بناء الببتيدات الحلقية المخترقة للخلايا لتعزيز اختراق الحواجز البيولوجية
Summary
يصف هذا البروتوكول تخليق الببتيدات المخترقة للخلايا الحلقية مع الروابط المتقاطعة العطرية وتقييم نفاذيتها عبر الحواجز البيولوجية.
Abstract
لقد كان السرطان تحديا كبيرا في مجال الصحة العالمية. ومع ذلك ، فإن البيئة المكروية المعقدة للورم تحد عموما من وصول العلاجات إلى الخلايا السرطانية العميقة ، مما يؤدي إلى تكرار الورم. للتغلب على الاختراق المحدود للحواجز البيولوجية ، تم اكتشاف الببتيدات المخترقة للخلايا (CPPs) بقدرة ممتازة على نقل الغشاء وظهرت كناقلات جزيئية مفيدة لتوصيل الشحنات المختلفة إلى الخلايا. ومع ذلك ، تظهر CPPs الخطية التقليدية عموما استقرارا محللا للبروتين ، مما يحد من نفاذيتها عبر الحواجز البيولوجية. وبالتالي ، فإن تطوير ناقلات جزيئية جديدة يمكنها اختراق الحواجز البيولوجية وإظهار استقرار محسن للبروتين أمر مرغوب فيه للغاية لتعزيز كفاءة توصيل الأدوية في التطبيقات الطبية الحيوية. لقد قمنا سابقا بتجميع لوحة من CPPs الدورية القصيرة مع روابط متقاطعة عطرية ، والتي أظهرت نفاذية فائقة في الخلايا والأنسجة السرطانية مقارنة بنظيراتها الخطية. هنا ، يتم وصف بروتوكول موجز لتوليف الببتيد البولي أرجينين R8 الدوري المسمى بالفلورسنت ونظيره الخطي ، بالإضافة إلى الخطوات الرئيسية للتحقيق في نفاذية الخلية.
Introduction
شهدت العقود القليلة الماضية تقدما سريعا في تطوير الببتيدات المخترقة للخلايا (CPPs) لتوصيل الأدوية. تم استخدام CPPs على نطاق واسع كناقلات جزيئية لعلاج مجموعة من الأمراض التي تهدد الحياة ، بما في ذلك الاضطرابات العصبية1,2 ، وأمراض القلب3 ، والسكري4 ، والتهاب الجلد5 ، والسرطان 6,7. لا يزال السرطان يشكل عبئا صحيا عالميا مصحوبا بمعدل مرتفع من المراضة والوفيات على الرغم من الجهود البحثية واسعة النطاق8. تتمثل إحدى العقبات الخطيرة أمام علاج السرطان في محدودية وصول العلاجات إلى الخلايا السرطانية العميقة بسبب الحواجز الفسيولوجية مثل المصفوفة المدمجة خارج الخلية (ECM) ، والأوعية الدموية غير الطبيعية للورم ، وحواجز الأغشية المتعددة ، وارتفاع ضغط السائل الخلالي (IFP) 9. وبالتالي ، فإن تطوير CPPs جديدة ذات قدرة فائقة على توصيل الشحنات عبر الحواجز البيولوجية يعتبر استراتيجية أساسية لعلاج السرطان10,11.
