الزراعة المشتركة ونقل الخلايا الصعترية للفئران على الخلايا اللحمية الشبيهة بدلتا 4 لدراسة الجينات المسرطنة في سرطان الدم في الخلايا التائية
Summary
يصف هذا البروتوكول عزل الخلايا الصعترية السلبية المزدوجة من الغدة الصعترية للفأر متبوعة بنقل الفيروسات القهقرية والمزرعة المشتركة على نظام الاستزراع المشترك لخط لحمية نخاع العظم الشبيه بدلتا (OP9-DL4) لمزيد من التحليل الوظيفي.
Abstract
يمكن تمييز الخلايا الصعترية غير الناضجة للفأر المحول إلى خلايا تائية في المختبر باستخدام نظام الاستزراع المشترك لخط الخلايا اللحمية لنخاع العظم الذي يشبه دلتا (OP9-DL4). نظرا لأن نقل الفيروسات القهقرية يتطلب انقسام الخلايا لتكامل الجينات المحورة ، فإن OP9-DL4 يوفر بيئة مناسبة في المختبر لزراعة الخلايا السلفية المكونة للدم. هذا مفيد بشكل خاص عند دراسة آثار التعبير عن جين معين أثناء نمو الخلايا التائية الطبيعية وتكوين الكريات البيض ، لأنه يسمح للباحثين بالتحايل على العملية التي تستغرق وقتا طويلا لتوليد الفئران المعدلة وراثيا. لتحقيق نتائج ناجحة ، يجب إجراء سلسلة من الخطوات المنسقة التي تنطوي على معالجة متزامنة لأنواع مختلفة من الخلايا بعناية. على الرغم من أن هذه إجراءات راسخة للغاية ، إلا أن عدم وجود مصدر مشترك في الأدبيات غالبا ما يعني أن هناك حاجة إلى سلسلة من التحسينات ، والتي يمكن أن تستغرق وقتا طويلا. وقد ثبت أن هذا البروتوكول فعال في تحويل الخلايا الصعترية الأولية متبوعا بالتمايز على خلايا OP9-DL4. مفصل هنا هو بروتوكول يمكن أن يكون بمثابة دليل سريع ومحسن للثقافة المشتركة للخلايا الصعترية المحولة بالفيروسات القهقرية على الخلايا اللحمية OP9-DL4.
Introduction
يوفر خط الخلايا اللحمية لنخاع العظم OP9 نظاما مفيدا في المختبر لتحريض تكون اللمفاويات من عدة مصادر للأسلاف1. أظهرت الدراسات الأولى التي استخدمت خلايا OP9 أن عدم وجود تعبير عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (MCSF) ساهم في قدرة خط خلايا OP9 على دعم تكون الدم وتمايز الخلايا البائية عن الخلايا الجذعية المكونة للدم المشتقة من نخاع العظم (HSCs) ، كما هو موضح لاحقا أيضا للخلايا الجذعية الجنينية (ESCs)2،3،4،5 . في الدراسات السابقة ، مكن توليد خلايا OP9 التي تشبه دلتا (OP9-DL1 / OP9-DL4) من تحريض التزام سلالة الخلايا التائية6 وأظهر القدرة على تلخيص نضج الغدة الصعترية بنجاح 7,8. باختصار ، تم وصف تطور الخلايا التائية من خلال التعبير المتسلسل لجزيئات CD4 و CD8. الخلايا الصعترية غير الناضجة “سلبية مزدوجة” (DN ، CD4− CD8−) ويمكن تقسيمها بشكل أكبر وفقا للتعبير السطحي ل CD44 و CD25. تتمايز الخلايا الصعترية DN من خلال مرحلة الإيجابية المفردة غير الناضجة (ISP) ، والتي تتميز بتعبير CD8 في الفئران و CD4 في البشر ، تليها المرحلة الإيجابية المزدوجة (DP) ، التي تتميز بالتعبير المشترك ل CD4 و CD8 ، وأخيرا ، المرحلة الإيجابية الفردية الناضجة ، التي تتميز بالتعبير عن CD4 أو CD89. تعبر HSCs عن مستقبل Notch1 ، والذي يتفاعل عادة مع 4 (DL4) الشبيه بالدلتا المعبر عنه على الخلايا الظهارية الصعترية للحث على تمايز سلالة T10. ومن ثم ، زاد الاهتمام بنموذج OP9-DL1 / 4 تدريجيا ، مما أدى إلى الاستخدام المكثف لهذا النهج في مجموعة واسعة من التطبيقات في العقدين الماضيين8،11،12،13. على الرغم من أن DL1 و DL4 قادران على دعم تمايز الخلايا التائية في المختبر ، إلا أنهما يظهران متطلبات تفاضلية في الجسم الحي ، وقد اقترحت بعض الدراسات أن OP9_DL4 أكثر كفاءة من OP9_DL1 في تلخيص بيئة الغدة الصعترية للفأر 7,14.
