Development of a Uterosacral Ligament Suspension Rat Model

Beverly J. Miller; Brian K. Jones; Jonathan S. Turner; Steven R. Caliari; Monique H. Vaughan

doi:10.3791/64311

JoVE Journal > Medicine

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Medicine

Sviluppo di un modello di ratto di sospensione del legamento uterosacrale

Published: August 17, 2022

doi:

10.3791/64311

Beverly J. Miller¹, Brian K. Jones², Jonathan S. Turner³, Steven R. Caliari^1,3, Monique H. Vaughan⁴

¹Department of Chemical Engineering,University of Virginia, ²Electrophysiology Division,Abbott, ³Department of Biomedical Engineering,University of Virginia, ⁴Department of Obstetrics and Gynecology, Division of Pelvic Medicine and Reconstructive Surgery,University of Virginia

Summary

Il prolasso degli organi pelvici colpisce milioni di donne in tutto il mondo e tuttavia alcuni interventi chirurgici comuni hanno tassi di fallimento fino al 40%. La mancanza di modelli animali standard per studiare questa condizione impedisce il progresso. Proponiamo il seguente protocollo come modello per la sospensione del legamento uterosacrale e il test di trazione in vivo .

Abstract

Il prolasso degli organi pelvici (POP) è un disturbo comune del pavimento pelvico (PFD) con il potenziale di avere un impatto significativo sulla qualità della vita di una donna. Circa il 10% -20% delle donne subisce un intervento chirurgico di riparazione del pavimento pelvico per trattare il prolasso negli Stati Uniti. I casi di PFD comportano un costo annuale complessivo di 26,3 miliardi di dollari solo negli Stati Uniti. Questa condizione multifattoriale ha un impatto negativo sulla qualità della vita e tuttavia le opzioni di trattamento sono diminuite solo nel recente passato. Un’opzione chirurgica comune è la sospensione del legamento uterosacrale (USLS), che viene tipicamente eseguita fissando la volta vaginale al legamento uterosacrale nel bacino. Questa riparazione ha una minore incidenza di complicanze rispetto a quelle con aumento della rete, ma è notevole per un tasso di fallimento relativamente alto fino al 40%. Considerando la mancanza di modelli animali standard per studiare la disfunzione del pavimento pelvico, vi è un’urgente necessità clinica di innovazione in questo campo con particolare attenzione allo sviluppo di modelli animali economici e accessibili. In questo manoscritto, descriviamo un modello di ratto di USLS che coinvolge un’isterectomia completa seguita dalla fissazione della volta vaginale rimanente al legamento uterosacrale. L’obiettivo di questo modello è quello di imitare la procedura eseguita sulle donne per poter utilizzare il modello per poi indagare strategie riparative che migliorino l’integrità meccanica dell’attacco legamentoso. È importante sottolineare che descriviamo anche lo sviluppo di una procedura di prova di trazione in situ per caratterizzare l’integrità dell’interfaccia in punti temporali scelti dopo l’intervento chirurgico. Nel complesso, questo modello sarà uno strumento utile per studi futuri che studiano le opzioni di trattamento per la riparazione POP tramite USLS.

Introduction

Il prolasso degli organi pelvici (POP) è un disturbo comune del pavimento pelvico che colpisce milioni di donne in tutto il mondo con il potenziale di avere un impatto significativo su molti aspetti della vita di una donna, in particolare con l’età^{di 1} anno. In particolare, circa il 13% delle donne negli Stati Uniti subirà un intervento chirurgico per prolasso o incontinenza urinaria². Una condizione più comune dopo la gravidanza e il parto, il prolasso è caratterizzato dalla discesa degli organi pelvici, prevalentemente i vari compartimenti della vagina e / o dell’utero, oltre la loro normale posizione nella cavità peritoneale. Ciò porta a fastidiosi sintomi di rigonfiamento vaginale o pressione, intestino, vescica e disfunzione sessuale e una qualità della vita complessivamente ridotta. Altri fattori di rischio per POP includono obesità, uso del tabacco, tosse cronica e costipazione³.

Nelle donne sane, gli organi del pavimento pelvico sono supportati dai muscoli elevatori ani, dai legamenti uterosacrali (USL), dai legamenti cardinali, dagli attacchi del tessuto connettivo al fianco pelvico e dalle strutture distali del corpo perineale ^4,5. Le USL sono tra le più importanti strutture di supporto apicale sia per l’utero che per la vagina apicale e, quindi, sono spesso utilizzate nella correzione chirurgica del POP (Figura 1). Il supporto strutturale dell’USL deriva dal denso tessuto connettivo collagenoso nella regione sacrale che passa alla muscolatura liscia strettamente imballata. A causa di questo gradiente compositivo, l’USL si intreccia con la muscolatura uterina e vaginale per fornire un supporto robusto agli organi pelvici ^6,7. Nella sospensione del legamento uterosacrale (USLS), le USL sono fissate alla volta vaginale a seguito di un’isterectomia, ripristinando la vagina e le strutture circostanti nella loro posizione anatomica nel compartimento addominale. Tuttavia, indipendentemente da una via transvaginale o laparoscopica, la procedura USLS è afflitta da un tasso di fallimento relativamente alto fino al 40% in alcuni studi ^8,9. Il tasso di recidiva dei fastidiosi sintomi del rigonfiamento vaginale a 5 anni dopo la riparazione per il prolasso del compartimento apicale, come gli USL, è stato di circa il 40% in un ampio studio multicentrico randomizzato controllato⁹. Nello stesso studio, il ritrattamento per prolasso ricorrente a 5 anni è stato di circa il 10%. Il meccanismo di questo alto tasso di fallimento non è stato studiato, ma il ripristino della vagina e delle strutture circostanti nella loro posizione anatomica richiede il posizionamento della sutura nella regione collagenosa densa dell’USL^10,11 piuttosto che nella regione della muscolatura liscia. Pertanto, l’alto tasso di fallimento potrebbe essere dovuto alla mancata corrispondenza meccanica e compositiva dell’interfaccia vagina-USL formata chirurgicamente rispetto alla completa integrazione osservata nell’attacco nativo cervicale-USL.

