫の子宮仙靭帯への固定を含むUSLSのラットモデルについて説明します。このモデルの目標は、女性に実行される手順を模倣して、モデルを使用して、靭帯アタッチメントの機械的完全性を改善する修復戦略を調査できるようにすることです。重要なことに、外科的介入後の選択された時点で界面の完全性を特徴付けるための in situ 引張試験手順の開発についても説明します。全体として、このモデルは、USLS を介した POP修復の治療オプションを調査する将来の研究に役立つツールになります。

Introduction

骨盤臓器脱(POP)は、世界中の何百万人もの女性に影響を与える一般的な骨盤底障害であり、特に¹歳の女性の生活の多くの側面に大きな影響を与える可能性があります。特に、米国の女性の約13%が脱出または尿失禁の手術を受けます²。妊娠および出産後に最も一般的な状態である脱出は、腹腔内の正常な位置を超えて、骨盤内臓器、主に膣および/または子宮のさまざまな区画が下降することを特徴としています。これは、膣の膨らみや圧力、腸、膀胱、性機能障害の厄介な症状を引き起こし、全体的な生活の質の低下につながります。POPの他の危険因子には、肥満、タバコの使用、慢性咳、便秘などがあります³。

健康な女性では、骨盤底器官は挙筋、子宮仙骨靭帯(USL)、枢機卿靭帯、骨盤側壁への結合組織の付着、および会陰体の遠位構造によって支えられています^4,5。USLは、子宮と頂端膣の両方にとって最も重要な頂端支持構造の一つであり、したがって、POPの外科的矯正によく使用されます(図1)。USLの構造的サポートは、仙骨部の密集したコラーゲン結合組織に由来し、密集した平滑筋に移行します。この組成勾配により、USLは子宮および膣の筋肉組織と織り交ぜられ、骨盤内臓器をしっかりとサポートします^6,7。子宮仙骨靭帯懸濁液(USLS)では、子宮摘出術後にUSLが膣金庫に固定され、膣と周囲の構造が腹部コンパートメントの解剖学的位置に復元されます。しかし、経膣経路または腹腔鏡経路に関係なく、USLS手順は、一部の研究では最大40%の比較的高い失敗率に悩まされています^8,9。USLなどの根尖脱出症の修復後5年後の厄介な膣膨らみ症状の再発率は、大規模な多施設ランダム化比較試験で約40%でした⁹。同じ試験では、5年後の再発脱出の再治療は約10%でした。.この高い失敗率のメカニズムは研究されていませんが、膣とその周囲の構造を解剖学的位置に戻すには、平滑筋領域ではなく^USL10,11の高密度コラーゲン領域に縫合糸を配置する必要があります。したがって、高い故障率は、ネイティブの頸部-USLアタッチメントに見られる完全な統合と比較して、外科的に形成された膣-USLインターフェースの機械的および組成的不一致が原因である可能性があります。

これらの疾患の治療による経済的影響も顕著であり、米国では外来治療に年間約3億ドルが費やされており¹²、外科手術の直接費用に年間10億ドル以上が費やされています¹³。これらの状態の治療に専念する莫大な経済的資源にもかかわらず、多くの脱出手術から生じる合併症は落胆したままです。例えば、仙骨肛門固定術などのポリプロピレンメッシュベースの頂端脱出修復は、天然組織修復と比較して高い成功率を提供します¹⁴が、メッシュの露出や侵食などの潜在的な合併症を犠牲にします。FDAは、2008年から2010年の間だけで、メッシュ合併症に関連する約3,000件の苦情を受け取りました。これは、2019年4月にPOP用のすべての経膣的に配置されたメッシュ製品の製造と販売を停止するというFDAによる命令で最高潮に達し^ました15。したがって、ポリプロピレン以外の材料とそれらをテストするためのモデルに対する強い臨床的ニーズがあり、それはネイティブの組織脱出修復を強化し、縫合糸のみの従来の技術と比較して成功率を高める可能性があります。

2019年のFDAの発表以来、ほとんどの骨盤外科医は脱出修復のための経膣的に配置されたメッシュの使用をやめており、研究者は間葉系間質細胞(MSC^)など、ネイティブ組織修復を強化するための新しい組織工学的アプローチを模索するよう促しています16,17,1899,20.この焦点のシフトに伴い、新しい材料の開発に役立つ動物モデルの改良が急務です。このプロセスの課題は、臨床的関連性とコストのバランスを取ることです。この目的のために、骨盤臓器脱を研究する基礎科学および臨床研究者は、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、および非ヒト霊長類を含む、これまでにいくつかの動物モデルを利用してきました¹⁹。人間は他の哺乳類種と比較して二足歩行であり、尾がなく、外傷性の出産プロセスがあるため、最適な動物モデルを特定するプロセスは困難です²⁰。豚²¹はロボット仙骨肛門固定術をシミュレートするために利用され、羊は膣脱修復をシミュレートするために使用されてきました²²。これらの動物モデルは、臨床的に関連性があるものの、コストとメンテナンスによって実現可能性が限られています。非ヒト霊長類は、脱出の病因を研究するために使用されてきました。特にリスザルは、自然脱出を発症する可能性のある人間以外の唯一の種の1つであり、最も関連性の高い動物モデルの1つになっています²⁰。非ヒト霊長類は、仙骨肛門固定術²³や子宮移植²⁴などの婦人科外科手術の研究にも使用されています。羊や豚の対応物と同様に、脱出の動物モデルとしての非ヒト霊長類の主な制限は、維持、世話、および搭乗のコストです¹⁹。

