Co-coltura e trasduzione di timociti murini su cellule stromali esprimenti delta-like 4 per studiare oncogeni nella leucemia a cellule T
Summary
Questo protocollo descrive l’isolamento dei timociti doppi negativi dal timo di topo seguito da trasduzione retrovirale e co-coltura sul sistema di co-coltura della linea cellulare stromale del midollo osseo a 4 esprimenti delta (OP9-DL4) per ulteriori analisi funzionali.
Abstract
I timociti immaturi di topo trasdotti possono essere differenziati in cellule T in vitro utilizzando il sistema di co-coltura della linea cellulare stromale del midollo osseo simile a 4 delta (OP9-DL4). Poiché la trasduzione retrovirale richiede la divisione delle cellule per l’integrazione del transgene, OP9-DL4 fornisce un ambiente in vitro adatto per la coltivazione di cellule progenitrici ematopoietiche. Ciò è particolarmente vantaggioso quando si studiano gli effetti dell’espressione di un gene specifico durante il normale sviluppo delle cellule T e la leucemogenesi, in quanto consente ai ricercatori di aggirare il processo dispendioso in termini di tempo di generazione di topi transgenici. Per ottenere risultati positivi, è necessario eseguire attentamente una serie di passaggi coordinati che comportano la manipolazione simultanea di diversi tipi di cellule. Sebbene si tratti di procedure molto consolidate, la mancanza di una fonte comune in letteratura spesso richiede una serie di ottimizzazioni, che possono richiedere molto tempo. Questo protocollo si è dimostrato efficace nella trasduzione dei timociti primari seguita dalla differenziazione sulle cellule OP9-DL4. Dettagliato qui è un protocollo che può servire come guida rapida e ottimizzata per la co-coltura di timociti trasdotti retroviralmente su cellule stromali OP9-DL4.
Introduction
La linea cellulare stromale OP9 del midollo osseo fornisce un utile sistema in vitro per l’induzione della linfopoiesi da diverse fonti di progenitori1. I primi studi che hanno utilizzato cellule OP9 hanno dimostrato che la mancanza di espressione del fattore stimolante le colonie di macrofagi (MCSF) ha contribuito alla capacità della linea cellulare OP9 di supportare l’emopoiesi e la differenziazione delle cellule B dalle cellule staminali ematopoietiche derivate dal midollo osseo (HSC), come è stato successivamente dimostrato anche per le cellule staminali embrionali (ESC)2,3,4,5 . In studi precedenti, la generazione di cellule OP9 che esprimono 1/4 delta-like (OP9-DL1/OP9-DL4) ha permesso l’induzione dell’impegno della linea di lenza T6 e ha dimostrato la capacità di ricapitolare con successo la maturazione timica 7,8. In breve, lo sviluppo delle cellule T è stato descritto dall’espressione sequenziale di molecole CD4 e CD8. I timociti immaturi sono “doppio-negativi” (DN, CD4− CD8−) e possono essere ulteriormente suddivisi in base all’espressione superficiale di CD44 e CD25. I timociti DN si differenziano attraverso lo stadio immaturo single-positivo (ISP), caratterizzato dall’espressione di CD8 nei topi e CD4 nell’uomo, seguito dallo stadio double-positive (DP), caratterizzato dalla co-espressione di CD4 e CD8 e, infine, dallo stadio maturo single-positivo, caratterizzato dall’espressione di CD4 o CD89. Le HSC esprimono il recettore Notch1, che normalmente interagisce con il delta-like 4 (DL4) espresso sulle cellule epiteliali timiche per indurre la differenziazione della linea T10. Pertanto, l’interesse per il modello OP9-DL1/4 è progressivamente aumentato, portando all’uso estensivo di questo approccio in un’ampia varietà di applicazioni negli ultimi due decenni 8,11,12,13. Sebbene DL1 e DL4 siano entrambi in grado di supportare la differenziazione delle cellule T in vitro, mostrano requisiti differenziali in vivo e alcuni studi hanno suggerito che OP9_DL4 è più efficiente di OP9_DL1 nel ricapitolare l’ambiente timico del topo 7,14.