من بين التطبيقات المحتملة لنظام OP9-DL1/4 ، هناك اهتمام خاص بالجمع بين هذا النظام ونقل خلايا DN أو HSCs مع ناقلات الفيروسات القهقرية. هذا المزيج هو وسيلة فعالة لمعالجة التعبير الجيني أثناء نمو الخلايا التائية الطبيعية وتكوين الكريات البيض وقد ثبت أنه طريقة فعالة للحث أو تثبيط وظيفة الجين محلالاهتمام 15،16،17. تم استخدام هذا النموذج بنجاح خاص لدراسة التعاون بين الجينات المسرطنة التي تقود سرطان الدم15 لأنه مرن ويتيح فحص آثار مجموعات جينية متعددة في وقت معقول ، على عكس توليد الفئران المعدلة وراثيا. علاوة على ذلك ، تم استخدام نماذج مماثلة سابقا لتقييم آثار إدخال الجينات المسرطنة في الخلايا الطبيعية15،16،17. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب نقل الفيروسات القهقرية تقسيم الخلايا لتكامل الجينات المحورة18 ، وبينما سيتغلب نقل الفيروسات العدسية على هذا القيد من خلال القضاء على الحاجة إلى تقسيم الخلايا لتكامل الجينات المحورة ، لم نتمكن من تحقيق النقل الناجح لخلايا الغدة الصعترية DN باستخدام ناقلات الفيروسات العدسية. وبالتالي ، فإن OP9-DL1 / DL4 هو أداة مناسبة لزراعة الخلايا السلفية المكونة للدم.
يتضمن البروتوكول القياسي لتكوين اللمفاويات للخلايا الصعترية المحولة على OP9-DL4 سلسلة من الخطوات المنسقة التي يجب تنفيذها بعناية لتحقيق نتيجة ناجحة. على الرغم من أن هذه التقنيات كانت تخدم المجتمع بشكل جيد لسنوات عديدة ، إلا أن البروتوكولات المتاحة في الأدبيات غالبا ما تكون مجزأة. ونتيجة لذلك، يضطر كل مختبر إلى تكييف المراحل المختلفة من الإجراء وتحسينها، الأمر الذي قد يستغرق وقتا طويلا. هنا ، يصف هذا البروتوكول عزل الخلايا الصعترية DN من الغدة الصعترية للفأر ، يليها نقل الفيروسات القهقرية والاستزراع المشترك على الخلايا اللحمية OP9-DL4 لمزيد من التحليل الوظيفي. وقد ثبت أن هذا البروتوكول المعمول به فعال وقابل للتكرار في تحويل الخلايا الصعترية الأولية ، يليه التمايز على خلايا OP9-DL4 أو تحريض سرطان الدم الليمفاوي الحاد للخلايا التائية15.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تطوير البروتوكول الموصوف هنا خصيصا لدراسات الخلايا التائية DN المشتقة من الغدة الصعترية (CD4− / CD8−) مع نقل الفيروسات القهقرية متبوعا بنموذج تمايز OP9-DL4. ومع ذلك ، فمن المحتمل أن الخلايا المستهدفة التي ستخضع لبروتوكول التنبيغ هذا متبوعا بتمايز الخلايا سيكون لها فائدة متعددة التخصصات أوسع. وبالتالي ، بالإضافة إلى الخلايا الصعترية غير الناضجة ، يمكن استخدام الخلايا الجذعية المكونة للدم ، مثل الخلايا المشتقة من كبد الجنين أو نخاع العظام ، في هذا البروتوكول.