げっ歯類の骨盤は水平に向けられており、頭と産道のサイズ比は人間に比べてはるかに小さい¹⁹が、ラットはUSLの解剖学的構造、細胞性、組織学的構造、およびマトリックス組成が類似しているため、USLS手術の小動物研究に適しています人間の^USL25と比較して。さらに、それらはメンテナンスと搭乗の面で有益です。これらの有益な属性にもかかわらず、USLS修復のラットモデルの公表された報告はない。したがって、目的は、多胎ルイスラットにおける子宮摘出術およびUSLSのプロトコルを記述することです。このプロトコルは、このアクセス可能な動物モデルを使用してPOPの病態生理学および外科的コンポーネントを研究することを目指す研究者にとって有益です。

図1:骨盤臓器脱。 (A)腹腔内の臓器の正常な方向、および(B)脱出が発生した場合の劇的な臓器低下。子宮摘出術後、(C)子宮仙靭帯懸濁液は、膣と周囲の構造を適切な解剖学的位置に復元します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Protocol

すべての施設動物管理および使用委員会(IACUC)のガイドラインに従い、開始する前にすべての動物の手順の承認を取得してください。無菌手術技術の要件は、ガイド26および動物福祉規則27に記載されています。この研究は、バージニア大学施設動物管理および使用委員会プロトコル番号4332-11-20によって承認されました。多面的(2リットル)の雌の繁殖者を入手する。ラットは、米国実験動物飼育認定協会によって認定されたビバリウムにペアで収容され、食物と水を自由に提供する必要があります。この研究の動物は、チャールズリバーから入手したルイスラットであり、2リットルの要件に対応するために生後4〜6か月でした。.動物を12時間の明暗サイクルで維持した。 1. 子宮仙骨靭帯懸垂による骨盤臓器脱修復術生きた動物の手術のための機器と手術領域の準備滅菌防水パッドと一緒に再循環温水加熱パッドを使用して、手術ボードが37°Cに加熱されるように手術領域を準備します。漂白剤を含まない表面消毒剤とそれに続く70%エタノールワイプを使用して、手術ボードと手術領域の無菌性を確保します。オートクレーブの加熱滅菌を使用して、手術器具、手術用スポンジ(ガーゼ)、綿棒、使い捨てドレープなど、すべてのオートクレーブの安全な消耗品を滅菌します。滅菌包装された手術用手袋を入手してください。電気バリカン、眼科用軟膏、エタノールワイプ、綿棒、ヨウ素溶液、滅菌包装されたメスの刃と縫合糸を入手し、作業台に置きます。生きた動物手術のための動物の準備動物を2%イソフルランが供給された麻酔室に注意深く置き、適切な麻酔面に達した後に動物の体重を量ります。.動物がつま先のつまみに反応しない場合、適切な麻酔が確認されます。動物を腹臥位の手術台に置き、2%イソフルランを供給された麻酔コーンに鼻をしっかりと入れます。眼科用軟膏を各動物の目に塗ります。オピオイド鎮痛薬とNSAID鎮痛薬を皮下投与します(資料表)。図2に示すように、動物を仰臥位に置き、剣状突起から尿道口(8 cm x 4 cm)まで腹部の毛皮を剃ります。切開部位を準備するためにヨウ素とアルコールの3つのチャージで腹部を滅菌します。注意: シェービングで出血する場合は、ヨウ素とアルコールの準備パッドで皮膚を準備する前に、圧力で止血を達成してください。皮膚にヨウ素を30秒間維持します。手術助手がいない場合は、滅菌綿棒、ドレープ、スポンジ(ガーゼ)、手術用ブレード、縫合糸、手術用マーカー(オプション)など、滅菌用品と器具を滅菌器具トレイに預けます。外科助手が利用可能な場合、このステップは省略することができ、アシスタントはステップ1.3.1に従って滅菌器具を提供することができます。子宮摘出術および子宮仙靭帯懸垂術(USLS)手術用ガウン、ヘッドカバー、マスク、滅菌手袋を着用してください。腹部だけを露出させたまま、無菌畑で動物を覆います。メスの刃を使用して、剣状突起のすぐ下から下部乳頭のラインまで、ラインアルバを7cm切開します。切開は尿道開口部から~0.5-1.0cmの吻側で終わるべきである。次に、下の筋肉層から切開します。出血を防ぐために腹壁血管を避けてください。腹部開創器を組み立て、腹腔を検査します(図3A)。虹彩鉗子を使用して、左子宮角をそっと見つけます。子宮は腸の奥深くにあり、これは腹腔に入ったときに最初に遭遇する構造であることがよくあります。最初に卵巣(図3B)と関連する卵巣脂肪パッドを特定することは有益です。左子宮角をグラスパーまたは蚊クランプでそっと持ち上げ、蚊クランプを使用して卵巣と卵管の下の角を結紮することにより子宮摘出術を開始します。卵巣は繊細な構造であり、操作によって容易に損傷または破壊されます。子宮角を上げるときは注意してください。これを達成するために卵巣から安全な距離で角をつかみます。マイクロハサミを使用して子宮角から隣接する血管系、結合組織、および脂肪をクランプおよびトリミングすることにより、子宮摘出術を続行します。出血を減らすために、除去する前に結合組織をクランプします。クランプを子宮の界面のできるだけ近くに、子宮頸部の接合部(角分岐とも呼ばれます)まで配置します。蚊の鉗子を使用して分岐点近くの子宮角を横切ってクランプします(図4A-C)。出血を避けるために、同側の角をクランプにちょうど頭状に切除します。これは、子宮頸部接合部(子宮頸部への吻側)と子宮 – 卵管結紮点の間に位置しています。