Tra le potenziali applicazioni del sistema OP9-DL1/4, vi è un particolare interesse per la combinazione di questo sistema con la trasduzione di cellule DN o HSC con vettori retrovirali. Questa combinazione è un modo efficace per manipolare l’espressione genica durante il normale sviluppo delle cellule T e la leucemogenesi e ha dimostrato di essere un metodo efficace per indurre o inibire la funzione di un gene di interesse15,16,17. Questo modello è stato utilizzato con particolare successo per studiare la collaborazione tra gli oncogeni che guidano la leucemia15 in quanto è flessibile e consente l’esame degli effetti di più combinazioni geniche in un tempo ragionevole, in contrasto con la generazione di topi transgenici. Inoltre, modelli simili sono stati utilizzati in precedenza per valutare gli effetti dell’introduzione di oncogeni nelle cellule normali15,16,17. Inoltre, la trasduzione retrovirale richiede la divisione delle cellule per l’integrazione del transgene18, e mentre la trasduzione lentivirale supererebbe questa limitazione eliminando la necessità di dividere le cellule per l’integrazione del transgene, non siamo stati in grado di ottenere la trasduzione di successo dei timociti DN usando vettori lentivirali. Pertanto, OP9-DL1 / DL4 è uno strumento adatto per la crescita di cellule progenitrici ematopoietiche.
Il protocollo standard per la linfopoiesi dei timociti trasdotti su OP9-DL4 prevede una serie di passaggi coordinati che devono essere eseguiti con attenzione per ottenere un risultato positivo. Sebbene queste siano tecniche che hanno servito bene la comunità per molti anni, spesso i protocolli disponibili in letteratura sono frammentati. Di conseguenza, ogni laboratorio è costretto ad adattare e ottimizzare le diverse fasi della procedura, il che può richiedere molto tempo. Qui, questo protocollo descrive l’isolamento dei timociti DN dal timo di topo, seguito da trasduzione retrovirale e co-coltura su cellule stromali OP9-DL4 per ulteriori analisi funzionali. Questo protocollo stabilito ha dimostrato di essere efficiente e riproducibile nella trasduzione dei timociti primari, seguita dalla differenziazione sulle cellule OP9-DL4 o dall’induzione della leucemia linfoblastica acuta delle cellule T15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descritto è stato sviluppato specificamente per studi sulle cellule T DN derivate dal timo (CD4−/CD8−) con trasfezione retrovirale seguita da un modello di differenziazione OP9-DL4. Tuttavia, è probabile che le cellule bersaglio che saranno sottoposte a questo protocollo di trasduzione seguito da differenziamento cellulare avranno una più ampia utilità interdisciplinare. Pertanto, oltre ai timociti immaturi, le cellule staminali ematopoietiche, come le cellule derivate dal fegato fetale o dal midollo osseo, potrebbero potenzialmente essere utilizzate in questo protocollo.
Il sistema OP9-DL4 ha dimostrato di essere un modello efficace per studiare la funzione genica in una varietà di aspetti, tra cui la differenziazione cellulare17 e l’oncogenesi15. Mentre la modificazione retrovirale dei progenitori ematopoietici è una tecnica consolidata che consente una modificazione genetica stabile, combinare l’induzione della differenziazione cellulare sul sistema OP9-DL4 e la trasduzione retrovirale richiede cura e abilità. L’aspetto critico per raggiungere il successo con questo protocollo è garantire che tutti i passaggi siano ben coordinati, poiché il protocollo prevede l’utilizzo di tre diversi tipi di cellule che devono essere mantenute sane e alla confluenza ideale richiesta per ogni fase specifica. Con questo in mente, è importante eseguire tutte le analisi dei punti di controllo qualità dopo l’esecuzione di ogni fase prima di procedere alla fase successiva. Ciò garantirà che tutti i passaggi funzionino. Pertanto, il controllo dell’efficienza di deplezione e trasduzione è importante per la corretta esecuzione di questo protocollo (vedere un risultato tipico per l’efficienza di trasduzione nella Figura 4). Una buona efficienza di trasduzione cellulare primaria è legata ad un elevato titolo virale. In genere, inserti più grandi comportano titoli virali più bassi18. Ai fini dell’allenamento, utilizziamo un vettore vuoto per rappresentare i risultati che possono essere ottenuti con questo protocollo. Nella nostra esperienza, le efficienze di trasduzione e trasfezione variano a seconda delle dimensioni dell’inserto, specialmente considerando i geni reporter che esprimono la spina dorsale virale, come la GFP. Una strategia che può essere utilizzata quando si studia l’interazione di più di un gene è quella di clonare ciascun gene in un diverso vettore di trasferimento, seguito dalla produzione di virus individuale e, infine, dalla co-trasduzione della cellula bersaglio. In tal caso, può essere applicata una fase di selezione per eliminare le cellule trasdotte singolarmente e mantenere solo le cellule co-trasdotte.
