Выделение фекалий мышей и трансплантация микробиоты
Summary
Цель здесь состоит в том, чтобы наметить протокол для исследования механизмов дисбактериоза при сердечно-сосудистых заболеваниях. В этой статье обсуждается, как асептически собирать и пересаживать образцы фекалий мышей, изолировать кишечник и использовать метод «швейцарского рулета» с последующим иммуноокрашиванием для опроса изменений в желудочно-кишечном тракте.
Abstract
Дисбиоз кишечной микробиоты играет роль в патофизиологии сердечно-сосудистых и метаболических нарушений, но механизмы недостаточно изучены. Трансплантация фекальной микробиоты (ТФМ) является ценным подходом к определению прямой роли всей микробиоты или изолированных видов в патофизиологии заболевания. Это безопасный вариант лечения для пациентов с рецидивирующей инфекцией Clostridium difficile . Доклинические исследования показывают, что манипулирование микробиотой кишечника является полезным инструментом для изучения механистической связи между дисбактериозом и заболеванием. Трансплантация фекальной микробиоты может помочь в разработке новых терапевтических средств, нацеленных на микробиоту кишечника, для ведения и лечения кардиометаболических заболеваний. Несмотря на высокий уровень успеха у грызунов, остаются трансляционные изменения, связанные с трансплантацией. Цель здесь состоит в том, чтобы дать рекомендации по изучению влияния микробиома кишечника на экспериментальные сердечно-сосудистые заболевания. В этом исследовании описан подробный протокол сбора, обработки, обработки и трансплантации фекальной микробиоты в исследованиях на мышах. Этапы сбора и обработки описаны как для доноров, так и для доноров грызунов. Наконец, мы описываем использование комбинации методов швейцарского прокатки и иммуноокрашивания для оценки специфических для кишечника изменений морфологии и целостности сердечно-сосудистых заболеваний и связанных с ними механизмов микробиоты кишечника.
Introduction
Кардиометаболические нарушения, включая болезни сердца и инсульт, являются основными глобальными причинами смерти1. Отсутствие физической активности, плохое питание, преклонный возраст и генетика модулируют патофизиологию этих расстройств. Накопленные данные подтверждают концепцию, согласно которой микробиота кишечника влияет на сердечно-сосудистые и метаболические нарушения, включая диабет2 типа, ожирение3 игипертонию 4, что может стать ключом к разработке новых терапевтических подходов к этим заболеваниям.
Точные механизмы, с помощью которых микробиота вызывает заболевания, до сих пор неизвестны, и текущие исследования сильно варьируются, отчасти из-за методологических различий. Трансплантация фекальной микробиоты (ТФМ) является ценным подходом к определению прямой роли всей микробиоты или изолированных видов в патофизиологии заболевания. ТФМ широко используется в исследованиях на животных для индуцирования или подавления фенотипа. Например, потребление калорий и метаболизм глюкозы могут быть модулированы путем переноса фекалий от больного донора к здоровому реципиенту 5,6. Было показано, что у людей ТФМ является безопасным вариантом лечения пациентов с рецидивирующей инфекцией Clostridium difficile 7. Появляются доказательства, подтверждающие его использование в лечении сердечно-сосудистых заболеваний; например, ТФМ у пациентов с постным и метаболическим синдромом улучшает чувствительность к инсулину8. Дисбактериоз кишечника также связан с высоким кровяным давлением как в исследованиях на людях, так и на грызунах 9,10,11. ТФМ от мышей, получавших диету с высоким содержанием соли, у безмикробных мышей предрасполагает реципиентов к воспалению и гипертонии12.
Несмотря на высокий уровень успешности ТФМ у грызунов, проблемы с трансляцией остаются. Клинические испытания с использованием ТФМ для лечения ожирения и метаболического синдрома указывают на минимальное влияние на эти расстройства или их отсутствие13,14,15. Таким образом, необходимы дополнительные исследования для выявления дополнительных терапевтических направлений, нацеленных на микробиоту кишечника для лечения кардиометаболических нарушений. Большинство имеющихся данных о микробиоте кишечника и сердечно-сосудистых заболеваниях являются ассоциативными. В описанном протоколе обсуждается, как использовать комбинацию ТФМ и швейцарского метода прокатки, чтобы показать связь между заболеванием и микробиотой кишечника и непосредственно оценить целостность всех отделов кишечника16,17,18.