Anche l’impatto economico del trattamento di questi disturbi è notevole, con circa 300 milioni di dollari spesi ogni anno negli Stati Uniti per l’assistenza ambulatoriale¹² e oltre 1 miliardo di dollari spesi ogni anno in costi diretti per le procedure chirurgiche¹³. Nonostante le vaste risorse economiche dedicate al trattamento di queste condizioni, le complicanze derivanti da molti interventi chirurgici al prolasso rimangono scoraggianti. Ad esempio, le riparazioni di prolasso apicale a base di rete in polipropilene, come la sacrocolpopessi, offrono tassi di successo più elevati rispetto alle riparazioni di tessuti nativi¹⁴, ma al costo di potenziali complicazioni come l’esposizione alla rete o l’erosione. La FDA ha ricevuto quasi 3.000 reclami relativi a complicazioni della rete solo tra il 2008 e il 2010. Ciò è culminato in un ordine della FDA di interrompere la produzione e la vendita di tutti i prodotti a rete transvaginale per POP nell’aprile 2019¹⁵. Pertanto, vi è una forte necessità clinica di materiali diversi dal polipropilene e modelli con cui testarli, che possono aumentare le riparazioni del prolasso dei tessuti nativi e aumentare le percentuali di successo rispetto alle tecniche tradizionali con la sola sutura.

Dall’annuncio della FDA nel 2019, la maggior parte dei chirurghi pelvici ha smesso di usare la rete transvaginale per le riparazioni del prolasso, spingendo i ricercatori a cercare nuovi approcci di ingegneria tissutale per aumentare le riparazioni dei tessuti nativi^16,17,18 come con le cellule stromali mesenchimali (MSC)^9,20 . Con questo spostamento di attenzione, c’è un urgente bisogno di perfezionare i modelli animali che possono aiutare con lo sviluppo di nuovi materiali; La sfida in questo processo è bilanciare la rilevanza clinica con i costi. A tal fine, la scienza di base e i ricercatori clinici che studiano il prolasso degli organi pelvici hanno finora sfruttato diversi modelli animali, tra cui ratti, topi, conigli, pecore, suini e primati non umani¹⁹. Il processo di identificazione di un modello animale ottimale è impegnativo, poiché gli esseri umani sono bipedi, non hanno coda e hanno un processo di nascita traumatico rispetto ad altre specie di mammiferi²⁰. I suini²¹ sono stati utilizzati per simulare la sacrocolpopessi robotica, mentre le pecore sono state utilizzate per simulare le riparazioni del prolasso vaginale²². Questi modelli animali, sebbene clinicamente rilevanti, sono limitati in termini di fattibilità dai costi e dalla manutenzione. I primati non umani sono stati utilizzati per studiare la patogenesi del prolasso; Le scimmie scoiattolo in particolare sono una delle poche specie diverse dall’uomo che possono sviluppare prolasso spontaneo, rendendole uno dei modelli animali più rilevanti²⁰. I primati non umani sono stati utilizzati anche per studiare procedure chirurgiche ginecologiche come la sacrocolpopessi²³ e il trapianto uterino²⁴. Analogamente alle loro controparti ovine e suine, la limitazione principale dei primati non umani come modello animale di prolasso è il costo di manutenzione, cura e imbarco¹⁹.

Sebbene il bacino del roditore sia orientato orizzontalmente con un rapporto dimensioni del canale testa-nascita molto più piccolo rispetto agli esseri umani¹⁹, i ratti sono adatti per studi su piccoli animali di chirurgia USLS poiché hanno anatomia, cellularità, architettura istologica e composizione della matrice USL simili rispetto all’USL²⁵ umano. Inoltre, sono vantaggiosi in termini di manutenzione e imbarco. Nonostante questi attributi benefici, non ci sono rapporti pubblicati di un modello di ratto di riparazione USLS. Pertanto, l’obiettivo è quello di descrivere un protocollo per l’isterectomia e USLS nel ratto Lewis multipare. Questo protocollo sarà utile per i ricercatori che mirano a studiare la fisiopatologia e le componenti chirurgiche del POP utilizzando questo modello animale accessibile.

Figura 1: Prolasso degli organi pelvici . (A) Il normale orientamento degli organi nella cavità peritoneale e (B) la drammatica descenza degli organi quando si verifica il prolasso. Dopo l’isterectomia, la sospensione del legamento uterosacrale (C) ripristina la vagina e le strutture circostanti nella loro corretta posizione anatomica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Protocol