Vale la pena notare che la maggior parte delle linee cellulari dello strato di alimentazione stromale OP9-DL1 / DL4 sono state geneticamente modificate per esprimere GFP come parte dei costrutti DL1 o DL47. In questo protocollo, abbiamo utilizzato un vettore retrovirale che esprime anche GFP; tuttavia, è più luminoso della proteina GFP espressa dalle cellule OP9-DL4 e non interferisce con l’ispezione di trasduzione quando visualizza la co-coltura al microscopio a fluorescenza.
Le cellule OP9 si differenziano in adipociti dopo molti passaggi, lunghi periodi in coltura o in condizioni di sovraconfluenza19. Ciò è evidenziato dallo sviluppo di grandi vacuoli. Pertanto, le cellule OP9 che presentano queste caratteristiche non dovrebbero essere utilizzate in questo protocollo. La trasfezione di cellule produttrici di retrovirus eccessivamente confluenti si tradurrà in un basso titolo virale. In effetti, la fase subconfluente è quando le cellule sono più trasfettabili. Inoltre, la trasfezione di cellule produttrici di retrovirus a bassa confluenza ridurrà lo stress cellulare nel processo di trasfezione e darà il titolo virale più alto.
Mentre, in questo protocollo, non titoliamo il virus supernatante, la titolazione del virus supernatante deve essere considerata in alcuni casi, come in assenza di un gene reporter nel vettore retrovirale, che impedirebbe la determinazione indiretta della produzione virale, o nei casi in cui il disegno sperimentale richiede un numero più accurato di copie del transgene da integrare nel genoma della cellula bersaglio. Tuttavia, è importante notare che il titolo del vettore retrovirale surnatante diminuisce significativamente se conservato a -80 °C o 4 °C fino a quando non si ottengono i risultati della titolazione. Pertanto, l’uso di supernatante virale appena preparato per la trasduzione produrrà una migliore efficienza di trasduzione.
Il timo contiene un gran numero di timociti doppi positivi (DP) (oltre l’85%) e circa il 10% di15 cellule single-positive (CD4 o CD8), che sono i timociti post-DN. Le cellule DP non possono sopravvivere in vitro per la manipolazione retrovirale, mentre le cellule SP non sono trasducibili. Pertanto, questo protocollo può essere applicato per generare timociti DN transducibili vettori retrovirali.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal programma intramurale del National Cancer Institute, progetto ZIABC009287. OP9-DL4 è stato ottenuto dal Dr. Juan Carlos Zúñiga-Pflücker (Sunnybrook Health Sciences Centre, Toronto, ON, Canada). Gli autori ringraziano il NCI-Frederick Laboratory Animal Sciences Program per la loro continua assistenza tecnica e consulenza e input sperimentale, così come Jeff Carrel, Megan Karwan e Kimberly Klarmann per l’assistenza alla citometria a flusso. Siamo grati a Howard Young per i consigli critici e il contributo.
Materials
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| ACK Lysis buffer | Lonza | 10-548E | |
| BSA | Cell Signaling Technology | 9998S | |
| CD4 Microbeads | Miltenyi | 130-049-201 | |
| CD8 Microbeads | Miltenyi | 130-049-401 | |
| Centrifuge 5910R | eppendorf | 5942IP802353 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Fetal calf serum HyClone FBS | ThermoScientific | SH30910.03 | |
| LD columns | Miltenyi | 130-042-901 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | Freeze glutamine in aliquots and use freshly-thawed glutamine |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | P/N 52887 | |
| MEM-alpha Medium | Gibco | 12561-072 | |
| OPTI-MEM I Reducing Serum Medium | Invitrogen | 31985-062 | |
| PBS pH 7.2 | Corning | 21-040-CV | |
| pcL-Eco Plasmid | Addgene | 12371 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pMIG Plasmid | Addgene | 6492 | |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
| Pre-Separation Filters | Miltenyi | 130-041-407 | |
| recombinant hFLT-3L | PeproTech | 300-19 | |
| recombinant IL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| Retrovial packaging cell line Phoenix-Eco | Orbigen | RVC-10002 | |
| Syringe filter (0.45 µm) | Millipore | SLHV033RS |
References
- Zuniga-Pflucker, J. C. T-cell development made simple. Nature Reviews Immunology. 4 (1), 67 (2004).
