Kokultur und Transduktion von murinen Thymozyten auf Delta-ähnlichen 4-exprimierenden Stromazellen zur Untersuchung von Onkogenen bei T-Zell-Leukämie
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von doppelt negativen Thymozyten aus dem Thymus der Maus, gefolgt von retroviraler Transduktion und Co-Kultur auf dem delta-like 4-exprimierenden Knochenmark-Stroma-Zelllinien-Co-Kultursystem (OP9-DL4) zur weiteren funktionellen Analyse.
Abstract
Transduzierte unreife Thymozyten der Maus können in vitro mit Hilfe des delta-like 4-exprimierenden Knochenmark-Stromazelllinien-Kokultursystems (OP9-DL4) in T-Zellen differenziert werden. Da die retrovirale Transduktion die Teilung von Zellen für die Transgenintegration erfordert, bietet OP9-DL4 eine geeignete in vitro Umgebung für die Kultivierung hämatopoetischer Vorläuferzellen. Dies ist besonders vorteilhaft, wenn es darum geht, die Auswirkungen der Expression eines bestimmten Gens während der normalen T-Zell-Entwicklung und der Leukämogenese zu untersuchen, da es den Forschern ermöglicht, den zeitaufwändigen Prozess der Erzeugung transgener Mäuse zu umgehen. Um erfolgreiche Ergebnisse zu erzielen, muss eine Reihe von koordinierten Schritten, bei denen verschiedene Zelltypen gleichzeitig manipuliert werden, sorgfältig durchgeführt werden. Obwohl es sich um sehr gut etablierte Verfahren handelt, bedeutet das Fehlen einer gemeinsamen Quelle in der Literatur oft, dass eine Reihe von Optimierungen erforderlich sind, die zeitaufwändig sein können. Dieses Protokoll hat sich als effizient bei der Transduktion von primären Thymozyten mit anschließender Differenzierung auf OP9-DL4-Zellen erwiesen. Hier finden Sie ein Protokoll, das als schneller und optimierter Leitfaden für die Co-Kultur von retroviral transduzierten Thymozyten auf OP9-DL4-Stromazellen dienen kann.
Introduction
Die OP9-Knochenmark-Stromazelllinie stellt ein nützliches In-vitro-System für die Induktion der Lymphopoese aus verschiedenen Quellen von Vorläuferzellendar 1. Die ersten Studien, in denen OP9-Zellen verwendet wurden, zeigten, dass das Fehlen der Expression des Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors (MCSF) zur Fähigkeit der OP9-Zelllinie beitrug, die Hämatopoese und die Differenzierung von B-Zellen aus dem Knochenmark zu unterstützen, wie später auch für embryonale Stammzellen (ESCs)2,3,4,5 . In vorangegangenen Studien ermöglichte die Generierung von delta-ähnlichen 1/4-exprimierenden OP9-Zellen (OP9-DL1/OP9-DL4) die Induktion der T-Zell-Linienbindung6 und demonstrierte die Fähigkeit, die Thymusreifung erfolgreich zu rekapitulieren 7,8. Kurz gesagt wurde die Entwicklung von T-Zellen durch die sequentielle Expression von CD4- und CD8-Molekülen beschrieben. Unreife Thymozyten sind “doppelnegativ” (DN, CD4− CD8−) und können entsprechend der Oberflächenexpression von CD44 und CD25 weiter unterteilt werden. DN-Thymozyten differenzieren sich durch das unreife Single-Positive-Stadium (ISP), das durch die CD8-Expression in Mäusen und CD4 im Menschen gekennzeichnet ist, gefolgt vom Double-Positive-Stadium (DP), das durch die Koexpression von CD4 und CD8 gekennzeichnet ist, und schließlich durch das reife Single-Positive-Stadium, das durch die Expression von CD4 oder CD8 gekennzeichnet ist9. HSCs exprimieren den Notch1-Rezeptor, der normalerweise mit dem Delta-like 4 (DL4) interagiert, das auf Thymusepithelzellen exprimiert wird, um die Differenzierung der T-Linie zu induzieren10. Daher hat das Interesse am OP9-DL1/4-Modell schrittweise zugenommen, was dazu geführt hat, dass dieser Ansatz in den letzten zwei Jahrzehnten in einer Vielzahl von Anwendungen in großem Umfang eingesetzt wurde 8,11,12,13. Obwohl DL1 und DL4 beide in der Lage sind, die T-Zell-Differenzierung in vitro zu unterstützen, zeigen sie in vivo unterschiedliche Anforderungen, und einige Studien deuten darauf hin, dass OP9_DL4 bei der Rekapitulation der Thymusumgebung der Maus effizienter ist als OP9_DL1 7,14.