Seguire tutte le linee guida dell’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), ottenendo l’approvazione per tutte le procedure sugli animali prima di iniziare. I requisiti per la tecnica di chirurgia asettica possono essere trovati da The Guide26 e Animal Welfare Regulations27. Lo studio è stato approvato dal protocollo n. 4332-11-20 dell’Università della Virginia Institutional Animal Care and Use Committee. Ottenere allevatrici multipare (due cucciolate). I ratti dovrebbero essere alloggiati in un vivaio accreditato dall’American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care e forniti di cibo e acqua ad libitum. Gli animali in questo studio erano ratti Lewis ottenuti da Charles River e avevano un’età compresa tra 4 e 6 mesi per soddisfare il requisito di due cucciolate. Gli animali sono stati mantenuti su un ciclo luce-buio di 12 ore. 1. Riparazione del prolasso degli organi pelvici mediante sospensione del legamento uterosacrale Preparazione di attrezzature e aree chirurgiche per la chirurgia di animali viviPreparare l’area chirurgica in modo tale che la tavola chirurgica venga riscaldata a 37 °C utilizzando cuscinetti riscaldanti per acqua calda a ricircolo insieme a un tampone impermeabile sterile. Garantire la sterilità della tavola chirurgica e dell’area chirurgica utilizzando un disinfettante per superfici privo di candeggina seguito da una salvietta di etanolo al 70%. Utilizzare la sterilizzazione termica dell’autoclave per sterilizzare tutte le forniture sicure per autoclave, inclusi strumenti chirurgici, spugne chirurgiche (garze), tamponi di cotone e un drappeggio monouso. Ottenere guanti chirurgici sterili confezionati. Procurarsi tagliatrici elettriche, unguento oftalmico, salviette etanolo, tamponi di cotone e soluzione di iodio, insieme a lama di bisturi e punti di sutura sterili confezionati e posizionare al banco di lavoro. Preparazione animale per la chirurgia di animali viviPosizionare con cura l’animale in una camera per anestesia fornita con isoflurano al 2% e pesare l’animale dopo aver raggiunto il piano corretto di anestesia. La corretta anestesia è confermata quando l’animale non risponde a un pizzico del dito del piede. Posizionare l’animale sulla scheda chirurgica in posizione prona con il naso saldamente nel cono di anestesia fornito con isoflurano al 2%. Applicare un unguento oftalmico su ciascuno degli occhi degli animali. Somministrare analgesico oppioide e analgesico FANS per via sottocutanea (Tabella dei materiali). Porre l’animale in posizione supina, come mostrato nella Figura 2, e radere la pelliccia addominale dal processo xifoideo fino all’orifizio uretrale (8 cm x 4 cm). Sterilizzare l’addome con tre cariche di iodio e alcol per preparare il sito di incisione.NOTA: Se la rasatura provoca sanguinamento, raggiungere l’emostasi con pressione prima di preparare la pelle con iodio e tampone di preparazione dell’alcool. Mantenere lo iodio sulla pelle per 30 s. Se non è disponibile alcun assistente chirurgico, depositare forniture e strumenti sterili su un vassoio sterile per strumenti, inclusi tamponi di cotone sterili, drappeggi, spugne (garze), lama chirurgica, punti di sutura e marcatore chirurgico (opzionale). Se è disponibile un assistente chirurgico, questo passaggio può essere omesso e l’assistente può fornire gli strumenti sterili seguendo il passaggio 1.3.1. Isterectomia e sospensione del legamento uterosacrale (USLS)Indossare un camice chirurgico, copricapo, maschera e guanti sterili. Coprire l’animale con un campo sterile, lasciando esposto solo l’addome. Fai un’incisione di 7 cm lungo la linea alba da appena sotto il processo xifoideo alla linea inferiore del capezzolo usando una lama di bisturi. L’incisione dovrebbe terminare ~ 0,5-1,0 cm rostrale dall’orifizio uretrale. Quindi, fare un’incisione attraverso lo strato muscolare sottostante. Evitare il vaso sanguigno della parete addominale per prevenire il sanguinamento. Assemblare il divaricatore addominale e ispezionare la cavità addominale (Figura 3A). Usando una pinza per iride, localizzare delicatamente il corno uterino sinistro. L’utero è profondo all’interno dell’intestino, che è spesso la struttura incontrata per la prima volta entrando nella cavità peritoneale. È utile identificare prima l’ovaio (Figura 3B) e il cuscinetto adiposo ovarico associato. Sollevare delicatamente il corno uterino sinistro con una pinza o un morsetto per zanzare e iniziare l’isterectomia legando il corno sotto l’ovaio e l’ovidotto usando un morsetto per zanzare. Le ovaie sono strutture delicate e sono facilmente danneggiate o devascolarizzate. Fai attenzione quando elevi le corna uterine; Afferrare il corno a una distanza di sicurezza dall’ovaio per raggiungere questo obiettivo. Continuare l’isterectomia bloccando e tagliando la vascolarizzazione adiacente, il tessuto connettivo e il grasso dal corno uterino usando micro forbici. Bloccare il tessuto connettivo prima della rimozione per ridurre il sanguinamento. Posizionare i morsetti il più vicino possibile all’interfaccia uterina, fino alla giunzione uterocervicale (definita anche come biforcazione del corno). Morseggiare attraverso il corno uterino vicino al punto di biforcazione usando una pinza per zanzare (Figura 4A-C). Accisare il corno omolaterale appena cefalato al morsetto per evitare sanguinamento. Questo si trova tra la giunzione utero-cervicale (appena rostrale alla cervice) e il punto di legatura utero-tubarica. La volta vaginale rimarrà dopo l’isterectomia (Figura 4D).NOTA: A causa del piccolo calibro dei vasi di ratto, la legatura dei monconi uterini con un morsetto temporaneo era sufficiente per questo intervento chirurgico. Tuttavia, questa tecnica può essere modificata secondo necessità con la sigillatura dei peduncoli con elettrocauterizzazione o legatura di sutura. Ripetere i passaggi 1.3.3-1.3.6 sul corno uterino destro per eseguire un’isterectomia totale. Regolare il divaricatore addominale per esporre il bacino inferiore. Ispezionare la volta vaginale esposta e il pavimento pelvico supporta i tessuti legamentosi e connettivi, che possono essere visti attaccati alla vagina e alla cervice. Se possibile, identificare l’uretere bilateralmente, che è solo mediale alle ovaie. Identificare i legamenti uterosacrali28,29, mostrati in Figura 5A, che possono essere trovati attaccati alla cervice appena sotto i monconi rimanenti delle corna uterine (volta vaginale). Il legamento è tracciato in un orientamento cefalad-mediale verso l’osso sacro. Utilizzando una sutura di polidiaxanone 3-0 su un ago piccolo e affusolato, posizionare un punto attraverso il legamento uterosacrale sinistro. Posizionare il punto in alto sul legamento, vicino all’osso sacro. Tirare il punto per assicurarsi che abbia catturato il legamento uterosacrale: la struttura USL si inserisce nella cervice con l’origine che si immerge dietro il retto dove si attacca all’osso sacro. Ancora una volta, identificare l’uretere per assicurarsi che non sia stato incorporato o attorcigliato con il punto uterosacrale. Quindi, passare il punto di polidiaxanone sinistro attraverso l’aspetto sinistro della volta vaginale (Figura 5B), con cura di incorporare sia l’aspetto anteriore che quello posteriore del bracciale vaginale. Ripetere i passaggi per completare la procedura USLS sul lato destro. I punti multipli possono essere posizionati bilateralmente, se lo si desidera. Una volta che i punti uterosacrali sono posizionati bilateralmente, legare saldamente la sutura usando un nodo quadrato, come mostrato in Figura 5C, in modo tale che la volta vaginale sia elevata cefalo verso l’osso sacro; Questo completa la sospensione del legamento uterosacrale. Chiusura della ferita chirurgicaRiposizionare il contenuto addominale nella loro posizione anatomica all’interno della cavità peritoneale. Chiudere gli strati profondi della parete addominale (peritoneo, fascia, muscolo) con un modello di sutura continua da 4-0 a 6-0 poliglactina 910 o sutura polidiaxanone. Chiudere la pelle con un punto sottocuticolare (o interrotto) da 4-0 a 6-0 polidiaxanone o poliglactin 910. Somministrare antibiotici per via sottocutanea secondo necessità per la profilassi chirurgica delle infezioni del sito. Eseguire il monitoraggio post-chirurgico fino a quando l’animale non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la recumenza sternale. Non restituire l’animale all’alloggio sociale fino a quando non è completamente guarito. Figura 2: Preparazione animale per la chirurgia dal vivo. La rimozione della pelliccia dall’area circostante il sito di incisione è necessaria per una corretta tecnica asettica. L’area mostrata nei pannelli (A) e (B) sono linee guida. I ricercatori dovrebbero rimuovere abbastanza peli in modo tale che gli strumenti sterili non entrino in contatto con i capelli durante l’intervento chirurgico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 3: Conservazione delle ovaie. Le corna uterine non sono in genere visibili quando l’addome viene aperto per la prima volta, come mostrato in (A). Una volta che un corno è localizzato e seguito per trovare (B) l’ovaio e l’ovidotto dove si collegano al corno, la parte superiore del corno può essere bloccata e il corno separato per iniziare l’isterectomia. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 4: Rimozione delle corna uterine. L’isterectomia nel ratto coinvolge (A) entrambe le corna uterine (B) bloccate alla giunzione uterocervicale e (C) asportate. La volta vaginale di ogni corno rimane con il moncone cervicale / uterino (freccia) (D) che li collega. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 5: Sospensione del legamento uterosacrale. (A) Orientamento dei legamenti uterosacrali in relazione alle strutture della volta vaginale create. Quando si posizionano le suture per la riparazione della sospensione del legamento uterosacrale (USLS), (B) le suture catturano il legamento uterosacrale e quindi passano attraverso entrambi gli aspetti anteriore e posteriore del bracciale vaginale. (C) Assicurata al legamento uterosacrale, la volta vaginale è ora elevata cefalo verso l’osso sacro. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. 2. Prova di trazione uniassiale NOTA: il sistema di test e il software utilizzati sono stati utilizzati seguendo le linee guida del produttore per la calibrazione e il test. Tutti i test sono stati effettuati a 22 °C. Preparazione dei campioniEutanasia del ratto utilizzando una procedura farmacologica approvata dalla IACUC. Garantire la morte tramite un metodo fisico secondario. Qui è stata utilizzata l’inalazione di CO2 seguita da puntura cardiaca. Esporre la volta vaginale in preparazione per i test meccanici di trazione. Nel presente studio, eseguire test di trazione sui legamenti uterosacrali nativi (controllo), nonché su animali che avevano subito una sospensione del legamento uterosacrale come descritto sopra (POP). Legamenti di prova in situ 24 settimane dopo l’intervento chirurgico. Si suggerisce un timepoint terminale di almeno 8 settimane per consentire il completo riassorbimento delle suture.Dopo l’eutanasia umana, fai un’incisione lungo la linea alba per esporre l’addome. Inizia a sezionare il tessuto adiposo fino a quando la volta vaginale è visibile. Continuare a sezionare i cuscinetti di grasso addominale fino a quando gli USL intatti sono chiaramente visibili (animali di controllo, Figura 6A) o la giunzione tra il legamento uterosacrale e la volta vaginale è visibile (animali POP, Figura 6C). Prestare attenzione a non tirare la giunzione per rimuovere il tessuto adiposo, ma piuttosto utilizzare tagli accurati con micro-forbici per mantenere la coerenza tra i campioni. Utilizzando un righello flessibile, misurare la distanza tra l’inserzione uterosacrale (posteriore al retto) e la volta vaginale. Questo valore è la lunghezza originale del tessuto.NOTA: La lunghezza originale del tessuto, la lunghezza del calibro, per gli USL di controllo misurava 13,4 ± 0,5 mm mentre la lunghezza del calibro per la riparazione delle USL misurava 12,8 ± 0,4 mm. Infilare il nastro ombelicale dietro l’USL intatto (controllo, Figura 6B) o la giunzione USLS (POP, Figura 6D) in modo tale che il tessuto sia centrato sul nastro ombelicale. Misurare l’altezza e la larghezza del tessuto dove si interseca con il nastro ombelicale utilizzando calibri digitali. Questi valori verranno utilizzati per calcolare l’area della sezione trasversale. Fissare una piastra di compressione di grandi dimensioni (tabella dei materiali) tramite l’adattatore di base e posizionare l’animale in cima in modo che il campione sia centrato sotto il supporto dell’impugnatura. Prove di trazioneProgrammare il regime di prova di trazione nel software: pre-carico, pre-condizione, pull to failure. Ciò segue i precedenti protocolli di test meccanici del pavimento pelvico29 e del tessuto riproduttivo30 . Impostare lo strumento in preparazione delle prove di trazione. Per lo studio corrente, utilizzare una cella di carico da 10 N, un’impugnatura stampata in 3D e un adattatore di base per collegare una piastra di compressione come mostrato nella Figura 7.NOTA: Qualsiasi configurazione di base in grado di supportare l’intera dimensione dell’animale è accettabile. Utilizzare qualsiasi presa in grado di tenere saldamente il nastro ombelicale. In questo test è stato utilizzato un supporto personalizzato stampato in 3D e un’impugnatura da studi precedenti31,32. I file STL sono stati inclusi come file supplementari.Posizionare l’animale in modo tale che il campione sia centrato sotto l’impugnatura (Figura 8A). Immobilizzare la regione pelvica che circonda il campione fissando l’animale al piatto (Figura 8B). Abbassare la cella di carico in modo tale che le code del nastro ombelicale raggiungano facilmente la presa. Fissare il nastro ombelicale nell’impugnatura, lasciando il nastro allentato per evitare la manipolazione del campione. Aprire il test di precondizionamento nell’interfaccia del software ed etichettare il test con il nome del campione. Assicurarsi che il metodo di precondizionamento includa la fase di precarico. Fare clic per avviare il test di precondizionamento, che precaricherà il campione a 0,015 N. Una volta che la forza di precarico è stabile, la prova condizionerà il campione ad una velocità di allungamento di 0,1 mm/s per 30 s. Lasciare riposare il tessuto per 1 minuto. Durante l’attesa, caricare il regime di test pull-to-failure.NOTA: La forza di precarico può variare a seconda delle limitazioni dello strumento e delle condizioni di prova. Fare riferimento a studi precedenti in cui il precarico riportato varia da 0,015 N a 0,1 N 29,33,34,35,36. Aprire il regime di test programmato per eseguire il pull in caso di errore. Etichettare il test con il nome del campione e fare clic su OK per passare alla finestra successiva. Immettere la lunghezza del misuratore del campione e quindi fare clic su Avanti per passare alla pagina di test. Bilancia tutto e fai clic su Start. Lasciare che il test venga eseguito ad una velocità di allungamento di 0,1 mm/s fino a quando il tessuto non è stato tirato al cedimento. Il test produrrà dati di spostamento del carico. Calcolo di sollecitazioni, deformazioni e moduli per prove di trazioneUtilizzando i dati di spostamento del carico, l’area della sezione trasversale e la lunghezza del manometro del campione, calcolare la sollecitazione (MPa) e la deformazione (%) come precedentemente riportato 37,38,39,40,41. Utilizzare l’equazione 1 e l’equazione 2 mostrate di seguito. Si noti che anche lo stiramento del nastro durante il test deve essere tenuto in considerazione in questi calcoli. Equazione 1 Equazione 2Dalla curva carico-spostamento (Figura 9A,D), calcolare la rigidità (pendenza lineare, N/mm) e il carico finale. Dalla curva di deformazione delle sollecitazioni, calcolare il modulo tangente (pendenza lineare, MPa) e la sollecitazione finale. La regione lineare della curva di deformazione sotto sforzo è indicata nella Figura 9B,E con il modulo tangente calcolato da questa regione mostrato nella Figura 9C,F per entrambi i gruppi sperimentali.NOTA: sia per la rigidezza che per il modulo tangente, identificare la porzione lineare scegliendo una finestra di punti che massimizzi il valore di R2 per una regressione lineare37,41. Figura 6: Preparazione del campione per la prova di trazione uniassiale. (A) Gli USL di controllo esposti prima (B) il nastro ombelicale è infilato dietro il tessuto. (C) Giunzione della volta vaginale USL dopo la completa dissoluzione delle suture con (B) il nastro ombelicale infilato dietro il tessuto in preparazione della prova di trazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 7: Il sistema di prova meccanica. (A) Il sistema di prova in modalità prova di trazione utilizzato con (B) supporto stampato in 3D e (C) impugnatura del campione stampata in 3D completa di una striscia testurizzata per migliorare la presa. Configurazione dei pezzi mostrati nel pannello (D). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 8: Messa a punto della prova di trazione . (A) Il provino è centrato sotto l’impugnatura e il supporto. (B) L’animale e il tessuto che circondano il campione siano mantenuti fermi prima dell’inizio della prova di trazione. Come mostrato dall’immagine inserita, fissare il tessuto circostante è essenziale per isolare il tessuto di interesse. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 9: Esempio di output e analisi dei dati delle prove di trazione. (A) La curva carico-spostamento per un campione di controllo seguita da (B) l’analisi della deformazione delle sollecitazioni e (C) la pendenza dell’equazione di adattamento della curva di linea che mostra il modulo tangente in MPa. (D-F) mostra lo stesso processo per un campione USLS. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Representative Results