Общая цель этого метода состоит в том, чтобы дать рекомендации по изучению влияния микробиома кишечника на экспериментальные сердечно-сосудистые заболевания. Этот протокол предоставляет более подробную информацию и ключевые соображения в дизайне эксперимента, чтобы способствовать физиологической трансляции и повысить строгость и воспроизводимость результатов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ценным подходом к изучению причинно-следственной роли микробиоты кишечника при сердечно-сосудистых и метаболических заболеваниях является перенос всей микробиоты или отдельных видов, представляющих интерес, на безмикробных мышей. Здесь мы описываем протоколы сбора образцов фекалий…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантом Вандербильта на премию в области клинических и трансляционных наук UL1TR002243 (А.К.) от Национального центра развития трансляционных наук; Грант Американской кардиологической ассоциации POST903428 (для J.A.I.); и гранты Национального института сердца, легких и крови K01HL13049, R03HL155041, R01HL144941 (А.К.) и грант NIH 1P01HL116263 (В.К.). Рисунок 1 был создан с помощью Biorender.
Materials
| Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost | ThermoFisher | B40932 | |
| Anaerobic chamber | COY | 7150220 | |
| Apolipoprotein AI | Novus Biologicals | NBP2-52979 | |
| Artery Scissors – Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Bleach solution | Fisher Scientific | 14-412-53 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | B14 | |
| CD3 antibody | ThermoFisher | 14-0032-82 | |
| CD68 monoclonal antibody | ThermoFisher | 14-0681-82 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-221 | |
| CODA high throughput monitor | Kent Scientic Corporation | CODA-HT8 | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Disposable graduate transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119AM | |
| Disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-2A | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AA33361M1 | |
| Feeding Needle | Fine Science Tools | 18061-38 | |
| Filter (30 µm) | Fisher Scientific | NC0922459 | |
| Filter paper sheet | Fisher Scientific | 09-802 | |
| Formalin (10%) | Fisher Scientific | 23-730-581 | |
| High salt diet | Teklad | TD.03142 | |
| OMNIgene.GUT | DNAgenotek | OM-200+ACP102 | |
| Osmotic mini-pumps | Alzet | MODEL 2002 | |
| PAP Pen | Millipore Sigma | Z377821-1EA | |
| Petri dish | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 21-236-18C | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| Serile Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | AAJ61196AP | |
| Smart spatula | Fisher Scientific | NC0133733 | |
| Stool collection device | Fisher Scientific | 50-203-7255 | |
| TBS Buffer | Fisher Scientific | R017R.0000 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | 9036-19-5 |
|
| Varimix platform rocker | Fisher Scientific | 09047113Q | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-41 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 1330-20-7, 100-41-4 |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: a report From the American Heart Association. Circulation. 143 (8), 254 (2021).
- Wu, H., et al. The gut microbiota in prediabetes and diabetes: a population-based cross-sectional study. Cell Metabolism. 32 (3), 379-390 (2020).
- Crovesy, L., Masterson, D., Rosado, E. L. Profile of the gut microbiota of adults with obesity: a systematic review. European Journal of Clinical Nutrition. 74 (9), 1251-1262 (2020).
- Avery, E. G., et al. The gut microbiome in hypertension: recent advances and future perspectives. Circulation Research. 128 (7), 934-950 (2021).
- Perez-Matute, P., Iniguez, M., de Toro, M., Recio-Fernandez, E., Oteo, J. A. Autologous fecal transplantation from a lean state potentiates caloric restriction effects on body weight and adiposity in obese mice. Scientific Reports. 10 (1), 9388 (2020).
- Zoll, J., et al. Fecal microbiota transplantation from high caloric-fed donors alters glucose metabolism in recipient mice, independently of adiposity or exercise status. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 319 (1), 203-216 (2020).
- Hvas, C. L., et al. Fecal microbiota transplantation is superior to fidaxomicin for treatment of recurrent Clostridium difficile infection. Gastroenterology. 156 (5), 1324-1332 (2019).
- Kootte, R. S., et al. Improvement of insulin sensitivity after lean donor feces in metabolic syndrome is driven by baseline intestinal microbiota composition. Cell Metabolism. 26 (4), 611-619 (2017).
- Li, J., et al. Gut microbiota dysbiosis contributes to the development of hypertension. Microbiome. 5 (1), 14 (2017).
- Shi, H., et al. Restructuring the gut microbiota by intermittent fasting lowers blood pressure. Circulation Research. 128 (9), 1240-1254 (2021).