Unter den möglichen Anwendungen des OP9-DL1/4-Systems besteht besonderes Interesse an der Kombination dieses Systems mit der Transduktion von DN-Zellen oder HSCs mit retroviralen Vektoren. Diese Kombination ist ein effektiver Weg, um die Genexpression während der normalen T-Zell-Entwicklung und Leukämiegenese zu manipulieren, und hat sich als effiziente Methode erwiesen, um die Funktion eines Gens von Interesse zu induzieren oder zu hemmen15,16,17. Dieses Modell wurde besonders erfolgreich eingesetzt, um die Zusammenarbeit zwischen den Onkogenen zu untersuchen, die die Leukämieantreiben 15, da es flexibel ist und es ermöglicht, die Auswirkungen mehrerer Genkombinationen in angemessener Zeit zu untersuchen, im Gegensatz zur Erzeugung transgener Mäuse. Darüber hinaus wurden ähnliche Modelle bereits verwendet, um die Auswirkungen der Einführung von Onkogenen in normale Zellen zu beurteilen15,16,17. Darüber hinaus erfordert die retrovirale Transduktion die Teilung von Zellen für die Transgenintegration18, und während die lentivirale Transduktion diese Einschränkung überwinden würde, indem sie die Notwendigkeit von sich teilenden Zellen für die Transgenintegration eliminieren würde, konnten wir die erfolgreiche Transduktion von DN-Thymozyten mit lentiviralen Vektoren nicht erreichen. Somit ist OP9-DL1/DL4 ein geeignetes Werkzeug für die Züchtung hämatopoetischer Vorläuferzellen.
Das Standardprotokoll für die Lymphopoese von transduzierten Thymozyten auf OP9-DL4 umfasst eine Reihe von koordinierten Schritten, die sorgfältig durchgeführt werden müssen, um ein erfolgreiches Ergebnis zu erzielen. Obwohl es sich um Techniken handelt, die der Gemeinschaft seit vielen Jahren gute Dienste leisten, sind die in der Literatur verfügbaren Protokolle oft fragmentiert. Infolgedessen ist jedes Labor gezwungen, verschiedene Phasen des Verfahrens anzupassen und zu optimieren, was zeitaufwändig sein kann. In dieser Arbeit beschreibt dieses Protokoll die Isolierung von DN-Thymozyten aus dem Thymus der Maus, gefolgt von retroviraler Transduktion und Co-Kultur auf OP9-DL4-Stromazellen zur weiteren funktionellen Analyse. Dieses etablierte Protokoll hat sich als effizient und reproduzierbar bei der Transduktion von primären Thymozyten erwiesen, gefolgt von der Differenzierung auf OP9-DL4-Zellen oder der Induktion der akuten lymphatischen T-Zell-Leukämie15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll wurde speziell für Thymus-abgeleitete DN (CD4−/CD8−) T-Zell-Studien mit retroviraler Transfektion gefolgt von einem OP9-DL4-Differenzierungsmodell entwickelt. Es ist jedoch wahrscheinlich, dass die Zielzellen, die diesem Transduktionsprotokoll mit anschließender Zelldifferenzierung unterzogen werden, einen breiteren interdisziplinären Nutzen haben werden. Daher könnten neben unreifen Thymozyten auch hämatopoetische Stammzellen, wie z. B. Zellen, die entweder aus der fetalen Leber oder dem Knochenmark stammen, in diesem Protokoll verwendet werden.
Das OP9-DL4-System hat sich als effektives Modell erwiesen, um die Genfunktion in einer Vielzahl von Aspekten zu untersuchen, einschließlich der Zelldifferenzierung17 und der Onkogenese15. Während die retrovirale Modifikation hämatopoetischer Vorläuferzellen eine etablierte Technik ist, die eine stabile genetische Modifikation ermöglicht, erfordert die Kombination der Induktion der Zelldifferenzierung auf dem OP9-DL4-System und der retroviralen Transduktion Sorgfalt und Geschicklichkeit. Der entscheidende Aspekt, um mit diesem Protokoll erfolgreich zu sein, besteht darin, sicherzustellen, dass alle Schritte gut koordiniert sind, da das Protokoll die Verwendung von drei verschiedenen Zelltypen beinhaltet, die gesund und auf der idealen Konfluenz gehalten werden müssen, die für jede spezifische Phase erforderlich ist. Vor diesem Hintergrund ist es wichtig, alle Checkpoint-Analysen der Qualitätskontrolle nach der Ausführung jedes Schritts durchzuführen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Dadurch wird sichergestellt, dass alle Schritte funktionieren. Daher ist die Überprüfung der Verarmungs-, Transfektions- und Transduktionseffizienz wichtig für die erfolgreiche Ausführung dieses Protokolls (siehe ein typisches Ergebnis für die Transduktionseffizienz in Abbildung 4). Eine gute Transduktionseffizienz der Primärzellen ist mit einem hohen Virustiter verbunden. Typischerweise führen größere Einsätze zu niedrigeren Virustitern18. Zu Trainingszwecken verwenden wir einen leeren Vektor, um die Ergebnisse darzustellen, die mit diesem Protokoll erzielt werden können. Unserer Erfahrung nach variieren die Transduktions- und Transfektionseffizienzen je nach Insertgröße, insbesondere unter Berücksichtigung der viralen Backbone-exprimierenden Reportergene wie GFP. Eine Strategie, die bei der Untersuchung der Interaktion von mehr als einem Gen angewendet werden kann, besteht darin, jedes Gen in einen anderen Übertragungsvektor zu klonen, gefolgt von der individuellen Virusproduktion und schließlich der Co-Transduktion der Zielzelle. In diesem Fall kann ein Selektionsschritt angewendet werden, um die einfach transduzierten Zellen zu eliminieren und nur die co-transduzierten Zellen zu behalten.