Fattibilità chirurgica e posizionamento della sutura uterosacraleNon ci sono state complicanze intraoperatorie correlate all’isterectomia o alla sospensione del legamento uterosacrale in nessuno degli animali. C’era un sanguinamento minimo durante la rimozione delle corna uterine, a condizione che la vascolarizzazione adiacente fosse bloccata prima della rimozione. Il sanguinamento limitato ha permesso una buona visualizzazione dei legamenti uterosacrali per il posizionamento della sutura e ha impedito lesioni intraoperatorie intestinali, del retto, ureterali o della vescica. Dopo il posizionamento delle suture, la nuova giunzione USL-volta vaginale ha impedito il movimento del moncone cervicale/uterino come mostrato in Figura 5C. Durante i primi tre giorni postoperatori, gli animali sono stati controllati quotidianamente e poi bisettimanalmente fino alla fine dell’esperimento. Con gli analgesici oppioidi e FANS a rilascio prolungato somministrati al momento dell’intervento chirurgico, ulteriori analgesici sono risultati non necessari. Sulla base della nostra esperienza con 16 interventi chirurgici sugli animali (n = 8 sia per i gruppi di controllo che per quelli USLS), ci si dovrebbe aspettare un calo di peso nella prima settimana dopo l’intervento chirurgico con una perdita media del 5,7 ± dell’1,4% dal peso del giorno dell’intervento. Come previsto, i ratti hanno lentamente guadagnato peso nelle successive 23 settimane, con un aumento di peso medio del 15,1 ± del 4,5% nel corso dell’esperimento. Collaudo meccanico della riparazione USLSPer dimostrare la funzionalità della riparazione USLS, è stato eseguito un test di trazione uniassiale. Dopo l’eutanasia dell’animale nel momento post-operatorio scelto, 24 settimane in questo studio, l’area chirurgica deve essere attentamente sezionata per visualizzare la giunzione USL-volta vaginale come mostrato in Figura 6A. Rispetto ad altre metodologie per testare le USL del ratto insieme ad altre strutture di supporto e organi pelvici29,42, il metodo qui descritto è il primo a testare l’USL del ratto in modo isolato. Il nastro ombelicale utilizzato in questo studio è stato scelto strategicamente per la sua flessibilità in quanto la conformità del nastro ha consentito una minima interruzione del tessuto durante la preparazione dei test di trazione. I dati di spostamento del carico, quindi, devono essere regolati per tenere conto della piccola quantità di allungamento apportato dal nastro ombelicale. La Figura 9 fornisce un esempio di dati ottenuti tramite prove di trazione e la Figura 9A fornisce un esempio di un tipico grafico sforzo-deformazione. Si raccomanda la segnalazione dei dati di tensione-deformazione in quanto queste informazioni sono normalizzate e indipendenti dalle dimensioni dei campioni34 e possono essere meglio confrontate tra gli studi. Per il legamento uterosacrale intatto, riportiamo proprietà strutturali come carico finale (2,9 ± 0,5 N) e rigidità (0,4 ± 0,1 N/mm), nonché proprietà normalizzate del materiale come sollecitazione finale (2,1 ± 0,4 MPa), deformazione finale (1,6 ± 0,5) e modulo tangente (4,0 ± 1,1 MPa). Nei test uniassiali eseguiti sugli organi riproduttivi del ratto e su tutte le loro connessioni tissutali di supporto da Moalli et al., hanno riportato un carico finale al fallimento (13,2 ± 1,1 N) e rigidità (2,9 ± 0,9 N / mm) superiore all’USL29 isolato. Il lavoro svolto da Moalli et al. e da altra letteratura34,35 menziona l’elevata variabilità tra i campioni testati, come mostrato nei dati qui presentati. Per la riparazione della sospensione del legamento uterosacrale, abbiamo trovato tutte le proprietà strutturali del materiale (rigidità, 0,33 ± 0,13 N/mm; carico finale, 2,6 ± 1,3 N) e le proprietà normalizzate del materiale (sollecitazione finale, 1,8 ± 0,7 MPa; sforzo finale 1,3 ± 0,3; modulo tangente, 3,0 ± 0,9 MPa) inferiori a quelle dell’USL nativo.