- Kodama, H., Nose, M., Niida, S., Nishikawa, S., Nishikawa, S. Involvement of the c-kit receptor in the adhesion of hematopoietic stem cells to stromal cells. Experimental Hematology. 22 (10), 979-984 (1994).
- Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science. 265 (5175), 1098-1101 (1994).
- Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. In vitro development of primitive and definitive erythrocytes from different precursors. Science. 272 (5262), 722-724 (1996).
- Ueno, H., et al. A stromal cell-derived membrane protein that supports hematopoietic stem cells. Nature Immunology. 4 (5), 457-463 (2003).
- Jaleco, A. C., et al. Differential effects of Notch ligands Delta-1 and Jagged-1 in human lymphoid differentiation. Journal of Experimental Medicine. 194 (7), 991-1002 (2001).
- Mohtashami, M., et al. Direct comparison of Dll1- and Dll4-mediated Notch activation levels shows differential lymphomyeloid lineage commitment outcomes. Journal of Immunology. 185 (2), 867-876 (2010).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17 (6), 749-756 (2002).
- Mazzucchelli, R., Durum, S. K. Interleukin-7 receptor expression: Intelligent design. Nature Reviews Immunology. 7 (2), 144-154 (2007).
- Robey, E. A., Bluestone, J. A. Notch signaling in lymphocyte development and function. Current Opinion in Immunology. 16 (3), 360-366 (2004).
- Lavaert, M., et al. Integrated scRNA-Seq identifies human postnatal thymus seeding progenitors and regulatory dynamics of differentiating immature thymocytes. Immunity. 52 (6), 1088-1104 (2020).
- Roh, K. H., Roy, K. Engineering approaches for regeneration of T lymphopoiesis. Biomaterials Research. 20 (20), (2016).
- Zlotoff, D. A., et al. CCR7 and CCR9 together recruit hematopoietic progenitors to the adult thymus. Blood. 115 (10), 1897-1905 (2010).
- Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: Generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (2), (2009).
- Cramer, S. D., et al. Mutant IL-7Ralpha and mutant NRas are sufficient to induce murine T cell acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 32 (8), 1795-1882 (2018).
- Treanor, L. M., et al. Interleukin-7 receptor mutants initiate early T cell precursor leukemia in murine thymocyte progenitors with multipotent potential. Journal of Experimental Medicine. 211 (4), 701-713 (2014).
- Yokoyama, K., et al. In vivo leukemogenic potential of an interleukin 7 receptor alpha chain mutant in hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 122 (26), 4259-4263 (2013).
- Simmons, A., Alberola-Ila, J. Retroviral transduction of T cells and T cell precursors. Methods in Molecular Biology. 1323, 99-108 (2016).
- . Retroviral systems Available from: https://web.stanford.edu/group/nolan/_OldWebsite/retroviral_systems/retsys.html (2022)
- Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells. Journal of Visualized Experiments. (90), e51780 (2014).
- Gray, D. H., et al. Developmental kinetics, turnover, and stimulatory capacity of thymic epithelial cells. Blood. 108 (12), 3777-3785 (2006).
- Godfrey, D. I., Kennedy, J., Suda, T., Zlotnik, A. A developmental pathway involving four phenotypically and functionally distinct subsets of CD3-CD4-CD8- triple-negative adult mouse thymocytes defined by CD44 and CD25 expression. Journal of Immunology. 150 (10), 4244-4252 (1993).
- Wang, Y. B., Edinger, M., Mittar, D., McIntyre, C. Studying mouse thymocyte development using multiparametric flow cytometry: An efficient method to improve an 8-color panel on the BD FACSVerse™ system. BD Biosciences–Application Note. , (2012).
- Sakaguchi, N., et al. Altered thymic T-cell selection due to a mutation of the ZAP-70 gene causes autoimmune arthritis in mice. Nature. 426 (6965), 454-460 (2003).
- He, X., Park, K., Kappes, D. J. The role of ThPOK in control of CD4/CD8 lineage commitment. Annual Review of Immunology. 28, 295-320 (2010).
- Wang, Y., et al. A conserved CXXC motif in CD3epsilon is critical for T cell development and TCR signaling. PLoS Biology. 7 (12), e1000253 (2009).
- Aliahmad, P., Kadavallore, A., de la Torre, B., Kappes, D., Kaye, J. TOX is required for development of the CD4 T cell lineage gene program. Journal of Immunology. 187 (11), 5931-5940 (2011).