膣金庫は子宮摘出術後も残ります(図4D)。注:ラット血管の口径が小さいため、この手術には一時的なクランプによる子宮断端の結紮で十分でした。しかしながら、この技術は、電気焼灼または縫合糸結紮による椎弓根の密封のいずれかで必要に応じて修正することができる。右子宮角で手順1.3.3〜1.3.6を繰り返して、子宮全摘出術を行います。腹部開創器を調整して、骨盤下部を露出させます。露出した膣金庫と骨盤底支持靭帯および結合組織を検査し、膣および子宮頸部に付着しているのが見える。可能であれば、卵巣の内側にある両側の尿管を特定します。子宮角の残りの断端(膣金庫)のすぐ下の子宮頸部に付着しているのがわかる図5Aに示す子宮仙骨靭帯28,29を特定します。靭帯は、仙骨に向かって頭側の内側の向きでトレースされます。小さな先細りの針に3-0ポリジアキサノン縫合糸を使用して、左子宮仙靭帯に縫い目を通します。仙骨に近い靭帯の高い位置にステッチを置きます。ステッチを引っ張って、子宮仙骨靭帯を捕らえたことを確認します-USL構造が子宮頸部に挿入され、起点が直腸の後ろに潜り、仙骨に付着します。繰り返しになりますが、尿管を特定して、子宮仙骨縫合に組み込まれたり、子宮仙骨縫合でねじれたりしていないことを確認します。次に、膣カフの前部と後部の両方を組み込むように注意しながら、左のポリジアキサノンステッチを膣ボールトの左側の側面に通します(図5B)。手順を繰り返して、右側の USLS 手順を完了します。必要に応じて、複数のステッチを両側に配置することができます。子宮仙骨の縫合が両側に配置されたら、図5Cに示すように、四角い結び目を使用して縫合糸をしっかりと結び、膣の金庫が仙骨に向かって頭蓋骨に上昇するようにします。これで子宮仙骨靭帯サスペンションは完了です。手術創を閉じる腹部の内容物を腹腔内の解剖学的位置に戻します。腹壁の深層(腹膜、筋膜、筋肉)を4-0〜6-0ポリグラクチン910またはポリジアキサノン縫合糸の連続縫合パターンで閉じます。 4-0から6-0のポリジアキサノンまたはポリグラクチン910の実行中の皮下(または中断)ステッチで皮膚を閉じます。手術部位感染予防の必要に応じて抗生物質を皮下投与する。動物が胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、術後のモニタリングを実行します。.完全に回復するまで動物を社会住宅に戻さないでください。図2:ライブ手術のための動物の準備。切開部位の周囲の領域から毛皮を除去することは、適切な無菌技術に必要です。パネル(A)および(B)に示す領域はガイドラインです。研究者は、滅菌器具が手術中に髪と接触しないように十分な髪を取り除く必要があります。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。図3:卵巣の保存。子宮角は、(A)に示すように、腹部が最初に開かれたときには通常見えません。角を見つけて追跡し、(B)角に接続する卵巣と卵管を見つけたら、角の上部を固定し、角を分離して子宮摘出術を開始できます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。図4:子宮角の除去。ラットの子宮摘出術は、(A)子宮頸部接合部で固定された(B)子宮頸部角と(C)切除の両方を含む。各角からの膣金庫は、(D)頸部/子宮断端(矢印)がそれらをつなぐままです。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。図5:子宮仙靭帯サスペンション。 (A)作成された膣金庫構造に対する子宮仙骨靭帯の向き。子宮仙靭帯サスペンション(USLS)修復のために縫合糸を配置する場合、(B)縫合糸は子宮仙靭帯を捕捉し、膣腱板の前側と後部の両方を通過します。(C)子宮仙骨靭帯に固定された膣ボールトは、仙骨に向かって頭蓋骨が上昇するようになりました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 2.一軸引張試験注意: 使用したテストシステムとソフトウェアは、キャリブレーションとテストに関する製造元のガイドラインに従って操作されました。すべての試験は22°Cで行った。試料作製IACUC承認の薬理学的手順を使用してラットを安楽死させます。.二次的な物理的方法による死を確実にする。ここでは、CO2吸入、続いて心臓穿刺を用いた。引張機械的試験に備えて膣ボールトを露出させます。現在の研究では、天然の子宮仙靭帯(対照)と、上記のように子宮仙靭帯サスペンションを受けた動物(POP)に対して引張試験を実施します。手術後24週間で靭帯をその場でテストします。縫合糸の完全な再吸収を可能にするために、最低8週間の最終時点が推奨されます。人道的な安楽死に続いて、腹部を露出させるためにリネアアルバを切開します。膣の金庫が見えるまで脂肪組織の解剖を開始します。無傷のUSLがはっきりと見えるまで(対照動物、図6A)、または子宮仙骨靭帯と膣金庫の間の接合部が見えるようになるまで(POP動物、図6C)、腹部脂肪パッドを解剖し続けます。接合部を引っ張って脂肪組織を取り除くのではなく、マイクロハサミで慎重にカットしてサンプル間の一貫性を維持するように注意してください。柔軟な定規を使用して、子宮仙骨挿入(直腸の後方)と膣金庫の間の距離を測定します。この値は組織の元の長さです。