يمكن تصنيف CPPs إلى CPPs الموجبة والبرمائية والكارهة للماء من حيث خصائصها الفيزيائية والكيميائية12. من بين هذه ، الببتيد HIV-TAT المشحون إيجابيا والبوليارجينين الاصطناعي لهما أهمية كبيرة في البحوث الطبية الحيوية وقد تمت دراستهما على نطاق واسع لتسهيل توصيل الدواء داخل الخلايا13. أفاد Tunnemann et al. أن الحد الأدنى لطول ثمانية أرجينين ضروري لاختراق الخلايا بكفاءة لببتيدات البولي أرجينين الاصطناعية ، بناء على دراسة نفاذية الخلية التي أجريت باستخدام الببتيدات R3 إلى R1214. ومع ذلك ، فإن هذه CPPs عموما لها نصف عمر بلازما قصير بسبب التحلل المائي السريع في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، لا يعرف سوى القليل فيما يتعلق بتحسين التركيب الكيميائي ل CPPs لزيادة قدرتها على عبور الحاجز لأنه من الصعب اختراق أغشية خلايا متعددة15. وبالتالي ، فإن تطوير ناقلات جزيئية جديدة قادرة على اختراق الحواجز البيولوجية أمر مرغوب فيه بشدة لتعزيز كفاءة توصيل الدواء. في عام 2020 ، اكتشف Komin et al.16 CPP يسمى CL peptide ، والذي يحتوي على شكل حلزوني (RLLRLLR) وذيل بولي أرجينين (R7) لعبور الطبقة الأحادية الظهارية. كما تم تصنيع مجموعة من متغيرات الببتيد CL عن طريق تغيير النمط الحلزوني. يمكن أن يكون هذا الاستكشاف دليلا مهما لتطوير CPPs جديدة لتسليم الشحنات عبر الحواجز البيولوجية. علاوة على ذلك ، قام Dietrich et al. بتحسين نفاذية الخلية لببتيد StAX ، مما أدى إلى تثبيط مسار إشارات Wnt / β-catenin عن طريق زيادة الكارهة للماء الكلية للببتيدات17.
يعد التقييد المطابق للببتيدات الخطية غير المنظمة عن طريق التدوير طريقة فعالة لتعزيز استقرارها المحلل للبروتين ونفاذيتها18،19،20. يزيد التعزيز الهيكلي من مقاومة الأنزيم البروتيني للببتيدات الحلقية ، مما يجعلها أكثر استقرارا في الجسم الحي مقارنة بنظيراتها الخطية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي تدوير الببتيدات إلى إخفاء العمود الفقري للببتيد القطبي من خلال تعزيز الترابط الهيدروجيني داخل الجزيئات ، وبالتالي زيادة نفاذية الغشاء للببتيدات21. في العقدين الماضيين ، أصبحت طرق التدوير الكيميائي الانتقائي استراتيجيات فعالة لبناء الببتيدات الحلقية ذات البنى المختلفة ، مثل جميع الهيدروكربونات ، واللاكتام ، والتريازول ، و m-xylene ، والبيرفلورواريل ، وغيرها من الروابط المتقاطعة22,23. يمكن للحاجز البيولوجي الذي تفرضه البيئة المكروية المتطورة للورم أن يقلل من تغلغل الأدوية في الأورام الصلبة24. لقد وجدنا سابقا أن CPPs الدورية أظهرت مقاومة فائقة للهضم الأنزيمي على نظيراتهاالخطية 20. علاوة على ذلك ، فإن الكارهة للماء الكلية للببتيدات أمر بالغ الأهمية لتعزيز نفاذية الخلية22. بناء على الدراسات التي نوقشت أعلاه ، يمكن افتراض الجمع بين نمط موجب الشحنة ، وارتفاع الكارهة للماء بشكل عام ، وتعزيز استقرار التحلل البروتيني لزيادة نفاذية CPPs عبر الحواجز البيولوجية. في دراسة حديثة ، حددنا اثنين من CPPs الدورية مع وصلات متقاطعة عطرية في المواضع i و i + 7 التي تظهر نفاذية محسنة في الخلايا والأنسجة السرطانية مقارنة بنظيراتها الخطية15. هنا ، يتم تقديم بروتوكول اصطناعي موجز لتوليف CPPs الدورية ذات العلامات الفلورية والخطوات الرئيسية للتحقق من نفاذيتها.
