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Biochemistry

Untersuchung der Funktionen und Aktivitäten des neuronalen K-Cl-Co-Transporters KCC2 mittels Western Blotting

Published: December 09, 2022
doi:
10.3791/64179
, , ,
1Institute of Biomedical and Clinical Sciences, Medical School, Faculty of Health and Life Sciences,University of Exeter, Hatherly Laboratories

Summary

Das vorliegende Protokoll hebt die Anwendung der Western-Blotting-Technik hervor, um die Funktionen und Aktivitäten des neuronalen K-Cl-Co-Transporters KCC2 zu untersuchen. Das Protokoll beschreibt die Untersuchung der KCC2-Phosphorylierung an Kinase-regulatorischen Stellen Thr906/1007 mittels Western Blotting. Außerdem werden zusätzliche Methoden zur Bestätigung der KCC2-Aktivität in diesem Text kurz hervorgehoben.

Abstract

Kaliumchlorid-Cotransporter 2 (KCC2) sind ein Mitglied der gelösten Trägerfamilie 12 (SLC12) von Kation-Chlorid-Cotransportern (CCCs), die ausschließlich im Neuron vorkommen und für das reibungslose Funktionieren der Cl-Homöostase und folglich für die funktionelle GABAerge Hemmung unerlässlich sind. Das Versagen bei der richtigen Regulierung von KCC2 ist schädlich und wurde mit der Prävalenz mehrerer neurologischer Erkrankungen, einschließlich Epilepsie, in Verbindung gebracht. Es wurden beträchtliche Fortschritte beim Verständnis der Mechanismen erzielt, die an der Regulierung von KCC2 beteiligt sind, die für die Entwicklung von Techniken verantwortlich sind, die es Forschern ermöglichen, seine Funktionen und Aktivitäten zu untersuchen; entweder durch direkte (Beurteilung der Phosphorylierung von Kinase-regulatorischen Stellen) oder indirekte (Beobachtung und Überwachung der GABA-Aktivität) Untersuchungen. Hier zeigt das Protokoll, wie die KCC2-Phosphorylierung an Kinase-regulatorischen Stellen – Thr906 und Thr1007 – mit der Western-Blotting-Technik untersucht werden kann. Es gibt andere klassische Methoden, die verwendet werden, um die KCC2-Aktivität direkt zu messen, wie Rubidium-Ionen- und Thallium-Ionen-Aufnahme-Assay. Weitere Techniken wie Patch-Clamp-Elektrophysiologie werden zur Messung der GABA-Aktivität eingesetzt; Daher indirekt reflektiert aktiviertes und/oder inaktiviertes KCC2, wie durch die Beurteilung der intrazellulären Chloridionenhomöostase informiert. Einige dieser zusätzlichen Techniken werden in diesem Manuskript kurz diskutiert.