- Zhong, H. J., et al. Washed microbiota transplantation lowers blood pressure in patients with hypertension. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 679624 (2021).
- Ferguson, J. F., et al. High dietary salt-induced dendritic cell activation underlies microbial dysbiosis-associated hypertension. JCI Insight. 5 (13), 126241 (2019).
- Yu, E. W., et al. Fecal microbiota transplantation for the improvement of metabolism in obesity: The FMT-TRIM double-blind placebo-controlled pilot trial. PLoS Medicine. 17 (3), 1003051 (2020).
- Leong, K. S. W., et al. Effects of fecal microbiome transfer in adolescents with obesity: the gut bugs randomized controlled trial. JAMA Network Open. 3 (12), 2030415 (2020).
- Zhang, Z., et al. Impact of fecal microbiota transplantation on obesity and metabolic syndrome-a systematic review. Nutrients. 11 (10), 2291 (2019).
- Laubitz, D., et al. Dynamics of gut microbiota recovery after antibiotic exposure in young and old mice (a pilot study). Microorganisms. 9 (3), 647 (2021).
- Xiao, L., et al. High-fat feeding rather than obesity drives taxonomical and functional changes in the gut microbiota in mice. Microbiome. 5 (1), 43 (2017).
- Brunt, V. E., et al. Suppression of the gut microbiome ameliorates age-related arterial dysfunction and oxidative stress in mice. The Journal of Physiology. 597 (9), 2361-2378 (2019).
- Choo, J. M., Rogers, G. B. Gut microbiota transplantation for colonization of germ-free mice. STAR Protocols. 2 (3), 100610 (2021).
- Kim, T. T., et al. Fecal transplant from resveratrol-fed donors improves glycaemia and cardiovascular features of the metabolic syndrome in mice. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 315 (4), 511-519 (2018).
- Lu, H., et al. Subcutaneous angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e53191 (2015).
- Wang, Y., Thatcher, S. E., Cassis, L. A. Measuring blood pressure using a noninvasive tail cuff method in mice. Methods in Molecular Biology. 1614, 69-73 (2017).
- Ishimwe, J. A., et al. The gut microbiota and short-chain fatty acids profile in postural orthostatic tachycardia syndrome. Frontiers in Physiology. 13, 879012 (2022).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Laboratory Animals. 15 (1), 57-59 (1981).
- Ishimwe, J. A., Garrett, M. R., Sasser, J. M. 1,3-Butanediol attenuates hypertension and suppresses kidney injury in female rats. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 319 (1), 106-114 (2020).
- Bokoliya, S. C., Dorsett, Y., Panier, H., Zhou, Y. Procedures for fecal microbiota transplantation in murine microbiome studies. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711055 (2021).
- Van Beusecum, J. P., Xiao, L., Barbaro, N. R., Patrick, D. M., Kirabo, A. Isolation and adoptive transfer of high salt treated antigen-presenting dendritic cells. Journal of Visualized Experiments. (145), e59124 (2019).
- Harrison, D. G., Marvar, P. J., Titze, J. M. Vascular inflammatory cells in hypertension. Frontiers in Physiology. 3, 128 (2012).
- Sylvester, M. A., et al. Splenocyte transfer from hypertensive donors eliminates premenopausal female protection from ANG II-induced hypertension. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (3), 245-257 (2022).
- Reikvam, D. H., et al. Depletion of murine intestinal microbiota: effects on gut mucosa and epithelial gene expression. PLoS One. 6 (3), 17996 (2011).
- Le Roy, T., et al. Comparative evaluation of microbiota engraftment following fecal microbiota transfer in mice models: age, kinetic and microbial status matter. Frontiers in Microbiology. 9, 3289 (2019).
- Sun, J., et al. Fecal microbiota transplantation alleviated Alzheimer’s disease-like pathogenesis in APP/PS1 transgenic mice. Translation Psychiatry. 9 (1), 189 (2019).
- Kim, M., et al. Critical role for the microbiota in CX(3)CR1(+) intestinal mononuclear phagocyte regulation of intestinal T cell responses. Immunity. 49 (3), 151-163 (2018).
- Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
- Wilde, E., et al. Tail-cuff technique and its influence on central blood pressure in the mouse. Journal of the American Heart Association. 6 (6), 005204 (2017).
- Liu, X., et al. High-fiber diet mitigates maternal obesity-induced cognitive and social dysfunction in the offspring via gut-brain axis. Cell Metabolism. 33 (5), 923-938 (2021).
