Studio delle funzioni e delle attività del co-trasportatore neuronale K-Cl KCC2 mediante Western Blotting

I cotrasportatori di cloruro di potassio 2 (KCC2) sono un membro della famiglia dei trasportatori di soluti 12 (SLC12) dei cotrasportatori catione-cloruro-cloruro (CCC), che si trovano esclusivamente nel neurone ed è essenziale per il corretto funzionamento dell’omeostasi della Cl^– e di conseguenza l’inibizione funzionale GABAergica 1,2,3,4. Il mantenimento di una bassa concentrazione intraneuronale di Cl- ([Cl-]_i) a 4-6 mM da parte di KCC2 facilita l’iperpolarizzazione dell’acido ^{γ-aminobutirrico} (GABA)/glicina e l’inibizione sinaptica nel cervello e nel midollo spinale⁵. Il fallimento nella corretta regolazione di KCC2 è stato associato alla prevalenza di diverse malattie neurologiche, tra cui l’epilessia⁴. Inoltre, la diminuzione dell’estrusione di Cl⁻ mediata da KCC2 e le alterate correnti iperpolarizzanti GABA_A e/o mediate dal recettore della glicina sono state implicate nell’epilessia, nel dolore neuropatico e nella spasticità ^6,7. Il KCC2 neuronale è modulato negativamente attraverso la fosforilazione di residui regolatori chiave all’interno del suo dominio intracellulare C-terminale^{dal complesso di} segnalazione della chinasi 1 senza lisina (WNK)-STE20/SPS1 correlato alla prolina/alanina (SPAK)/Oxidative stress-responsive (OSR), che facilita il mantenimento dell’attività depolarizzata del GABA nei neuroni immaturi ^2,8,9 . Il WNK-SPAK/OSR1 fosforila i residui di treonina 906 e 1007 (Thr906/Thr1007) e successivamente sottoregola l’espressione genica dell’mRNA di KCC2, portando ad un conseguente deterioramento della sua funzione fisiologica ^8,10. Ancora più importante, tuttavia, è già un dato di fatto che il complesso chinasico WNK-SPAK/OSR1 è noto per fosforilare e inibire l’espressione di KCC2 1,2,4,11,12, e che l’inibizione delle vie di segnalazione del complesso chinasico al fosforilato Thr906/Thr1007 è stata collegata con l’aumentata espressione del gene mRNA KCC2 ^13,14,15 . È importante notare che la regolazione dell’espressione neuronale dei cotrasportatori KCC2 e Na+-K⁺-2Cl^– 1 (NKCC1) attraverso la fosforilazione proteica funziona in concomitanza e in pattern inversi 1,4,16.

Sono stati compiuti progressi consistenti e considerevoli per quanto riguarda la comprensione dei meccanismi coinvolti nella regolazione del KCC2, accreditato allo sviluppo di tecniche che consentano ai ricercatori di studiarne le funzioni e le attività; tramite indagini dirette (valutazione della fosforilazione dei siti regolatori delle chinasi) o indirette (osservazione e monitoraggio dell’attività GABA). Il protocollo qui presentato evidenzia l’applicazione di tecniche di western blotting per studiare le funzioni e le attività del co-trasportatore neuronale K⁺-Cl^– KCC2 studiando la fosforilazione del cotrasportatore nei siti regolatori delle chinasi Thr906/1007.

Western blot è un metodo utilizzato per rilevare specifiche proteine di interesse da un campione di tessuto o cellula. Questo metodo separa prima le proteine per dimensione attraverso l’elettroforesi. Le proteine vengono quindi trasferite elettroforeticamente su un supporto solido (di solito una membrana) prima che la proteina bersaglio venga marcata utilizzando un anticorpo specifico. Gli anticorpi sono coniugati a diversi tag o anticorpi coniugati con fluorofori che vengono rilevati utilizzando metodi colorimetrici, chemiluminescenza o fluorescenza. Ciò consente di rilevare una specifica proteina bersaglio da una miscela di proteine. Questa tecnica è stata utilizzata per caratterizzare i siti fosfospecifici di KCCs¹ ed è stata utilizzata per identificare inibitori delle chinasi che inibiscono la fosforilazione di KCC3 Thr991/Thr1048¹⁷. Seguendo questo protocollo, si può rilevare specificamente KCC2 totale e fosforilato da lisati cellulari/tissutali. In linea di principio, la rilevazione di anticorpi coniugati con proteine mediante questa tecnica è altamente strumentale in quanto aiuta a migliorare la comprensione delle attività cooperative nei fosfo-siti di KCC2, che fa luce sui meccanismi molecolari coinvolti nelle loro regolazioni fisiologiche. L’analisi quantitativa dell’espressione proteica totale è rappresentativa della funzione e dell’attività di KCC2. Esistono altri metodi classici utilizzati per misurare direttamente l’attività di KCC2, come lo ione rubidio e il saggio di assorbimento degli ioni tallio. Ulteriori tecniche come patch-clamp-elettrofisiologia sono utilizzate per misurare l’attività GABA; quindi, riflettendo indirettamente KCC2 attivato e/o inattivato come informato dalla valutazione dell’omeostasi intracellulare degli ioni cloruro.