Introduction

Kaliumchlorid-Cotransporter 2 (KCC2) ist ein Mitglied der gelösten Trägerfamilie 12 (SLC12) von Kation-Chlorid-Cotransportern (CCCs), die ausschließlich im Neuron vorkommen und für das reibungslose Funktionieren der Cl-Homöostase und folglich für die funktionelle GABAerge Hemmung 1,2,3,4 unerlässlich sind. Die Aufrechterhaltung einer niedrigen intraneuronalen Cl-Konzentration ([Cl-]i) bei 4-6 mM durch KCC2 erleichtert die Hyperpolarisation von γ-Aminobuttersäure (GABA)/Glycin und die synaptische Hemmung im Gehirn und Rückenmark 5. Das Versagen bei der richtigen Regulation von KCC2 wurde mit der Prävalenz mehrerer neurologischer Erkrankungen, einschließlich Epilepsie4, in Verbindung gebracht. Darüber hinaus wurden verminderte KCC2-vermittelte Cl−-Extrusion und gestörte hyperpolarisierendeGABA-A– und/oder Glycinrezeptor-vermittelte Ströme mit Epilepsie, neuropathischen Schmerzen und Spastik in Verbindung gebracht 6,7. Neuronales KCC2 wird durch Phosphorylierung wichtiger regulatorischer Reste innerhalb seiner C-terminalen intrazellulären Domäne durch den mit No-Lysin (WNK)-STE20/SPS1-verwandten Prolin/Alanin-reichen (SPAK)/Oxidative Stress-responsive (OSR) Kinase-Signalkomplex1 negativ moduliert, was die Aufrechterhaltung der depolarisierten GABA-Aktivität in unreifen Neuronen erleichtert 2,8,9 . Der WNK-SPAK/OSR1 phosphoryliert die Threoninreste 906 und 1007 (Thr906/Thr1007) und reguliert anschließend die mRNA-Genexpression von KCC2 herunter, was zu einer Verschlechterung seiner physiologischen Funktion führt 8,10. Noch wichtiger ist jedoch, dass es bereits eine Tatsache ist, dass der WNK-SPAK/OSR1-Kinase-Komplex dafür bekannt ist, die KCC2-Expression 1,2,4,11,12 zu phosphorylieren und zu hemmen, und dass die Hemmung der Kinase-Komplex-Signalwege zum Phosphorylat Thr906/Thr1007 mit der erhöhten Expression des KCC2-mRNA-Gens in Verbindung gebracht wurde13,14,15 . Es ist wichtig zu beachten, dass die Regulation der neuronalen KCC2- und Na+-K+–2Cl-Cotransporter 1 (NKCC1) Expression über Proteinphosphorylierung gleichzeitig und in umgekehrten Mustern 1,4,16 funktioniert.

Es wurden beständige und beträchtliche Fortschritte beim Verständnis der Mechanismen erzielt, die an der Regulierung von KCC2 beteiligt sind, die der Entwicklung von Techniken zugeschrieben wurden, die es Forschern ermöglichen, seine Funktionen und Aktivitäten zu untersuchen; entweder durch direkte (Beurteilung der Phosphorylierung von Kinase-regulatorischen Stellen) oder indirekte (Beobachtung und Überwachung der GABA-Aktivität) Untersuchungen. Das hier vorgestellte Protokoll hebt die Anwendung von Western-Blotting-Techniken hervor, um die Funktionen und Aktivitäten des neuronalen K+-Cl-Co-Transporters KCC2 zu untersuchen, indem die Phosphorylierung des Cotransporters an Kinase-regulatorischen Stellen Thr906/1007 untersucht wird.

Western Blot ist eine Methode, um bestimmte Proteine von Interesse aus einer Gewebe- oder Zellprobe nachzuweisen. Diese Methode trennt die Proteine zunächst durch Elektrophorese nach Größe. Die Proteine werden dann elektrophoretisch auf einen festen Träger (meist eine Membran) übertragen, bevor das Zielprotein mit einem spezifischen Antikörper markiert wird. Die Antikörper werden an verschiedene Tags oder fluorophorkonjugierte Antikörper konjugiert, die entweder kolorimetrische, Chemilumineszenz- oder Fluoreszenzmethoden nachgewiesen werden. Dadurch kann ein spezifisches Zielprotein aus einer Mischung von Proteinen nachgewiesen werden. Diese Technik wurde verwendet, um phosphospezifische Stellen von KCCs1 zu charakterisieren und Kinase-Inhibitoren zu identifizieren, die die KCC3 Thr991/Thr1048-Phosphorylierunghemmen 17. Durch die Befolgung dieses Protokolls kann man spezifisch Gesamt- und phosphoryliertes KCC2 aus Zell- / Gewebelysaten nachweisen. Prinzipiell ist der Nachweis von proteinkonjugierten Antikörpern durch diese Technik sehr hilfreich, da er dazu beiträgt, das Verständnis kooperativer Aktivitäten an den Phospho-Stellen von KCC2 zu verbessern, was Aufschluss über die molekularen Mechanismen gibt, die an ihrer physiologischen Regulation beteiligt sind. Die quantitative Analyse der Gesamtproteinexpression ist repräsentativ für die Funktion und Aktivität von KCC2. Es gibt andere klassische Methoden zur direkten Messung der KCC2-Aktivität, wie Rubidiumionen- und Thalliumionenaufnahme-Assay. Weitere Techniken wie Patch-Clamp-Elektrophysiologie werden zur Messung der GABA-Aktivität eingesetzt; Daher indirekt reflektiert aktiviertes und/oder inaktiviertes KCC2, wie durch die Beurteilung der intrazellulären Chloridionenhomöostase informiert.