注:コントロールUSLの組織の元の長さであるゲージ長は13.4 ± 0.5 mmでしたが、USL修復のゲージ長は12.8 ± 0.4 mmでした。組織がアンビリカルテープの中心になるように、無傷のUSL(コントロール、図6B)またはUSLS接合部(POP、図6D)の後ろにアンビリカルテープを通します。デジタルノギスを使用して、アンビリカルテープと交差する組織の高さと幅を測定します。これらの値は、断面積の計算に使用されます。ベースアダプターを介して大きな圧縮プレート(材料表)を取り付け、標本がグリップホルダーの下の中央にくるように動物を上に配置します。引張試験引張試験レジームをソフトウェアにプログラムします:プリロード、プレコンディショニング、プルトゥフォールド。これは、以前の骨盤底29 および生殖組織30 の機械的試験プロトコルに従います。引張試験の準備として機器をセットアップします。現在の研究では、図7に示すように、10 Nロードセル、3Dプリントグリップ、およびベースアダプターを使用して圧縮プラテンを取り付けます。注:動物のフルサイズをサポートできるベースセットアップはどれでもかまいません。アンビリカルテープをしっかりと保持できるグリップを使用してください。このテストでは、以前の研究31,32からのカスタム3Dプリントホルダーとグリップが使用されました。STLファイルは補足ファイルとして含まれていました。標本がグリップの下の中央になるように動物を配置します(図8A)。動物をプラテンに固定することにより、標本を囲む骨盤領域を固定します(図8B)。アンビリカルテープの尾がグリップに届きやすいようにロードセルを下げます。アンビリカルテープをグリップに固定し、検体の操作を避けるためにテープをたるませます。ソフトウェアインターフェイスでプレコンディショニングテストを開き、サンプル名でテストにラベルを付けます。プレコンディショニング方法にプリロードステップが含まれていることを確認します。クリックしてプレコンディショニングテストを開始し、サンプルを0.015Nでプリロードします。予圧力が安定したら、テストはサンプルを0.1 mm / sの伸び率で30秒間事前調整します。ティッシュを1分間休ませます。待機中に、プルツーフォールテスト体制をロードします。注意: 予圧力は、機器の制限や試験条件によって異なる場合があります。報告された予圧が0.015 Nから0.1 N 29,33,34,35,36の範囲である以前の研究を参照してください。失敗するようにプログラムされているテスト体制を開きます。テストにサンプル名のラベルを付け、[ OK ] をクリックして次のウィンドウに移動します。サンプルのゲージ長を入力し、[ 次へ ]をクリックしてテストページに遷移します。すべてのバランスを取り、[ 開始]をクリックします。組織が破壊されるまで、0.1 mm / sの伸長率でテストを実行します。テストでは、荷重-変位データが生成されます。引張試験のための応力、ひずみ、弾性率の計算荷重-変位データ、断面積、およびサンプルからのゲージ長を使用して、以前に報告された応力(MPa)とひずみ(%)を計算します37,38,39,40,41。以下に示す式1と式2を使用します。テスト中のテープの伸びもこれらの計算で考慮する必要があることに注意してください。式 1 式 2荷重-変位曲線(図9A、D)から、剛性(直線勾配、N / mm)と極限荷重を計算します。応力ひずみ曲線から、接線係数(直線勾配、MPa)と到達応力を計算します。応力ひずみ曲線の線形領域を図9B,Eに記載し、この領域から計算された接線弾性率を両方の実験群について図9C,Fに示します。注: 剛性と接線弾性率の両方について、線形回帰37,41 の R2 値を最大化する点のウィンドウを選択して、線形部分を特定します。図6:一軸引張試験用の試験片の準備。 (A)臍帯テープの前に露出したコントロールUSLを組織の後ろに通します。(C)縫合糸を完全に溶解した後のUSL-膣ボールト接合部は、(B)引張試験の準備において組織の後ろにねじ込まれた臍帯テープによる。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。図7:機械的試験システム。 (A)引張試験モードの試験システムは、(B)3Dプリントホルダーと(C)3Dプリントされたサンプルグリップで使用され、グリップを改善するためのテクスチャストリップを備えています。パネル(D)に示すピースの構成。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。図8:引張試験のセットアップ。 (A)試験片はグリップとホルダーの下の中央に配置されています。(B)試験片を囲む動物および組織は、引張試験の開始前に静止している。挿入画像が示すように、目的の組織を単離するには、周囲の組織を確保することが不可欠です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。図9:引張試験データの出力と解析の例。 (A)対照サンプルの荷重-変位曲線とそれに続く(B)応力ひずみ解析、(C)接線弾性率をMPaで示す直線曲線フィット式の傾き。(D-F)は、USLSサンプルの同じプロセスを示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Representative Results