Discussion

Il protocollo è notevole per diversi vantaggi. Per quanto ne sappiamo, è la prima descrizione pubblicata di USLS nel modello di ratto e fornirà ai futuri ricercatori passaggi riproducibili per eseguire questa procedura nel contesto della ricerca. In secondo luogo, includiamo un nuovo protocollo per i test di trazione dell’interfaccia nativa e chirurgica dell’USL. Il protocollo di test di trazione potrebbe essere utilizzato in studi simili che studiano nuovi approcci di ingegneria tissutale per aumentare le riparazioni dei tessuti nativi come USLS. Inoltre, il modello di ratto stesso è utile per lo studio dei disturbi del pavimento pelvico a causa della facilità di movimentazione / imbarco, della breve durata della vita e dell’efficienza dei costi rispetto ai modelli animali più grandi. I limiti del protocollo includono l’incapacità di valutare una delle principali complicanze dell’USLS, il kinking ureterale. Nonostante questo, non abbiamo avuto casi di presunta lesione ureterale in questo studio. Un’altra considerazione è che l’orientamento orizzontale del bacino, il piccolo rapporto testa-canale fetale e la mancanza di prolasso spontaneo nel modello di ratto limitano una certa applicabilità dei risultati agli esseri umani. Tuttavia, l’uso di ratti multipare è un punto di forza di questo studio poiché rappresenta il principale fattore di rischio nello sviluppo di POP³.

L’istituzione di un protocollo di successo per l’isterectomia e l’USLS nel ratto Lewis sarà uno strumento utile per i futuri ricercatori che studiano i componenti chirurgici del POP, riducendo al minimo la variabilità nel testare il comportamento meccanico dell’USL. I modelli animali chirurgici sono utili in quanto consentono ai ricercatori di progettare esperimenti clinicamente rilevanti che controllano la parità, la massa corporea, la malattia e la nutrizione³⁴, mitigando al contempo il rischio etico dello studio iniziale negli esseri umani. Inoltre, i modelli standardizzati per POP consentono ai ricercatori di aggirare i limiti della raccolta di tessuti umani. In particolare, i metodi di prova di trazione descritti in questo protocollo consentiranno la coerenza tra gli studi. I precedenti modelli di roditori hanno testato le proprietà meccaniche dell’intera regione pelvica, che comprende la cervice, la vagina e i legamenti di supporto pelvico multipli^29,42. I metodi qui descritti consentono la misurazione dell’USL in modo da mantenere gli attaccamenti spinali e cervicali nativi. Va notato che i metodi di prova di trazione non valutano solo l’USL, ma piuttosto l’USL in combinazione con la sua inserzione nel sacro e nella cervice. Questo è un punto di forza dello studio in quanto riflette le solite forze in situ a cui è sottoposto il legamento. Riconosciamo che il comportamento meccanico del legamento isolato sarebbe diverso se fosse testato ex vivo senza i suoi attacchi nativi. Ciò è particolarmente vero in quanto le strutture dei ratti sono piccole e limitano la fattibilità della raccolta di un campione adatto per i test ex vivo. Le USL sperimentano il caricamento in più direzioni in situ, quindi la natura uniassiale del test è una limitazione, ma l’uso di questo metodo consente confronti significativi tra studi precedenti sulla meccanica USL del ratto^29,42. Sebbene attualmente non esista un protocollo di test meccanico standard ampiamente accettato, questo modello sarà uno strumento utile per futuri studi di ingegneria tissutale sul campo.

Diversi passaggi descritti in questo protocollo sono fondamentali per la salute e il benessere degli animali, nonché per la riproducibilità della chirurgia USLS e dei successivi test di trazione. In primo luogo, è essenziale ottenere sia i farmaci analgesici che quelli antinfiammatori descritti come analgesici da soli sono risultati inadeguati per la gestione del dolore. L’antibiotico profilattico riduce il rischio di infezione del sito chirurgico ed è lo standard di cura nella chirurgia umana. Per quanto riguarda la procedura chirurgica USLS, evitare danni alle ovaie e ridurre al minimo la perdita di sangue sono essenziali per un intervento chirurgico di successo. I passaggi 1.3.3 e 1.3.4 descrivono la separazione della parte superiore del corno uterino dall’ovaio adiacente; Bisogna fare attenzione a mantenere questa dissezione sul lato del corno uterino per prevenire la rottura dei vasi delicati intorno all’ovaio, che può causare un eccessivo sanguinamento. Da notare, altri ricercatori hanno dimostrato che la funzione ovarica è preservata dopo la rimozione delle corna uterine⁴³. Inoltre, se le ovaie vengono interrotte o rimosse, l’architettura complessiva della fibrilla di collagene sarà disturbata, alterando le proprietà meccaniche dei suoi tessuti^44,45. Una volta che il corno uterino è separato in modo sicuro dall’ovaio, c’è un chiaro piano di dissezione che consente l’isolamento del corno uterino dai cuscinetti adiposi circostanti e dal sistema vascolare. Nonostante il chiaro piano di dissezione, i peduncoli lungo il corno uterino devono essere fissati con un morsetto prima della transezione con micro forbici. Contrariamente alla pratica chirurgica nell’uomo, abbiamo scoperto che la legatura della sutura dei peduncoli dell’isterectomia non è necessaria, poiché il bloccaggio del peduncolo prima della transezione garantisce un’emostasi adeguata. Il passo 1.3.6 del protocollo descrive questo attento processo per ridurre al minimo la perdita di sangue. Durante l’esecuzione dell’isterectomia, è necessario prestare molta attenzione per identificare gli ureteri come menzionato nei passaggi 1.3.6 e 1.3.8. Comprendere la vicinanza anatomica dell’uretere è fondamentale, poiché una delle complicanze più comuni associate alle USL nell’uomo è la lesione ureterale⁴⁶.