Protocol

HINWEIS: Das Protokoll beschreibt die Western-Blotting-Methode, um bestimmte Proteine von Interesse zu erkennen. 1. Zellkultur und Transfektion Erwärmen Sie alle Reagenzien vor dem Zellkulturvorgang im Kugelbad (37 °C). Bereiten Sie das Kulturmedium Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) vor, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, jeweils 1% 2mM L-Glutamin, 100x nicht-essentieller Aminosäure, 100 mM Natriumpyruvat und 100 Einheiten / ml Penicillin-Streptomycin.</l…

Representative Results

Hier untersuchte das repräsentative Ergebnis in Abbildung 1 den Einfluss von Staurosporin und NEM auf die WNK-SPAK/OSR1-vermittelte Phosphorylierung von KCC2 und NKCC1 in HEK293-Zelllinien, die KCC2b (HEKrnKCC2b)18 stabil exprimieren, unter Verwendung der Western Blotting-Technik. Umfassende Details zu den repräsentativen Ergebnissen werden in Zhang et al.15 diskutiert. Ähnlich wie NEM ist Staurosporin ein breiter Kinase-…

Discussion

Viele Methoden wurden verwendet, um die Aktivitäten von SLC12 von CCCs zu messen, die in den Neuronen exprimiert werden, einschließlich KCC2. Viele dieser Techniken haben sich als wissenschaftliche Erkenntnisse über die Analyse der funktionellen Relevanz dieser Transporter und ihrer Struktur-Funktionsmuster bei verschiedenen krankheitsbedingten Mutationen erwiesen. Entscheidend ist, dass die verschiedenen Methoden Vorteile und Vorbehalte haben21. Das oben erläuterte Protokoll beschreibt jedoch…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der Royal Society UK (Grant no. IEC\NSFC\201094) und einem Commonwealth Ph.D. Stipendium unterstützt.