外科的実現可能性と子宮仙骨縫合の配置いずれの動物においても子宮摘出術および子宮仙靭帯懸垂に関連する術中合併症は認められなかった。隣接する血管系が除去前にクランプされていれば、子宮角の除去中の出血は最小限であった。出血が限られているため、縫合糸留置のための子宮仙靭帯の良好な視覚化が可能になり、術中の腸、直腸、尿管、または膀胱の損傷が防止されました。縫合糸の配置後、新しく形成されたUSL-膣ボールト接合部は、図5Cに示すように頸部/子宮断端の動きを妨げました。術後最初の3日間は、動物を毎日チェックし、その後実験が終了するまで隔週でチェックしました。手術時に徐放性オピオイドとNSAID鎮痛薬を投与すると、追加の鎮痛薬は不要であることがわかりました。16回の動物手術(対照群とUSLS群の両方でn = 8)の経験に基づくと、手術後の最初の週に体重の減少が予想され、手術日の体重から平均5.7±1.4%減少することが予想されます。予想通り、ラットはその後の23週間でゆっくりと体重が増加し、実験の過程で平均体重増加は15.1±4.5%でした。 USLS修理の機械的試験USLS修理の機能を実証するために、一軸引張試験が実施されました。選択した術後時点(この研究では24週間)で動物を安楽死させた後、図6Aに示すように、USLと膣ボールトの接合部を視覚化するために手術領域を注意深く解剖する必要があります。ラットUSLを他の支持構造および骨盤内臓器と一緒に試験するための他の方法論と比較して29、42、ここで説明する方法は、ラットUSLを単離された様式で試験する最初のものである。この研究で使用されたアンビリカルテープは、テープのコンプライアンスにより引張試験準備中の組織の破壊を最小限に抑えることができるため、その柔軟性を考慮して戦略的に選択されました。したがって、荷重変位データは、アンビリカルテープによる少量の伸縮を考慮して調整する必要があります。図9は引張試験によって得られたデータの例を示し、図9Aは典型的な応力-ひずみプロットの例を示しています。応力-ひずみデータの報告は、この情報が正規化され、試験片34のサイズとは無関係であり、研究間でより適切に比較できるため、推奨されます。無傷の子宮仙靭帯については、極限荷重(2.9 ± 0.5 N)や剛性(0.4 ± 0.1 N/mm)などの構造特性と、極限応力(2.1 ± 0.4 MPa)、極限ひずみ(1.6 ± 0.5)、接線弾性率(4.0 ± 1.1 MPa)などの正規化された材料特性を報告します。Moalliらがラットの生殖器官とそのすべての支持組織接続に対して実施した一軸試験では、単離されたUSL29よりも高い破壊時の最終荷重(13.2 ± 1.1 N)と剛性(2.9 ± 0.9 N / mm)が報告されました。Moalliらによって行われた研究および他の文献34,35は、ここに提示されたデータに示されているように、試験された標本間の高い変動性に言及している。子宮仙靭帯懸垂修復では、すべての構造材料特性(剛性0.33 ± 0.13 N/mm、極限荷重2.6 ± 1.3 N)と正規化材料特性(極限応力1.8 ± 0.7 MPa、極限ひずみ1.3 ± 0.3、接線弾性率3.0 ± 0.9 MPa)がネイティブUSLよりも低いことがわかりました。

