Fäkalisolierung der Maus und Mikrobiota-Transplantation
Summary
Ziel ist es, ein Protokoll zu skizzieren, um die Mechanismen der Dysbiose bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu untersuchen. In diesem Artikel wird erörtert, wie man aseptisch Stuhlproben von Mäusen sammelt und transplantiert, Darm isoliert und die “Swiss-Roll”-Methode anwendet, gefolgt von Immunfärbetechniken, um Veränderungen im Magen-Darm-Trakt zu untersuchen.
Abstract
Die Dysbiose der Darmmikrobiota spielt eine Rolle in der Pathophysiologie von Herz-Kreislauf- und Stoffwechselerkrankungen, aber die Mechanismen sind nicht gut verstanden. Die fäkale Mikrobiota-Transplantation (FMT) ist ein wertvoller Ansatz, um eine direkte Rolle der gesamten Mikrobiota oder isolierter Arten in der Pathophysiologie der Krankheit zu beschreiben. Es ist eine sichere Behandlungsoption für Patienten mit rezidivierender Clostridium difficile-Infektion . Präklinische Studien zeigen, dass die Manipulation der Darmmikrobiota ein nützliches Werkzeug ist, um den mechanistischen Zusammenhang zwischen Dysbiose und Krankheit zu untersuchen. Die Transplantation fäkaler Mikrobiota könnte dazu beitragen, neuartige Therapeutika für die Behandlung und Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu entwickeln, die auf die Darmmikrobiota ausgerichtet sind. Trotz einer hohen Erfolgsrate bei Nagetieren bleiben mit der Transplantation translationale Veränderungen verbunden. Ziel ist es, eine Orientierungshilfe bei der Untersuchung der Auswirkungen des Darmmikrobioms auf experimentelle Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu geben. In dieser Studie wird ein detailliertes Protokoll für die Sammlung, Handhabung, Verarbeitung und Transplantation von fäkalen Mikrobiota in murinen Studien beschrieben. Die Entnahme- und Verarbeitungsschritte werden sowohl für menschliche als auch für Nagetierspender beschrieben. Abschließend beschreiben wir die Verwendung einer Kombination aus Swiss-Rolling- und Immunfärbetechniken zur Beurteilung darmspezifischer Morphologie- und Integritätsveränderungen bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen und damit verbundenen Mechanismen der Darmmikrobiota.
Introduction
Kardiometabolische Erkrankungen, einschließlich Herzerkrankungen und Schlaganfall, sind weltweit die häufigsten Todesursachen1. Körperliche Inaktivität, schlechte Ernährung, fortschreitendes Alter und Genetik modulieren die Pathophysiologie dieser Störungen. Es gibt immer mehr Beweise dafür, dass die Darmmikrobiota Herz-Kreislauf- und Stoffwechselerkrankungen wie Typ-2-Diabetes2, Fettleibigkeit3 und Bluthochdruck4 beeinflusst, was ein Schlüssel zur Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze für diese Krankheiten sein könnte.
Die genauen Mechanismen, durch die die Mikrobiota Krankheiten verursacht, sind noch unbekannt, und die aktuellen Studien sind sehr unterschiedlich, was zum Teil auf methodische Unterschiede zurückzuführen ist. Die fäkale Mikrobiota-Transplantation (FMT) ist ein wertvoller Ansatz, um eine direkte Rolle der gesamten Mikrobiota oder isolierter Arten in der Pathophysiologie der Krankheit zu beschreiben. FMT wird häufig in Tierversuchen eingesetzt, um einen Phänotyp zu induzieren oder zu unterdrücken. Zum Beispiel können die Kalorienaufnahme und der Glukosestoffwechsel moduliert werden, indem Fäkalien von einem kranken Spender auf einen gesunden Empfänger übertragen werden 5,6. Beim Menschen hat sich FMT als sichere Behandlungsoption für Patienten mit rezidivierender Clostridium difficile-Infektion erwiesen7. Es gibt Beweise für seine Verwendung bei der Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Zum Beispiel verbessert FMT von Patienten mit magerem bis metabolischem Syndrom die Insulinsensitivität8. Darmdysbiose wird sowohl in Human- als auch in Nagetierstudien auch mit Bluthochdruck in Verbindung gebracht 9,10,11. FMT von Mäusen, die mit einer salzreichen Diät in keimfreie Mäuse gefüttert wurden, prädisponiert die Empfänger für Entzündungen und Bluthochdruck12.