Materials

40% acrylamide Sigma-Aldrich A2917 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Ammonium Per Sulfate Sigma-Aldrich 248614 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
anti pSPAK Dundee University S670B Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 Dundee University S700C Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pSer940 Thermo Fisher Scientific PA5-95678 Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr1007 Dundee University S961C Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr906 Dundee University S959C Used as primary antibody for western blotting
anti-mouse Cell Signalling technology 66002 Used as secondary antibody for western blotting
anti-NKCC1 Dundee University S841B Used as primary antibody for western blotting
anti-NKCC1 pThr203/207/212 Dundee University S763B Used as primary antibody for western blotting
anti-rabbit Cell Signalling technology C29F4 Used as secondary antibody for western blotting
anti-sheep abcam ab6900 Used as secondary antibody for western blotting
anti-SPAK Dundee University S669D Used as primary antibody for western blotting
anti-β-Tubulin III Sigma-Aldrich T8578 Used as primary antibody for western blotting
Benzamine Merck UK 135828 Used as component of lysis buffer
Beta-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 Used as component of loading buffer and lysis buffer
Bradford Coomasie Thermo Scientific 1856209 Used for lysate protein quantification
Casting apparatus Atto  WSE-1165W Used to run SDS-page electrophoresis
Centrifuge Eppendorf 5804 Used in lysate preparation
Centrifuge VWR MicroStar 17R Used for spinning samples
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650-100ML Used for cell culture experiment
Dried Skimmed Milk Marvel N/A Used to make blocking buffer
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose Sigma-Aldrich D6429 Used for cell culture
ECL reagent Perkin Elmer ORTT755/2655 Used to develop image for western blotting
EDTA Fisher Scientific D/0700/53 Used as component of lysis buffer
EGTA Sigma-Aldrich e4378 Used as component of lysis buffer
Electrophoresis Power Supply BioRad PowerPAC HC To supply power to run SDS-page electrophoresis
Ethanol ThermoFisher E/0650DF/17 Used for preparing sterilized equipments and environment
Fetal Bovine Serum -  heat inactivated Merck Life Sciences UK F9665 Used for cell culture
Fumehood Walker A7277 Used for cell culture
Gel Blotting – Whatman GE Healthcare  10426981 Used in western blotting to make transfer sandwich
Glycine Sigma-Aldrich 15527 Used to make buffers
GraphPad Prism Software GraphPad Software, Inc., USA Version 6.0 Used for plotting graphs and analysing data for  western blotting
HCl Acros Organics 10647282 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Heating block Grant QBT1 Used to heat WB loading samples
HEK293 cells Merck UK 12022001-1VL Cell line for culture experiment
ImageJ Software Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA  ImageJ 1.53e Used to measure band intensities from western blotting images
Imaging system BioRad ChemiDoc MP Used to take western blotting images
Incubator LEEC LEEC precision 190D Used for cell culture
Isopropanol Honeywell 24137 Used in casting gel for electrophoresis
L-glutamine solution Sigma-Aldrich G7513 Used for cell culture
Lithium dodecyl sulfate (LDS) Novex NP0008 Used as loading buffer for western blotting
MEM Non-essential amino acid  Merck Life Sciences UK M7145 Used for cell culture
Microcentrifuge Eppendorf 5418 Used for preparing lysates for WB
Microplate reader BioRad iMark Used for lysate protein concentration readout
Microsoft Powerpoint Microsoft, USA PowerPoint2016 Used to edit western blotting images
Molecular Weight Marker BioRad 1610373 Used for western blotting
N-ethylmaleimide Thermo Fisher Scientific 23030 Used for cell culture experiment
Nitrocellulose membrane Fisher Scientific 45004091 Used for western blotting
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Used for cell culture
pH Meter Mettler Toledo Seven compact s210 Used to monitor pH of buffer solutions
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626 Used as component of lysis buffer
Phosphate Buffer Saline Sigma-Aldrich D8537 Used for cell culture
PKCδ pThr505 Cell Signalling technology 9374 Used as primary antibody for western blotting
Sepharose Protein G Generon PG50-00-0002 Used for immunoprecipitation
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653 Used as component of wash buffer
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S7653 Used to prepare TBS-T buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L5750 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
sodium orthovanadate Sigma-Aldrich S6508 Used as component of lysis buffer
Sodium Pyruvate Sigma-Aldrich S8636 Used for cell culture
sodium-β-glycerophosphate Merck UK G9422 Used as component of lysis buffer
Staurosporine (from Streptomyces sp.) Scientific Laboratory Supplies, UK S4400-1MG Used for cell culture experiment
Sucrose Scientifc Laboratory Supplies S0389 Used as component of lysis buffer
TEMED Sigma-Aldrich T7024 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Transfer Chamber BioRad 1658005EDU Used in western blotting to transfer protein on membrane
Tris Sigma-Aldrich T6066 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Triton-X100 Sigma-Aldrich T8787 Used as component of lysis buffer
Trypsin-EDTA Solution Merck Life Sciences UK T4049 Used for cell culture
Tween-20 Sigma-Aldrich P3179 Used as make TBS-T buffer
Vacuum pump Charles Austen Dymax 5 Used for cell culture
Vortex Scientific Industries K-550-GE Used in sample preparation
Vortex mixer Scientific Industries Ltd Vortex-Genie  K-550-GE Used of mixing resolved sample
Water bath Grant Instruments Ltd. (JB Academy) JBA5 Used to incubate solutions
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References