Discussion

このプロトコルは、いくつかの利点で注目に値します。私たちの知る限り、これはラットモデルにおけるUSLSの最初の公開された説明であり、将来の研究者に研究環境でこの手順を実行するための再現可能な手順を提供します。第二に、USLのネイティブおよび外科的インターフェースの引張試験のための新しいプロトコルが含まれています。引張試験プロトコルは、USLSなどのネイティブ組織修復を強化するための新しい組織工学的アプローチを調査する同様の研究に利用できます。さらに、ラットモデル自体は、大型動物モデルと比較して、取り扱い/搭乗が容易で、寿命が短く、コスト効率が高いため、骨盤底障害の研究に役立ちます。プロトコルの制限には、USLSの主な合併症の1つである尿管ねじれを評価できないことが含まれます。それにもかかわらず、この研究では尿管損傷と推定される症例はありませんでした。別の考慮事項は、骨盤の水平方向、小さな胎児の頭と産道の比率、およびラットモデルにおける自然脱出の欠如は、ヒトへの結果の適用性を制限することです。しかし、多面ラットの使用は、^POP3の発症における主要な危険因子を説明するため、この研究の強みです。

ルイスラットにおける子宮摘出術とUSLSの成功したプロトコルの確立は、USLの機械的挙動をテストする際の変動を最小限に抑えながら、POPの外科的コンポーネントを調査する将来の研究者にとって有用なツールになります。外科動物モデルは、研究者がヒトでの最初の研究の倫理的リスクを軽減しながら、同等性、体重、疾患、および栄養³⁴を制御する臨床的に関連する実験を設計できるという点で有益です。さらに、POPの標準化されたモデルにより、研究者はヒト組織収集の制限を回避できます。特に、このプロトコルに記載されている引張試験方法は、研究間の一貫性を可能にします。以前のげっ歯類モデルは、子宮頸部、膣、および複数の骨盤支持靭帯を含む骨盤領域全体の機械的特性をテストしました^29,42。ここで説明する方法は、本来の脊椎および頸部の付着を維持する方法でUSLの測定を可能にします。引張試験方法はUSLのみを評価するのではなく、仙骨および子宮頸部への挿入と組み合わせてUSLを評価することに注意する必要があります。これは、靭帯が受ける通常のin situ力を反映しているため、この研究の強みです。孤立した靭帯の機械的挙動は、天然の付着物なしでex vivoでテストされた場合、異なることを認めています。ラットの構造が小さく、ex vivo試験に適したサンプルを収集する可能性を制限するため、これは特に当てはまります。USLはその場で複数の方向に荷重をかける経験があるため、テストの一軸性は制限ですが、この方法を使用すると、ラットUSL力学の以前の研究間の有意義な比較が可能になります^29,42。現在、広く受け入れられている標準的な機械的試験プロトコルはありませんが、このモデルは、現場での将来の組織工学研究に役立つツールになります。

このプロトコルに記載されているいくつかのステップは、動物の健康と幸福、およびUSLS手術とその後の引張試験の再現性にとって重要です。第一に、鎮痛薬と消炎薬の両方を入手することが不可欠であり、鎮痛薬だけでは疼痛管理には不十分であることが判明した。予防的抗生物質は、手術部位感染のリスクを低下させ、人間の手術における標準治療です。USLSの外科的処置に関しては、卵巣への損傷を回避し、失血を最小限に抑えることが手術を成功させるために不可欠です。ステップ1.3.3および1.3.4では、子宮角の上部を隣接する卵巣から分離することについて説明しています。過度の出血を引き起こす可能性がある卵巣の周りの繊細な血管の破壊を防ぐために、子宮角の側面でこの解剖を維持するように注意する必要があります。注目すべきことに、他の研究者は、子宮角の除去後も卵巣機能が維持されることを示しました⁴³。さらに、卵巣が破壊または除去されると、全体的なコラーゲン線維構造が乱され、その組織の機械的特性が変化します^44,45。子宮角が卵巣から安全に分離されると、解剖の明確な平面があり、周囲の脂肪パッドおよび血管系から子宮角を分離することができます。解剖の明確な平面にもかかわらず、子宮角に沿った茎は、マイクロハサミで切断する前にクランプで固定する必要があります。ヒトの外科手術とは対照的に、子宮摘出術の椎弓根の縫合結紮は、切断前に椎弓根をクランプすることで十分な止血が保証されるため、不要であることがわかりました。プロトコルのステップ1.3.6では、失血を最小限に抑えるためのこの慎重なプロセスについて説明しています。子宮摘出術が行われている間、ステップ1.3.6および1.3.8で述べたように尿管を特定するために細心の注意を払う必要があります。ヒトのUSLに関連する最も一般的な合併症の1つは尿管損傷であるため、尿管の解剖学的近接性を理解することは重要です⁴⁶。

結論として、ラットモデルでUSLの子宮摘出術、子宮仙靭帯懸濁液、および引張試験を行うための新しいプロトコルを提示します。私たちの発見は、これらの手順の明確で再現可能な説明を提供することにより、将来の基礎科学研究者を支援し、それによって骨盤臓器脱研究の進歩を可能にすることを期待しています。

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

シルビア・ブレムカー教授にはインストロンを使用し、ジョージ・クライスト教授には手術スペースと3Dプリントされたホルダーとグリップを使用していただき、感謝します。この研究は、UVA-コールタートランスレーショナルリサーチパートナーシップと国防総省(W81XWH-19-1-0157)の支援を受けました。

