Isolamento Fecal Murino e Transplante de Microbiota
Summary
O objetivo aqui é delinear um protocolo para investigar os mecanismos de disbiose na doença cardiovascular. Este artigo discute como coletar e transplantar amostras fecais murinas assepticamente, isolar intestinos e usar o método “Swiss-roll”, seguido por técnicas de imunomarcação para interrogar alterações no trato gastrointestinal.
Abstract
A disbiose da microbiota intestinal desempenha um papel na fisiopatologia de distúrbios cardiovasculares e metabólicos, mas os mecanismos não são bem compreendidos. O transplante de microbiota fecal (FMT) é uma abordagem valiosa para delinear um papel direto da microbiota total ou de espécies isoladas na fisiopatologia da doença. É uma opção de tratamento segura para pacientes com infecção recorrente por Clostridium difficile . Estudos pré-clínicos demonstram que a manipulação da microbiota intestinal é uma ferramenta útil para estudar a ligação mecanicista entre disbiose e doença. O transplante de microbiota fecal pode ajudar a elucidar novas terapêuticas direcionadas à microbiota intestinal para o manejo e tratamento de doenças cardiometabólicas. Apesar de uma alta taxa de sucesso em roedores, ainda existem alterações translacionais associadas ao transplante. O objetivo aqui é fornecer orientação no estudo dos efeitos do microbioma intestinal em doenças cardiovasculares experimentais. Neste estudo, um protocolo detalhado para coleta, manuseio, processamento e transplante da microbiota fecal em estudos murinos é descrito. As etapas de coleta e processamento são descritas para doadores humanos e roedores. Finalmente, descrevemos o uso de uma combinação das técnicas de rolagem suíça e imunomarcação para avaliar alterações de morfologia e integridade específicas do intestino em doenças cardiovasculares e mecanismos relacionados da microbiota intestinal.
Introduction
Os distúrbios cardiometabólicos, incluindo doenças cardíacas e acidentes vasculares cerebrais, são as principais causas globais de morte1. Inatividade física, má nutrição, avanço da idade e genética modulam a fisiopatologia desses distúrbios. Evidências acumuladas apoiam o conceito de que a microbiota intestinal afeta distúrbios cardiovasculares e metabólicos,incluindo diabetes tipo 2 2, obesidade3 e hipertensão4, o que pode ser uma chave para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para essas doenças.
Os mecanismos exatos pelos quais a microbiota causa doenças ainda são desconhecidos, e os estudos atuais são altamente variáveis, em parte devido a diferenças metodológicas. O transplante de microbiota fecal (FMT) é uma abordagem valiosa para delinear um papel direto da microbiota total ou de espécies isoladas na fisiopatologia da doença. FMT é amplamente utilizado em estudos com animais para induzir ou suprimir um fenótipo. Por exemplo, a ingestão calórica e o metabolismo da glicose podem ser modulados pela transferência de matéria fecal de um doador doente para um receptor saudável 5,6. Em humanos, o FMT tem se mostrado uma opção segura de tratamento para pacientes com infecção recorrente por Clostridium difficile 7. Evidências que apoiam seu uso no manejo de doenças cardiovasculares estão surgindo; por exemplo, o FMT de pacientes magros a com síndrome metabólica melhora a sensibilidade à insulina8. A disbiose intestinal também está associada à hipertensão arterial em estudos com humanos e roedores 9,10,11. FMT de camundongos alimentados com dieta rica em sal em camundongos livres de germes predispõe os receptores à inflamação e hipertensão12.
Apesar da alta taxa de sucesso de FMT em roedores, os desafios translacionais permanecem. Ensaios clínicos utilizando o FMT no tratamento da obesidade e da síndrome metabólica indicam efeitos mínimos ou nulos sobre esses distúrbios13,14,15. Assim, mais estudos são necessários para identificar vias terapêuticas adicionais visando a microbiota intestinal para o tratamento de distúrbios cardiometabólicos. A maioria das evidências disponíveis sobre a microbiota intestinal e doenças cardiovasculares é associativa. O protocolo descrito discute como utilizar uma combinação de FMT e a técnica de rolamento suíço para mostrar uma associação entre doença e microbiota intestinal e avaliar diretamente a integridade de todas as partes do intestino intestinal16,17,18.
O objetivo geral deste método é fornecer orientação para o estudo dos efeitos do microbioma intestinal na doença cardiovascular experimental. Este protocolo fornece mais detalhes e considerações importantes no planejamento experimental para promover a tradução fisiológica e aumentar o rigor e a reprodutibilidade dos achados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uma abordagem valiosa para estudar o papel causal da microbiota intestinal em doenças cardiovasculares e metabólicas é transferir a microbiota total ou selecionar espécies de interesse para camundongos livres de germes. Aqui, descrevemos protocolos para coletar amostras fecais de humanos e camundongos convencionalmente alojados em camundongos livres de germes para estudar o papel da microbiota intestinal em doenças hipertensivas.
Em camundongos, usamos conteúdo cecal coletado assepticame…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado por Vanderbilt Clinical and Translational Science Award Grant UL1TR002243 (para A.K.) do National Center for Advancing Translational Sciences; American Heart Association Grant POST903428 (para J.A.I.); e National Heart, Lung, and Blood Institute Grants K01HL13049, R03HL155041, R01HL144941 (para A.K.) e NIH grant 1P01HL116263 (para V.K.). A Figura 1 foi criada usando Biorender.
Materials
| Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost | ThermoFisher | B40932 | |
| Anaerobic chamber | COY | 7150220 | |
| Apolipoprotein AI | Novus Biologicals | NBP2-52979 | |
| Artery Scissors – Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Bleach solution | Fisher Scientific | 14-412-53 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | B14 | |
| CD3 antibody | ThermoFisher | 14-0032-82 | |
| CD68 monoclonal antibody | ThermoFisher | 14-0681-82 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-221 | |
| CODA high throughput monitor | Kent Scientic Corporation | CODA-HT8 | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Disposable graduate transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119AM | |
| Disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-2A | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AA33361M1 | |
| Feeding Needle | Fine Science Tools | 18061-38 | |
| Filter (30 µm) | Fisher Scientific | NC0922459 | |
| Filter paper sheet | Fisher Scientific | 09-802 | |
| Formalin (10%) | Fisher Scientific | 23-730-581 | |
| High salt diet | Teklad | TD.03142 | |
| OMNIgene.GUT | DNAgenotek | OM-200+ACP102 | |
| Osmotic mini-pumps | Alzet | MODEL 2002 | |
| PAP Pen | Millipore Sigma | Z377821-1EA | |
| Petri dish | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 21-236-18C | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| Serile Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | AAJ61196AP | |
| Smart spatula | Fisher Scientific | NC0133733 | |
| Stool collection device | Fisher Scientific | 50-203-7255 | |
| TBS Buffer | Fisher Scientific | R017R.0000 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | 9036-19-5 |
|
| Varimix platform rocker | Fisher Scientific | 09047113Q | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-41 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 1330-20-7, 100-41-4 |
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