أثبت نظام OP9-DL4 أنه نموذج فعال لدراسة وظيفة الجينات في مجموعة متنوعة من الجوانب ، بما في ذلك تمايز الخلايا17 وتكوين الأورام15. في حين أن التعديل العكسي للفيروسات الرجعية للأسلاف المكونة للدم هو تقنية راسخة تمكن من التعديل الوراثي المستقر ، فإن الجمع بين تحريض تمايز الخلايا على نظام OP9-DL4 ونقل الفيروسات القهقرية يتطلب العناية والمهارة. الجانب الحاسم لتحقيق النجاح مع هذا البروتوكول هو ضمان تنسيق جميع الخطوات بشكل جيد ، حيث يتضمن البروتوكول استخدام ثلاثة أنواع مختلفة من الخلايا التي يجب الحفاظ عليها صحية وفي التقاء مثالي مطلوب لكل مرحلة محددة. مع وضع ذلك في الاعتبار ، من المهم إجراء جميع تحليلات نقاط تفتيش مراقبة الجودة بعد تنفيذ كل خطوة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. سيضمن ذلك أن جميع الخطوات تعمل. لذلك ، يعد التحقق من كفاءة الاستنفاد والنقل والنقل أمرا مهما للتنفيذ الناجح لهذا البروتوكول (انظر النتيجة النموذجية لكفاءة النقل في الشكل 4). ترتبط كفاءة نقل الخلايا الأولية الجيدة بعيار فيروسي عالي. عادة ، تؤدي الحشوات الأكبر إلى انخفاض عيار الفيروس18. لأغراض التدريب ، نستخدم متجه فارغ لتمثيل النتائج التي يمكن الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول. في تجربتنا ، تختلف كفاءات النقل والنقل وفقا لحجم الإدراج ، لا سيما بالنظر إلى جينات مراسل العمود الفقري الفيروسي ، مثل GFP. تتمثل إحدى الاستراتيجيات التي يمكن استخدامها عند دراسة تفاعل أكثر من جين واحد في استنساخ كل جين في ناقل نقل مختلف ، يليه إنتاج الفيروس الفردي ، وأخيرا النقل المشترك للخلية المستهدفة. في هذه الحالة ، يمكن تطبيق خطوة اختيار لإزالة الخلايا المنقولة بشكل فردي والاحتفاظ فقط بالخلايا المتحولة بشكل مشترك.
تجدر الإشارة إلى أن غالبية خطوط خلايا طبقة التغذية اللحمية OP9-DL1 / DL4 قد تمت هندستها وراثيا للتعبير عن GFP كجزء من تركيبات DL1 أو DL47. في هذا البروتوكول ، استخدمنا ناقلا للفيروسات القهقرية يعبر أيضا عن GFP. ومع ذلك ، فهو أكثر إشراقا من بروتين GFP الذي تعبر عنه خلايا OP9-DL4 ولا يتداخل مع فحص النقل عند تصور الثقافة المشتركة تحت المجهر الفلوري.
تتمايز خلايا OP9 إلى خلايا دهنية بعد العديد من الممرات ، أو فترات طويلة في الثقافة ، أو في ظل ظروف الالتقاء المفرط19. يتضح هذا من خلال تطور فجوات كبيرة. وبالتالي ، لا ينبغي استخدام خلايا OP9 التي تقدم هذه الخصائص في هذا البروتوكول. سيؤدي نقل الخلايا المنتجة للفيروسات القهقرية شديدة التلاشي إلى انخفاض عيار الفيروس. في الواقع ، المرحلة الفرعية هي عندما تكون الخلايا أكثر قابلية للنقل. علاوة على ذلك ، فإن نقل الخلايا المنتجة للفيروسات القهقرية منخفضة الالتقاء سيقلل من إجهاد الخلية في عملية النقل ويعطي أعلى عيار للفيروس.