Materials

Alcohol prep pad	BD	326895
Artificial Tear Ointment	American Health Service Sales Corp	PH-PARALUBE-O
Bluehill software	Instron	Bluehill 3
Cavicide 1 disinfectant	Fisher Scientific	22 998 800
Compression platean	Instron	2501-163
Cotton swabs	Puritan Medical	806-WC
Gauze Sponge, 8-Ply	VWR	95038-728
Mosquito Forceps	Medline Industries	MMDS1222115
Needle Holder	Medline Industries	DYND04045
Operating Scissors, 5½", Sharp	American Health Service Sales Corp	4-222
Opioid Analgesic (Buprenorphine XR)	Fidelis Animal Health	Ethiqa XR	0.65 mg/kg SC Q72
NSAID Analgesic (Meloxicam SR)	Wildlife Pharmaceuticals, LLC	Meloxicam SR	1 mg/kg SC q72
PDS II, 3-0 Polydioxanone Suture, SH-1	Ethicon	Z316H
PDS II, 5-0 P olydioxanone Suture, RB-1	Ethicon	Z303H
Retractor	Medline Industries	MDS1862107
Scalpel Blade Stainless Surgical #10	Miltex	4-310
Scalpel Handle	Medline Industries	MDS15210
Scissor, Micro, Curved, 4.5"	Westcott	MDS0910311
Single Column Universal Testing System	Instron	5943 S3873	1 kN force capacity, 10 N load cell
Sterile Natural Rubber Latex Gloves	Accutech	91225075
Suture,Vicryl,6-0,P-3	Ethicon	J492G
Tape,Umbilical,Cotton,1/8X18"	Ethicon	U10T
Tension and Compression Load Cell	Instron	2530-10N	10N load cell (1 kgf, 2 lbf)
Veterinary surgical adhesive (skin glue)	Covetrus	31477