Protocol
Representative Results
Discussion
أثبت التثبيت الكيميائي للببتيدات من خلال دمج القيود المطابقة أنه استراتيجية فعالة لتحسين استقرار ونفاذية الخلية للببتيد26. في هذا البروتوكول ، يتم وصف إجراء خطوة بخطوة لتخليق CPPs الدورية مع الروابط المتقاطعة العطرية وتقييم نفاذيتها عبر الحواجز البيولوجية. بالمقارنة مع الروا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية الصينية (21708031) ، ومؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (BX20180264 ، 2018M643519) ، وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية (2682021ZTPY075).
Materials
| 1,2-ethanedithiol | Aladdin | K1722093 | stench |
| 2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) | HEOWNS | A-0443697 | |
| 4,4'-bis(bromomethyl)biphenyl | TCI | B1921 | |
| 4T1 cells | ATCC | 4T1 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2. | |
| Acetonitrile | Adamas | 1484971 | toxicity |
| Dichloromethane | Energy | W330229 | skin harmful |
| Diethyl ether | Aldrich | 673811 | flammable |
| Dimethyl sulfoxide | Beyotime | ST038 | skin harmful |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | ||
| Electrospray Ionization Mass Spectrometer | Waters | G2-S Tof | |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | BioFroxx | 1340 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | ||
| Flow cytometer | Beckman Coulter | CytoFLEX | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer (FITC) | Energy | E0801812500 | |
| Fluorescent microscope | Carl Zeiss | Axio Observer 7 | |
| Fmoc-Arg(Pbf)-OH | HEOWNS | F-81070 | |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | GL Biochem | GLS201115-35202 | |
| Fmoc-βAla-OH | Adamas | 51341C | |
| HeLa cells | ATCC | HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2. | |
| High-Performance Liquid Chromatography | Agilent | Agilent 1260 | |
| High-Performance Liquid Chromatography column | Agilent | Poroshell EC-C18 120, 4.6 × 150 mm (pore size 120 Å, particle size 4 μm) | |
| Lyophilizer | SP Scientific | Vir Tis | |
| Methanol | Aldrich | 9758 | toxicity |
| Microtiter plate | Thermo μdrop plate | N12391 | |
| Morpholine | HEOWNS | M99040 | irritant |
| Multi-technology microplate reader | Thermo | VARIOSKAN LUX | |
| N,N-Diisopropylethylamine | HEOWNS | E-81416 | irritant |
| N,N-Dimethyl formamide | Energy | B020051 | harmful to skin |
| Poly-Prep column | Bio-Rad | 7321010 | polypropylene chromatography columns |
| Rink Amide MBHA resin (0.572 mmol/g) | GL Biochem | GLS180301-49101 | |
| Three-way stopcocks | Bio-Rad | 7328107 | |
| Tissue culture plate insert | LABSELECT | 14211 | |
| Trifluoroacetic acid | HEOWNS | T63278 | corrosive |
| Triisopropylsilane | HEOWNS | T-0284475 | |
| Trypsin | BioFroxx | 1004 | |
| Vacuum manifold | Promega | A7231 |
References
- Zhang, L., et al. Brain-targeted dual site-selective functionalized poly(β-amino esters) delivery platform for nerve regeneration. Nano Letters. 21 (7), 3007-3015 (2021).
- Park, T. E., et al. Enhanced BBB permeability of osmotically active poly(mannitol-co-PEI) modified with rabies virus glycoprotein via selective stimulation of caveolar endocytosis for RNAi therapeutics in Alzheimer’s disease. Biomaterials. 38, 61-71 (2015).
- Bian, J., et al. Effect of cell-based intercellular delivery of transcription factor GATA4 on ischemic cardiomyopathy. Circulation Research. 100 (11), 1626-1633 (2007).
- He, H., et al. The use of low molecular weight protamine chemical chimera to enhance monomeric insulin intestinal absorption. Biomaterials. 34 (31), 7733-7743 (2013).
- Kim, D., et al. A specific STAT3-binding peptide exerts antiproliferative effects and antitumor activity by inhibiting STAT3 phosphorylation and signaling. Cancer Research. 74 (8), 2144-2151 (2014).