Trotz der hohen Erfolgsrate der FMT bei Nagetieren bleiben translationale Herausforderungen bestehen. Klinische Studien mit FMT zur Behandlung von Adipositas und metabolischem Syndrom zeigen minimale bis keine Auswirkungen auf diese Erkrankungen13,14,15. Daher sind weitere Studien erforderlich, um zusätzliche therapeutische Wege zu identifizieren, die auf die Darmmikrobiota zur Behandlung von kardiometabolischen Störungen abzielen. Die meisten verfügbaren Erkenntnisse über die Darmmikrobiota und Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind assoziativ. Das beschriebene Protokoll erörtert, wie eine Kombination aus FMT und der Swiss-Rolling-Technik verwendet werden kann, um sowohl einen Zusammenhang zwischen Krankheit und Darmmikrobiota aufzuzeigen als auch die Integrität aller Teile des Darms direkt zu beurteilen16,17,18.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, eine Anleitung für die Untersuchung der Auswirkungen des Darmmikrobioms bei experimentellen Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu geben. Dieses Protokoll enthält weitere Details und wichtige Überlegungen im Versuchsdesign, um die physiologische Translation zu fördern und die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu erhöhen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein wertvoller Ansatz zur Untersuchung der kausalen Rolle der Darmmikrobiota bei Herz-Kreislauf- und Stoffwechselerkrankungen besteht darin, die gesamte Mikrobiota oder ausgewählte Arten von Interesse auf keimfreie Mäuse zu übertragen. Hier beschreiben wir Protokolle zur Entnahme von Kotproben von Menschen und konventionell untergebrachten Mäusen in keimfreie Mäuse, um die Rolle der Darmmikrobiota bei Bluthochdruckerkrankungen zu untersuchen.
Bei Mäusen verwenden wir aseptisch gesammelte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde unterstützt durch den Vanderbilt Clinical and Translational Science Award Grant UL1TR002243 (an A.K.) des National Center for Advancing Translational Sciences; Zuschuss der American Heart Association POST903428 (an J.A.I.); und National Heart, Lung, and Blood Institute Grants K01HL13049, R03HL155041, R01HL144941 (an A.K.) und NIH-Grant 1P01HL116263 (an V.K.). Abbildung 1 wurde mit Biorender erstellt.
Materials
| Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost | ThermoFisher | B40932 | |
| Anaerobic chamber | COY | 7150220 | |
| Apolipoprotein AI | Novus Biologicals | NBP2-52979 | |
| Artery Scissors – Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Bleach solution | Fisher Scientific | 14-412-53 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | B14 | |
| CD3 antibody | ThermoFisher | 14-0032-82 | |
| CD68 monoclonal antibody | ThermoFisher | 14-0681-82 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-221 | |
| CODA high throughput monitor | Kent Scientic Corporation | CODA-HT8 | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Disposable graduate transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119AM | |
| Disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-2A | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AA33361M1 | |
| Feeding Needle | Fine Science Tools | 18061-38 | |
| Filter (30 µm) | Fisher Scientific | NC0922459 | |
| Filter paper sheet | Fisher Scientific | 09-802 | |
| Formalin (10%) | Fisher Scientific | 23-730-581 | |
| High salt diet | Teklad | TD.03142 | |
| OMNIgene.GUT | DNAgenotek | OM-200+ACP102 | |
| Osmotic mini-pumps | Alzet | MODEL 2002 | |
| PAP Pen | Millipore Sigma | Z377821-1EA | |
| Petri dish | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 21-236-18C | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| Serile Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | AAJ61196AP | |
| Smart spatula | Fisher Scientific | NC0133733 | |
| Stool collection device | Fisher Scientific | 50-203-7255 | |
| TBS Buffer | Fisher Scientific | R017R.0000 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | 9036-19-5 |
|
| Varimix platform rocker | Fisher Scientific | 09047113Q | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-41 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 1330-20-7, 100-41-4 |
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