References

Olsen, A. L., et al. Epidemiology of surgically managed pelvic organ prolapse and urinary incontinence. Obstetrics and Gynecology. 89 (4), 501-506 (1997).
Wu, J. M., et al. Lifetime risk of stress urinary incontinence or pelvic organ prolapse surgery. Obstetrics and Gynecology. 123 (6), 1201-1206 (2014).
Kenton, K., Mueller, E. R. The global burden of female pelvic floor disorders. BJU International. 98, 1-7 (2006).
Herschorn, S. Female pelvic floor anatomy The pelvic floor, supporting structures, and pelvic organs. Reviews in Urology. 6, 2-10 (2004).
Jelovsek, J. E., Maher, C., Barber, M. D. Pelvic organ prolapse. The Lancet. 369 (9566), 1027-1038 (2007).
Campbell, R. M. The anatomy and histology of the sacrouterine ligaments. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 59 (1), 1-12 (1950).
Reisenauer, C., et al. The role of smooth muscle in the pathogenesis of pelvic organ prolapse – An immunohistochemical and morphometric analysis of the cervical third of the uterosacral ligament. International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 19 (3), 383-389 (2008).
Lavelle, R. S., Christie, A. L., Alhalabi, F., Zimmern, P. E. Risk of prolapse recurrence after native tissue anterior vaginal suspension procedure with intermediate to long-term followup. Journal of Urology. 195 (4), 1014-1020 (2016).
Jelovsek, J. E., et al. Effect of uterosacral ligament suspension vs sacrospinous ligament fixation with or without perioperative behavioral therapy for pelvic organ vaginal prolapse on surgical outcomes and prolapse symptoms at 5 years in the OPTIMAL randomized clinical trial. JAMA – Journal of the American Medical Association. 319 (15), 1554-1565 (2018).
Bradley, M. S., et al. Vaginal uterosacral ligament suspension: A retrospective cohort of absorbable and permanent suture groups. Female Pelvic Medicine & Reconstructive Surgery. 24 (3), 207-212 (2018).
Cola, A., et al. Native-tissue prolapse repair: Efficacy and adverse effects of uterosacral ligaments suspension at 10-year follow up. International Journal of Gynecology and Obstetrics. , (2022).
Sung, V. W., Washington, B., Raker, C. A. Costs of ambulatory care related to female pelvic floor disorders in the United States. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 202 (5), 1-4 (2010).
Subak, L. L., et al. Cost of pelvic organ prolapse surgery in the United States. Obstetrics and Gynecology. 98 (4), 646-651 (2001).
Siddiqui, N. Y., et al. Mesh sacrocolpopexy compared with native tissue vaginal repair: A systematic review and meta-analysis. Obstetrics & Gynecology. 125 (1), 44-55 (2015).
FDA takes action to protect women’s health, orders manufacturers of surgical mesh intended for transvaginal repair of pelvic organ prolapse to stop selling all devices. FDA News Release Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-takes-action-protect-womens-health-orders-manufacturers-surgical-mesh-intended-transvaginal (2019)
Brincat, C. A. Pelvic organ prolapse reconsidering treatment, innovation, and failure. JAMA – Journal of the American Medical Association. 322 (11), 1047-1048 (2019).
Cundiff, G. W. Surgical innovation and the US Food and Drug Administration. Female Pelvic Medicine & Reconstructive Surgery. 25 (4), 263-264 (2019).
Luchristt, D., Weidner, A. C., Siddiqui, N. Y. Urinary basement membrane graft-augmented sacrospinous ligament suspension: a description of technique and short-term outcomes. International Urogynecology Journal. 33 (5), 1347-1350 (2022).
Couri, B. M., et al. Animal models of female pelvic organ prolapse: Lessons learned. Expert Review of Obstetrics and Gynecology. 7 (3), 249-260 (2012).
Mori da Cunha, M. G. M. C., et al. Animal models for pelvic organ prolapse: systematic review. International Urogynecology Journal. 32 (6), 1331-1344 (2021).
Kasabwala, K., Goueli, R., Culligan, P. J. A live porcine model for robotic sacrocolpopexy training. International Urogynecology Journal. 30 (8), 1371-1375 (2019).
Mansoor, A., et al. Development of an ovine model for training in vaginal surgery for pelvic organ prolapse. International Urogynecology Journal. 28 (10), 1595-1597 (2017).
Liang, R., et al. Impact of prolapse meshes on the metabolism of vaginal extracellular matrix in rhesus macaque. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 212 (2), 1-7 (2015).
Johannesson, L., et al. Preclinical report on allogeneic uterus transplantation in non-human primates. Human Reproduction. 28 (1), 189-198 (2013).
Iwanaga, R., et al. Comparative histology of mouse, rat, and human pelvic ligaments. International Urogynecology Journal. 27 (11), 1697-1704 (2016).
National Research Council. . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition. , (2011).
Federal Animal Welfare Regulations. National Archives Available from: https://www.ecfr.gov/current/title-9/chapter-l/subchapter-A/part-2/subpart-C/section-2.31 (2022)
Ma, Y., et al. Knockdown of Hoxa11 in vivo in the uterosacral ligament and uterus of mice results in altered collagen and matrix metalloproteinase activity. Biology of Reproduction. 86 (4), 100 (2012).
Moalli, P. A., et al. A rat model to study the structural properties of the vagina and its supportive tissues. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 192 (1), 80-88 (2005).
Yoshida, K., et al. Mechanics of cervical remodelling: Insights from rodent models of pregnancy. Interface Focus. 9 (5), 20190026 (2019).
Christ, G. J., Sharma, P., Hess, W., Bour, R. . Modular biofabrication platform for diverse tissue engineering applications and related method thereof. , (2020).
Smith, K., Christ, G. J. . Incorporation of in vitro double seeding for enhanced development of tissue engineered skeletal muscle implants. , (2019).
Becker, W. R., De Vita, R. Biaxial mechanical properties of swine uterosacral and cardinal ligaments. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 14 (3), 549-560 (2015).
Donaldson, K., Huntington, A., De Vita, R. Mechanics of uterosacral ligaments: Current knowledge, existing gaps, and future directions. Annals of Biomedical Engineering. 49 (8), 1788-1804 (2021).
Baah-Dwomoh, A., McGuire, J., Tan, T., De Vita, R. Mechanical properties of female reproductive organs and supporting connective tissues: A review of the current state of knowledge. Applied Mechanics Reviews. 68 (6), 1-12 (2016).
Tan, T., Cholewa, N. M., Case, S. W., De Vita, R. Micro-structural and biaxial creep properties of the swine uterosacral-cardinal ligament complex. Annals of Biomedical Engineering. 44 (11), 3225-3237 (2016).
Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham, A. C., Thomopoulos, S. Biomechanical testing of murine tendons. Journal of Visualized Experiments. (152), e60280 (2019).
Griffin, M., et al. Biomechanical characterization of human soft tissues using indentation and tensile testing. Journal of Visualized Experiments. (118), e54872 (2016).
Feola, A., et al. Parity negatively impacts vaginal mechanical properties and collagen structure in rhesus macaques. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 203 (6), 1-8 (2010).
Tan, T., et al. Histo-mechanical properties of the swine cardinal and uterosacral ligaments. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 42, 129-137 (2015).
Abramowitch, S. D., Feola, A., Jallah, Z., Moalli, P. A. Tissue mechanics, animal models, and pelvic organ prolapse: A review. European Journal of Obstetrics and Gynecology and Reproductive Biology. 144, 146-158 (2009).
Lowder, J. L., et al. Adaptations of the rat vagina in pregnancy to accommodate delivery. Obstetrics and Gynecology. 109 (1), 128-135 (2007).
Koebele, S. V., et al. Hysterectomy uniquely impacts spatial memory in a rat model: A role for the nonpregnant uterus in cognitive processes. Endocrinology. 160 (1), 1-19 (2019).
Kafantari, H., et al. Structural alterations in rat skin and bone collagen fibrils induced by ovariectomy. Bone. 26 (4), 349-353 (2000).
Daghma, D. E. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers in bone matrix indicates bone quality in ovariectomized rat spine. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 36 (3), 297-306 (2018).
Manodoro, S., Frigerio, M., Milani, R., Spelzini, F. Tips and tricks for uterosacral ligament suspension: how to avoid ureteral injury. International Urogynecology Journal. 29 (1), 161-163 (2018).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Miller, B. J., Jones, B. K., Turner, J. S., Caliari, S. R., Vaughan, M. H. Development of a Uterosacral Ligament Suspension Rat Model. J. Vis. Exp. (186), e64311, doi:10.3791/64311 (2022).

Automatically Generated