  1. de Los Heros, P., et al. The WNK-regulated SPAK/OSR1 kinases directly phosphorylate and inhibit the K+-Cl- co-transporters. Biochemical Journal. 458 (3), 559-573 (2014).
  2. Heubl, M., et al. GABAA receptor dependent synaptic inhibition rapidly tunes KCC2 activity via the Cl(-)-sensitive WNK1 kinase. Nature Communications. 8 (-), 1776 (2017).
  3. Schulte, J. T., Wierenga, C. J., Bruining, H. Chloride transporters and GABA polarity in developmental, neurological and psychiatric conditions. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 90, 260-271 (2018).
  4. Shekarabi, M., et al. WNK Kinase Signaling in Ion Homeostasis and Human Disease. Cell Metabolism. 25 (2), 285-299 (2017).
  5. Rivera, C., et al. The K+/Cl- co-transporter KCC2 renders GABA hyperpolarizing during neuronal maturation. Nature. 397 (6716), 251-255 (1999).
  6. Kahle, K. T., et al. Modulation of neuronal activity by phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC2. Trends in Neuroscience. 36 (12), 726-737 (2013).
  7. Andrews, K., Josiah, S. S., Zhang, J. The Therapeutic Potential of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 in Huntington’s Disease and Its Comorbidities. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 9142 (2020).
  8. Friedel, P., et al. WNK1-regulated inhibitory phosphorylation of the KCC2 cotransporter maintains the depolarizing action of GABA in immature neurons. Science Signaling. 8 (383), 65 (2015).
  9. Watanabe, M., et al. Developmentally regulated KCC2 phosphorylation is essential for dynamic GABA-mediated inhibition and survival. Science Signaling. 12 (603), (2019).
  10. Rinehart, J., et al. Sites of regulated phosphorylation that control K-Cl cotransporter activity. Cell. 138 (3), 525-536 (2009).
  11. Lu, D. C. -. Y., et al. The role of WNK in modulation of KCl cotransport activity in red cells from normal individuals and patients with sickle cell anaemia. Pflügers Archiv-European Journal of Physiology. 471 (11-12), 1539-1549 (2019).
  12. Huang, H., et al. The WNK-SPAK/OSR1 Kinases and the Cation-Chloride Cotransporters as Therapeutic Targets for Neurological Diseases. Aging and Disease. 10 (3), 626-636 (2019).
  13. AlAmri, M. A., Kadri, H., Alderwick, L. J., Jeeves, M., Mehellou, Y. The Photosensitising Clinical Agent Verteporfin Is an Inhibitor of SPAK and OSR1 Kinases. Chembiochem. 19 (19), 2072-2080 (2018).
  14. Zhang, J., et al. Modulation of brain cation-Cl(-) cotransport via the SPAK kinase inhibitor ZT-1a. Nature Communications. 11 (1), 78 (2020).
  15. Zhang, J., et al. Staurosporine and NEM mainly impair WNK-SPAK/OSR1 mediated phosphorylation of KCC2 and NKCC1. PLoS One. 15 (5), 0232967 (2020).
  16. Alessi, D. R., et al. The WNK-SPAK/OSR1 pathway: master regulator of cation-chloride cotransporters. Science Signaling. 7 (334), 3 (2014).
  17. Zhang, J., et al. Functional kinomics establishes a critical node of volume-sensitive cation-Cl(-) cotransporter regulation in the mammalian brain. Scientific Reports. 6, 35986 (2016).
  18. Hartmann, A. M., et al. Opposite effect of membrane raft perturbation on transport activity of KCC2 and NKCC1. Journal of Neurochemistry. 111 (2), 321-331 (2009).
  19. Pisella, L. I., et al. Impaired regulation of KCC2 phosphorylation leads to neuronal network dysfunction and neurodevelopmental pathology. Science Signaling. 12 (603), (2019).
  20. Blaesse, P., et al. Oligomerization of KCC2 correlates with development of inhibitory neurotransmission. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10407-10419 (2006).
  21. Medina, I., Pisella, L. I. . Neuronal Chloride Transporters in Health and Disease. , 21-41 (2020).
  22. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
  23. Friedel, P., et al. A Novel View on the Role of Intracellular Tails in Surface Delivery of the Potassium-Chloride Cotransporter KCC2. eNeuro. 4 (4), (2017).
  24. Lee, Y. -. C., et al. Impact of detergents on membrane protein complex isolation. Journal of Proteome Research. 17 (1), 348-358 (2018).
  25. Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (148), e59820 (2019).