- Yang, Y., et al. PEGylated liposomes with NGR ligand and heat-activable cell-penetrating peptide-doxorubicin conjugate for tumor-specific therapy. Biomaterials. 35 (14), 4368-4381 (2014).
- Wei, Y., et al. Intracellular paclitaxel delivery facilitated by a dual-functional CPP with a hydrophobic hairpin tail. ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (4), 4853-4860 (2021).
- Vasan, N., Baselga, J., Hyman, D. M. A view on drug resistance in cancer. Nature. 575 (7782), 299-309 (2019).
- Cong, Y., et al. Microenvironment-induced in situ self-assembly of polymer-peptide conjugates that attack solid tumors deeply. Angewandte Chemie International Edition. 131 (14), 4680-4685 (2019).
- Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nature Biotechnology. 33 (9), 941-951 (2015).
- Tian, Y., Zhou, S. Advances in cell-penetrating peptides and their functionalization of polymeric nanoplatforms for drug delivery. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (2), 1-12 (2021).
- Milletti, F. Cell-penetrating peptides: Classes, origin, and current landscape. Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).
- Turner, J. J., et al. Cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids (PNA) as inhibitors of HIV-1 Tat-dependent trans-activation in cells. Nucleic Acids Research. 33 (21), 6837-6849 (2005).
- Tunnemann, G., et al. Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines. Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).
- Shi, M., et al. Stapling of short cell-penetrating peptides for enhanced tumor cell-and-tissue dual-penetration. Chemical Communications. 58 (14), 2299-2302 (2022).
- Komin, A., et al. A peptide for transcellular cargo delivery: Structure-function relationship and mechanism of action. Journal of Controlled Release. 324, 633-643 (2020).
- Dietrich, L., et al. Cell permeable stapled peptide inhibitor of Wnt signaling that targets β-catenin protein-protein interactions. Cell Chemical Biology. 24 (8), 958-968 (2017).
- Tian, Y., et al. Stapling of unprotected helical peptides via photo-induced intramolecular thiol-yne hydrothiolation. Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).
- De Araujo, A. D., et al. Comparative α-helicity of cyclic pentapeptides in water. Angewandte Chemie International Edition. 53 (27), 6965-6969 (2014).
- Chu, Q., et al. Towards understanding cell penetration by stapled peptides. Medicinal Chemistry Communications. 6 (1), 111-119 (2015).
- Bock, J. E., Gavenonis, J., Kritzer, J. A. Getting in shape: Controlling peptide bioactivity and bioavailability using conformational constraints. ACS Chemical Biology. 8 (3), 488-499 (2013).
- Tian, Y., et al. Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled α-helical peptides: A comparative study. ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).
- White, C. J., Yudin, A. K. Contemporary strategies for peptide macrocyclization. Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
- Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. Solid-phase synthesis of short α-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach. Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).
- Baek, S., et al. Structure of the stapled p53 peptide bound to Mdm2. Journal of the American Chemical Society. 134 (1), 103-106 (2012).
- Traboulsi, H., et al. Macrocyclic cell penetrating peptides: A study of structure-penetration properties. Bioconjugate Chemistry. 26 (3), 405-411 (2015).
- Tian, Y., et al. A proline-derived transannular N-cap for nucleation of short α-helical peptides. Chemical Communications. 52 (59), 9275-9278 (2016).
- Muppidi, A., et al. Rational design of proteolytically stable, cell-permeable peptide-based selective Mcl-1 inhibitors. Journal of the American Chemical Society. 134 (36), 14734-14737 (2012).
- Wiradharma, N., et al. Synthetic cationic amphiphilic α-helical peptides as antimicrobial agents. Biomaterials. 32 (8), 2204-2212 (2011).
- Jones, A. T., Sayers, E. J. Cell entry of cell penetrating peptides: Tales of tails wagging dogs. Journal of Controlled Release. 161 (2), 582-591 (2012).