بينما ، في هذا البروتوكول ، لا نقوم بمعايرة طاف الفيروس ، يجب مراعاة معايرة طاف الفيروس في بعض الحالات ، مثل عدم وجود جين مراسل في ناقل الفيروسات القهقرية ، مما يمنع التحديد غير المباشر للإنتاج الفيروسي ، أو في الحالات التي يتطلب فيها التصميم التجريبي عددا أكثر دقة من نسخ الجينات المحورة ليتم دمجها في جينوم الخلية المستهدفة. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن عيار طافية ناقل الفيروسات القهقرية ينخفض بشكل كبير عند تخزينه عند -80 درجة مئوية أو 4 درجات مئوية حتى يتم الحصول على نتائج المعايرة. لذلك ، فإن استخدام طاف الفيروس الطازج للتنبيغ سيؤدي إلى كفاءة نقل أفضل.
تحتوي الغدة الصعترية على عدد كبير من الخلايا الصعترية المزدوجة الإيجابية (DP) (أكثر من 85٪) وحوالي 10٪ من الخلايا الأحادية الإيجابية15 (CD4 أو CD8) ، وهي خلايا الغدة الصعترية في مرحلة ما بعد DN. لا يمكن لخلايا DP البقاء على قيد الحياة في المختبر للتلاعب بالفيروسات القهقرية ، في حين أن خلايا SP غير قابلة للتحويل. لذلك ، يمكن تطبيق هذا البروتوكول لتوليد خلايا الغدة الصعترية DN القابلة للنقل من ناقلات الفيروسات القهقرية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل البرنامج الداخلي للمعهد الوطني للسرطان ، مشروع ZIABC009287. تم الحصول على OP9-DL4 من الدكتور خوان كارلوس زونيغا بفلوكر (مركز سانيبروك للعلوم الصحية ، تورنتو ، أونتاريو ، كندا). يشكر المؤلفون برنامج علوم مختبر NCI-Frederick على مساعدتهم الفنية المستمرة ونصائحهم ومدخلاتهم التجريبية ، وكذلك جيف كاريل وميغان كاروان وكيمبرلي كلارمان للمساعدة في قياس التدفق الخلوي. نحن ممتنون لهوارد يونغ على المشورة والمدخلات الهامة.
Materials
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| ACK Lysis buffer | Lonza | 10-548E | |
| BSA | Cell Signaling Technology | 9998S | |
| CD4 Microbeads | Miltenyi | 130-049-201 | |
| CD8 Microbeads | Miltenyi | 130-049-401 | |
| Centrifuge 5910R | eppendorf | 5942IP802353 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Fetal calf serum HyClone FBS | ThermoScientific | SH30910.03 | |
| LD columns | Miltenyi | 130-042-901 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | Freeze glutamine in aliquots and use freshly-thawed glutamine |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | P/N 52887 | |
| MEM-alpha Medium | Gibco | 12561-072 | |
| OPTI-MEM I Reducing Serum Medium | Invitrogen | 31985-062 | |
| PBS pH 7.2 | Corning | 21-040-CV | |
| pcL-Eco Plasmid | Addgene | 12371 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pMIG Plasmid | Addgene | 6492 | |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
| Pre-Separation Filters | Miltenyi | 130-041-407 | |
| recombinant hFLT-3L | PeproTech | 300-19 | |
| recombinant IL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| Retrovial packaging cell line Phoenix-Eco | Orbigen | RVC-10002 | |
| Syringe filter (0.45 µm) | Millipore | SLHV033RS |
References
- Zuniga-Pflucker, J. C. T-cell development made simple. Nature Reviews Immunology. 4 (1), 67 (2004).
- Kodama, H., Nose, M., Niida, S., Nishikawa, S., Nishikawa, S. Involvement of the c-kit receptor in the adhesion of hematopoietic stem cells to stromal cells. Experimental Hematology. 22 (10), 979-984 (1994).
- Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science. 265 (5175), 1098-1101 (1994).
- Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. In vitro development of primitive and definitive erythrocytes from different precursors. Science. 272 (5262), 722-724 (1996).
- Ueno, H., et al. A stromal cell-derived membrane protein that supports hematopoietic stem cells. Nature Immunology. 4 (5), 457-463 (2003).
- Jaleco, A. C., et al. Differential effects of Notch ligands Delta-1 and Jagged-1 in human lymphoid differentiation. Journal of Experimental Medicine. 194 (7), 991-1002 (2001).
- Mohtashami, M., et al. Direct comparison of Dll1- and Dll4-mediated Notch activation levels shows differential lymphomyeloid lineage commitment outcomes. Journal of Immunology. 185 (2), 867-876 (2010).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17 (6), 749-756 (2002).
- Mazzucchelli, R., Durum, S. K. Interleukin-7 receptor expression: Intelligent design. Nature Reviews Immunology. 7 (2), 144-154 (2007).
- Robey, E. A., Bluestone, J. A. Notch signaling in lymphocyte development and function. Current Opinion in Immunology. 16 (3), 360-366 (2004).
- Lavaert, M., et al. Integrated scRNA-Seq identifies human postnatal thymus seeding progenitors and regulatory dynamics of differentiating immature thymocytes. Immunity. 52 (6), 1088-1104 (2020).
- Roh, K. H., Roy, K. Engineering approaches for regeneration of T lymphopoiesis. Biomaterials Research. 20 (20), (2016).
- Zlotoff, D. A., et al. CCR7 and CCR9 together recruit hematopoietic progenitors to the adult thymus. Blood. 115 (10), 1897-1905 (2010).
- Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: Generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (2), (2009).
- Cramer, S. D., et al. Mutant IL-7Ralpha and mutant NRas are sufficient to induce murine T cell acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 32 (8), 1795-1882 (2018).
- Treanor, L. M., et al. Interleukin-7 receptor mutants initiate early T cell precursor leukemia in murine thymocyte progenitors with multipotent potential. Journal of Experimental Medicine. 211 (4), 701-713 (2014).
- Yokoyama, K., et al. In vivo leukemogenic potential of an interleukin 7 receptor alpha chain mutant in hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 122 (26), 4259-4263 (2013).
- Simmons, A., Alberola-Ila, J. Retroviral transduction of T cells and T cell precursors. Methods in Molecular Biology. 1323, 99-108 (2016).
- . Retroviral systems Available from: https://web.stanford.edu/group/nolan/_OldWebsite/retroviral_systems/retsys.html (2022)
- Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells. Journal of Visualized Experiments. (90), e51780 (2014).
- Gray, D. H., et al. Developmental kinetics, turnover, and stimulatory capacity of thymic epithelial cells. Blood. 108 (12), 3777-3785 (2006).
- Godfrey, D. I., Kennedy, J., Suda, T., Zlotnik, A. A developmental pathway involving four phenotypically and functionally distinct subsets of CD3-CD4-CD8- triple-negative adult mouse thymocytes defined by CD44 and CD25 expression. Journal of Immunology. 150 (10), 4244-4252 (1993).
- Wang, Y. B., Edinger, M., Mittar, D., McIntyre, C. Studying mouse thymocyte development using multiparametric flow cytometry: An efficient method to improve an 8-color panel on the BD FACSVerse™ system. BD Biosciences–Application Note. , (2012).
- Sakaguchi, N., et al. Altered thymic T-cell selection due to a mutation of the ZAP-70 gene causes autoimmune arthritis in mice. Nature. 426 (6965), 454-460 (2003).
- He, X., Park, K., Kappes, D. J. The role of ThPOK in control of CD4/CD8 lineage commitment. Annual Review of Immunology. 28, 295-320 (2010).
- Wang, Y., et al. A conserved CXXC motif in CD3epsilon is critical for T cell development and TCR signaling. PLoS Biology. 7 (12), e1000253 (2009).
- Aliahmad, P., Kadavallore, A., de la Torre, B., Kappes, D., Kaye, J. TOX is required for development of the CD4 T cell lineage gene program. Journal of Immunology. 187 (11), 5931-5940 (2011).