Es ist erwähnenswert, dass die Mehrheit der OP9-DL1/DL4-Stroma-Feeder-Layer-Zelllinien gentechnisch so verändert wurde, dass sie GFP als Teil der DL1- oder DL4-Konstrukte exprimieren7. In diesem Protokoll verwendeten wir einen retroviralen Vektor, der auch GFP exprimiert; Es ist jedoch heller als das GFP-Protein, das von OP9-DL4-Zellen exprimiert wird, und stört die Transduktionsinspektion nicht, wenn die Co-Kultur unter dem Fluoreszenzmikroskop sichtbar wird.
OP9-Zellen differenzieren sich nach vielen Passagen, langen Perioden in Kultur oder unter Bedingungen einer Überkonfluenz zu Adipozyten19. Dies zeigt sich in der Entwicklung großer Vakuolen. Daher sollten OP9-Zellen, die diese Eigenschaften aufweisen, in diesem Protokoll nicht verwendet werden. Die Transfizierung von übermäßig konfluenten Retrovirus-produzierenden Zellen führt zu einem niedrigen Virustiter. In der Tat ist das subkonfluente Stadium die Phase, in der die Zellen am besten transfiktierbar sind. Darüber hinaus verringert die Transfektion von Retrovirus-produzierenden Zellen mit geringer Konfluenz den Zellstress im Transfektionsprozess und liefert den höchsten Virustiter.
Während wir in diesem Protokoll den Virusüberstand nicht titrieren, muss in einigen Fällen eine Titration des Virusüberstands in Betracht gezogen werden, z. B. wenn kein Reportergen im retroviralen Vektor vorhanden ist, was die indirekte Bestimmung der Virusproduktion verhindern würde, oder in Fällen, in denen das Versuchsdesign eine genauere Anzahl der Transgenkopien erfordert, die in das Genom der Zielzelle integriert werden müssen. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass der Titer des retroviralen Vektorüberstandes signifikant abnimmt, wenn er bei −80 °C oder 4 °C gelagert wird, bis die Titrationsergebnisse vorliegen. Daher führt die Verwendung eines frisch zubereiteten Virusüberstands für die Transduktion zu einer besseren Transduktionseffizienz.
Der Thymus enthält eine große Anzahl von doppelt positiven (DP) Thymozyten (mehr als 85 %) und etwa 10 % einfach positive15 Zellen (CD4 oder CD8), die die Thymozyten nach dem DN-Stadium sind. Die DP-Zellen können in vitro für retrovirale Manipulation nicht überleben, während die SP-Zellen nicht transduzierbar sind. Daher kann dieses Protokoll angewendet werden, um retrovirale Vektor-transduzierbare DN-Thymozyten zu generieren.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das intramurale Programm des National Cancer Institute, Projekt ZIABC009287, unterstützt. OP9-DL4 wurde von Dr. Juan Carlos Zúñiga-Pflücker (Sunnybrook Health Sciences Centre, Toronto, ON, Kanada) erhalten. Die Autoren danken dem NCI-Frederick Laboratory Animal Sciences Program für ihre kontinuierliche technische Unterstützung und experimentelle Beratung und ihren Input sowie Jeff Carrel, Megan Karwan und Kimberly Klarmann für die Unterstützung bei der Durchflusszytometrie. Wir danken Howard Young für kritische Ratschläge und Anregungen.
Materials
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| ACK Lysis buffer | Lonza | 10-548E | |
| BSA | Cell Signaling Technology | 9998S | |
| CD4 Microbeads | Miltenyi | 130-049-201 | |
| CD8 Microbeads | Miltenyi | 130-049-401 | |
| Centrifuge 5910R | eppendorf | 5942IP802353 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Fetal calf serum HyClone FBS | ThermoScientific | SH30910.03 | |
| LD columns | Miltenyi | 130-042-901 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | Freeze glutamine in aliquots and use freshly-thawed glutamine |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | P/N 52887 | |
| MEM-alpha Medium | Gibco | 12561-072 | |
| OPTI-MEM I Reducing Serum Medium | Invitrogen | 31985-062 | |
| PBS pH 7.2 | Corning | 21-040-CV | |
| pcL-Eco Plasmid | Addgene | 12371 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pMIG Plasmid | Addgene | 6492 | |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
| Pre-Separation Filters | Miltenyi | 130-041-407 | |
| recombinant hFLT-3L | PeproTech | 300-19 | |
| recombinant IL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| Retrovial packaging cell line Phoenix-Eco | Orbigen | RVC-10002 | |
| Syringe filter (0.45 µm) | Millipore | SLHV033RS |
References
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