  26. Johansen, K., Svensson, L. . Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , 15-28 (1998).
  27. Mahmood, T., Yang, P. -. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429 (2012).
  28. Klein, J. D., O’Neill, W. C. Volume-sensitive myosin phosphorylation in vascular endothelial cells: correlation with Na-K-2Cl cotransport. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 269 (6), 1524-1531 (1995).
  29. Hannemann, A., Flatman, P. W. Phosphorylation and transport in the Na-K-2Cl cotransporters, NKCC1 and NKCC2A, compared in HEK-293 cells. PLoS One. 6 (3), 17992 (2011).
  30. Liu, J., Ma, X., Cooper, G. F., Lu, X. Explicit representation of protein activity states significantly improves causal discovery of protein phosphorylation networks. BMC Bioinformatics. 21 (13), 1-17 (2020).
  31. Terstappen, G. C. Nonradioactive rubidium ion efflux assay and its applications in drug discovery and development. Assay and Drug Development Technologies. 2 (5), 553-559 (2004).
  32. Carmosino, M., Rizzo, F., Torretta, S., Procino, G., Svelto, M. High-throughput fluorescent-based NKCC functional assay in adherent epithelial cells. BMC Cell Biology. 14 (1), 1-9 (2013).
  33. Adragna, N. C., et al. Regulated phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC3 is a molecular switch of intracellular potassium content and cell volume homeostasis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 255 (2015).
  34. Zhang, D., Gopalakrishnan, S. M., Freiberg, G., Surowy, C. S. A thallium transport FLIPR-based assay for the identification of KCC2-positive modulators. Journal of Biomolecular Screening. 15 (2), 177-184 (2010).
  35. Yu, H. B., Li, M., Wang, W. P., Wang, X. L. High throughput screening technologies for ion channels. Acta Pharmacologica Sinica. 37 (1), 34-43 (2016).
  36. Hill, C. L., Stephens, G. J. An Introduction to Patch Clamp Recording. Patch Clamp Electrophysiology. , 1-19 (2021).
  37. Conway, L. C., et al. N-Ethylmaleimide increases KCC2 cotransporter activity by modulating transporter phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 292 (52), 21253-21263 (2017).
  38. Heigele, S., Sultan, S., Toni, N., Bischofberger, J. Bidirectional GABAergic control of action potential firing in newborn hippocampal granule cells. Nature Neuroscience. 19 (2), 263-270 (2016).
  39. Moore, Y. E., Deeb, T. Z., Chadchankar, H., Brandon, N. J., Moss, S. J. Potentiating KCC2 activity is sufficient to limit the onset and severity of seizures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10166-10171 (2018).
  40. Kim, H. R., Rajagopal, L., Meltzer, H. Y., Martina, M. Depolarizing GABAA current in the prefrontal cortex is linked with cognitive impairment in a mouse model relevant for schizophrenia. Science Advances. 7 (14), 5032 (2021).
  41. Yelhekar, T. D., Druzin, M., Karlsson, U., Blomqvist, E., Johansson, S. How to properly measure a current-voltage relation?-interpolation vs. ramp methods applied to studies of GABAA receptors. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 10 (2016).
  42. Ishibashi, H., Moorhouse, A. J., Nabekura, J. Perforated whole-cell patch-clamp technique: a user’s guide. Patch Clamp Techniques. , 71-83 (2012).
  43. Ebihara, S., Shirato, K., Harata, N., Akaike, N. Gramicidin-perforated patch recording: GABA response in mammalian neurones with intact intracellular chloride. The Journal of Physiology. 484 (1), 77-86 (1995).
  44. Kyrozis, A., Reichling, D. B. Perforated-patch recording with gramicidin avoids artifactual changes in intracellular chloride concentration. Journal of Neuroscience Methods. 57 (1), 27-35 (1995).
  45. Lamsa, K., Palva, J. M., Ruusuvuori, E., Kaila, K., Taira, T. Synaptic GABAA activation inhibits AMPA-kainate receptor-mediated bursting in the newborn (P0-P2) rat hippocampus. Journal of Neurophysiology. 83 (1), 359-366 (2000).

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Josiah, S. S., Meor Azlan, N. F., Oguro-Ando, A., Zhang, J. Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting. J. Vis. Exp. (190), e64179, doi:10.3791/64179 (2022).
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