In conclusione, presentiamo un nuovo protocollo per l’esecuzione di isterectomia, sospensione del legamento uterosacrale e test di trazione dell’USL in un modello di ratto. Prevediamo che i nostri risultati aiuteranno i futuri ricercatori scientifici di base fornendo una descrizione chiara e riproducibile di queste procedure e quindi consentiranno il progresso della ricerca sul prolasso degli organi pelvici.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo la Prof.ssa Silvia Blemker per l’uso del suo Instron e il Prof. George Christ per l’uso del suo spazio chirurgico, nonché il supporto e l’impugnatura stampati in 3D. Questo lavoro è stato supportato dalla UVA-Coulter Translational Research Partnership e dal DoD (W81XWH-19-1-0157).

Materials

Alcohol prep pad	BD	326895
Artificial Tear Ointment	American Health Service Sales Corp	PH-PARALUBE-O
Bluehill software	Instron	Bluehill 3
Cavicide 1 disinfectant	Fisher Scientific	22 998 800
Compression platean	Instron	2501-163
Cotton swabs	Puritan Medical	806-WC
Gauze Sponge, 8-Ply	VWR	95038-728
Mosquito Forceps	Medline Industries	MMDS1222115
Needle Holder	Medline Industries	DYND04045
Operating Scissors, 5½", Sharp	American Health Service Sales Corp	4-222
Opioid Analgesic (Buprenorphine XR)	Fidelis Animal Health	Ethiqa XR	0.65 mg/kg SC Q72
NSAID Analgesic (Meloxicam SR)	Wildlife Pharmaceuticals, LLC	Meloxicam SR	1 mg/kg SC q72
PDS II, 3-0 Polydioxanone Suture, SH-1	Ethicon	Z316H
PDS II, 5-0 P olydioxanone Suture, RB-1	Ethicon	Z303H
Retractor	Medline Industries	MDS1862107
Scalpel Blade Stainless Surgical #10	Miltex	4-310
Scalpel Handle	Medline Industries	MDS15210
Scissor, Micro, Curved, 4.5"	Westcott	MDS0910311
Single Column Universal Testing System	Instron	5943 S3873	1 kN force capacity, 10 N load cell
Sterile Natural Rubber Latex Gloves	Accutech	91225075
Suture,Vicryl,6-0,P-3	Ethicon	J492G
Tape,Umbilical,Cotton,1/8X18"	Ethicon	U10T
Tension and Compression Load Cell	Instron	2530-10N	10N load cell (1 kgf, 2 lbf)
Veterinary surgical adhesive (skin glue)	Covetrus	31477

References

Olsen, A. L., et al. Epidemiology of surgically managed pelvic organ prolapse and urinary incontinence. Obstetrics and Gynecology. 89 (4), 501-506 (1997).
Wu, J. M., et al. Lifetime risk of stress urinary incontinence or pelvic organ prolapse surgery. Obstetrics and Gynecology. 123 (6), 1201-1206 (2014).
Kenton, K., Mueller, E. R. The global burden of female pelvic floor disorders. BJU International. 98, 1-7 (2006).
Herschorn, S. Female pelvic floor anatomy The pelvic floor, supporting structures, and pelvic organs. Reviews in Urology. 6, 2-10 (2004).
Jelovsek, J. E., Maher, C., Barber, M. D. Pelvic organ prolapse. The Lancet. 369 (9566), 1027-1038 (2007).
Campbell, R. M. The anatomy and histology of the sacrouterine ligaments. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 59 (1), 1-12 (1950).
Reisenauer, C., et al. The role of smooth muscle in the pathogenesis of pelvic organ prolapse – An immunohistochemical and morphometric analysis of the cervical third of the uterosacral ligament. International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 19 (3), 383-389 (2008).
Lavelle, R. S., Christie, A. L., Alhalabi, F., Zimmern, P. E. Risk of prolapse recurrence after native tissue anterior vaginal suspension procedure with intermediate to long-term followup. Journal of Urology. 195 (4), 1014-1020 (2016).
Jelovsek, J. E., et al. Effect of uterosacral ligament suspension vs sacrospinous ligament fixation with or without perioperative behavioral therapy for pelvic organ vaginal prolapse on surgical outcomes and prolapse symptoms at 5 years in the OPTIMAL randomized clinical trial. JAMA – Journal of the American Medical Association. 319 (15), 1554-1565 (2018).
Bradley, M. S., et al. Vaginal uterosacral ligament suspension: A retrospective cohort of absorbable and permanent suture groups. Female Pelvic Medicine & Reconstructive Surgery. 24 (3), 207-212 (2018).
Cola, A., et al. Native-tissue prolapse repair: Efficacy and adverse effects of uterosacral ligaments suspension at 10-year follow up. International Journal of Gynecology and Obstetrics. , (2022).
Sung, V. W., Washington, B., Raker, C. A. Costs of ambulatory care related to female pelvic floor disorders in the United States. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 202 (5), 1-4 (2010).
Subak, L. L., et al. Cost of pelvic organ prolapse surgery in the United States. Obstetrics and Gynecology. 98 (4), 646-651 (2001).
Siddiqui, N. Y., et al. Mesh sacrocolpopexy compared with native tissue vaginal repair: A systematic review and meta-analysis. Obstetrics & Gynecology. 125 (1), 44-55 (2015).
FDA takes action to protect women’s health, orders manufacturers of surgical mesh intended for transvaginal repair of pelvic organ prolapse to stop selling all devices. FDA News Release Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-takes-action-protect-womens-health-orders-manufacturers-surgical-mesh-intended-transvaginal (2019)
Brincat, C. A. Pelvic organ prolapse reconsidering treatment, innovation, and failure. JAMA – Journal of the American Medical Association. 322 (11), 1047-1048 (2019).
Cundiff, G. W. Surgical innovation and the US Food and Drug Administration. Female Pelvic Medicine & Reconstructive Surgery. 25 (4), 263-264 (2019).
Luchristt, D., Weidner, A. C., Siddiqui, N. Y. Urinary basement membrane graft-augmented sacrospinous ligament suspension: a description of technique and short-term outcomes. International Urogynecology Journal. 33 (5), 1347-1350 (2022).
Couri, B. M., et al. Animal models of female pelvic organ prolapse: Lessons learned. Expert Review of Obstetrics and Gynecology. 7 (3), 249-260 (2012).
Mori da Cunha, M. G. M. C., et al. Animal models for pelvic organ prolapse: systematic review. International Urogynecology Journal. 32 (6), 1331-1344 (2021).
Kasabwala, K., Goueli, R., Culligan, P. J. A live porcine model for robotic sacrocolpopexy training. International Urogynecology Journal. 30 (8), 1371-1375 (2019).
Mansoor, A., et al. Development of an ovine model for training in vaginal surgery for pelvic organ prolapse. International Urogynecology Journal. 28 (10), 1595-1597 (2017).
Liang, R., et al. Impact of prolapse meshes on the metabolism of vaginal extracellular matrix in rhesus macaque. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 212 (2), 1-7 (2015).
Johannesson, L., et al. Preclinical report on allogeneic uterus transplantation in non-human primates. Human Reproduction. 28 (1), 189-198 (2013).
Iwanaga, R., et al. Comparative histology of mouse, rat, and human pelvic ligaments. International Urogynecology Journal. 27 (11), 1697-1704 (2016).
National Research Council. . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition. , (2011).
Federal Animal Welfare Regulations. National Archives Available from: https://www.ecfr.gov/current/title-9/chapter-l/subchapter-A/part-2/subpart-C/section-2.31 (2022)
Ma, Y., et al. Knockdown of Hoxa11 in vivo in the uterosacral ligament and uterus of mice results in altered collagen and matrix metalloproteinase activity. Biology of Reproduction. 86 (4), 100 (2012).
Moalli, P. A., et al. A rat model to study the structural properties of the vagina and its supportive tissues. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 192 (1), 80-88 (2005).
Yoshida, K., et al. Mechanics of cervical remodelling: Insights from rodent models of pregnancy. Interface Focus. 9 (5), 20190026 (2019).
Christ, G. J., Sharma, P., Hess, W., Bour, R. . Modular biofabrication platform for diverse tissue engineering applications and related method thereof. , (2020).
Smith, K., Christ, G. J. . Incorporation of in vitro double seeding for enhanced development of tissue engineered skeletal muscle implants. , (2019).
Becker, W. R., De Vita, R. Biaxial mechanical properties of swine uterosacral and cardinal ligaments. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 14 (3), 549-560 (2015).
Donaldson, K., Huntington, A., De Vita, R. Mechanics of uterosacral ligaments: Current knowledge, existing gaps, and future directions. Annals of Biomedical Engineering. 49 (8), 1788-1804 (2021).
Baah-Dwomoh, A., McGuire, J., Tan, T., De Vita, R. Mechanical properties of female reproductive organs and supporting connective tissues: A review of the current state of knowledge. Applied Mechanics Reviews. 68 (6), 1-12 (2016).
Tan, T., Cholewa, N. M., Case, S. W., De Vita, R. Micro-structural and biaxial creep properties of the swine uterosacral-cardinal ligament complex. Annals of Biomedical Engineering. 44 (11), 3225-3237 (2016).
Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham, A. C., Thomopoulos, S. Biomechanical testing of murine tendons. Journal of Visualized Experiments. (152), e60280 (2019).
Griffin, M., et al. Biomechanical characterization of human soft tissues using indentation and tensile testing. Journal of Visualized Experiments. (118), e54872 (2016).
Feola, A., et al. Parity negatively impacts vaginal mechanical properties and collagen structure in rhesus macaques. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 203 (6), 1-8 (2010).
Tan, T., et al. Histo-mechanical properties of the swine cardinal and uterosacral ligaments. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 42, 129-137 (2015).
Abramowitch, S. D., Feola, A., Jallah, Z., Moalli, P. A. Tissue mechanics, animal models, and pelvic organ prolapse: A review. European Journal of Obstetrics and Gynecology and Reproductive Biology. 144, 146-158 (2009).
Lowder, J. L., et al. Adaptations of the rat vagina in pregnancy to accommodate delivery. Obstetrics and Gynecology. 109 (1), 128-135 (2007).
Koebele, S. V., et al. Hysterectomy uniquely impacts spatial memory in a rat model: A role for the nonpregnant uterus in cognitive processes. Endocrinology. 160 (1), 1-19 (2019).
Kafantari, H., et al. Structural alterations in rat skin and bone collagen fibrils induced by ovariectomy. Bone. 26 (4), 349-353 (2000).
Daghma, D. E. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers in bone matrix indicates bone quality in ovariectomized rat spine. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 36 (3), 297-306 (2018).
Manodoro, S., Frigerio, M., Milani, R., Spelzini, F. Tips and tricks for uterosacral ligament suspension: how to avoid ureteral injury. International Urogynecology Journal. 29 (1), 161-163 (2018).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Miller, B. J., Jones, B. K., Turner, J. S., Caliari, S. R., Vaughan, M. H. Development of a Uterosacral Ligament Suspension Rat Model. J. Vis. Exp. (186), e64311, doi:10.3791/64311 (2022).

Automatically Generated