Makak Maymunundan Organotipik Retinal Eksplant Kültürleri
Summary
Vahşi tip makaklardan elde edilen retinal eksplantlar in vitro olarak kültürlendi. Retinal dejenerasyon ve cGMP-PKG sinyal yolu PDE6 inhibitörü zaprinast kullanılarak indüklendi. Farklı zaprinast konsantrasyonlarındaki eksplantlarda cGMP birikimi, immünofloresan kullanılarak doğrulandı.
Abstract
Kalıtsal retinal dejenerasyon (RD), ilerleyici fotoreseptör hücre ölümü ile karakterizedir. Fotoreseptör hücrelerde siklik guanozin monofosfat (cGMP)-bağımlı protein kinaz (PKG) yolunun aşırı aktivasyonu, özellikle fosfodiesteraz 6b (PDE6b) mutasyonlarını barındıran modellerde fotoreseptör hücre ölümüne neden olur. RD ile ilgili önceki çalışmalarda esas olarak rd1 veya rd10 fareleri gibi murin modelleri kullanılmıştır. Fareler ve insanlar arasındaki genetik ve fizyolojik farklılıklar göz önüne alındığında, primat ve kemirgenlerin retinalarının ne ölçüde karşılaştırılabilir olduğunu anlamak önemlidir. Makaklar, insanlarla yüksek düzeyde genetik benzerlik paylaşır. Bu nedenle, retina-retinal pigment epiteli (RPE)-koroid kompleksini içeren retinal eksplantların in vitro kültürü için vahşi tip makaklar (1-3 yaş arası) seçildi. Bu eksplantlar, cGMP-PKG sinyal yolunu indüklemek ve RD patogenezini simüle etmek için farklı konsantrasyonlarda PDE6 inhibitörü zaprinast ile tedavi edildi. primat retinal eksplantlarda cGMP birikimi ve hücre ölümü daha sonra immünofloresan ve TUNEL testi kullanılarak doğrulandı. Bu çalışmada oluşturulan primat retinal modeli, cGMP-PKG’ye bağımlı RD mekanizmalarına ilişkin ilgili ve etkili çalışmaların yanı sıra gelecekteki tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesine de hizmet edebilir.
Introduction
Kalıtsal retinal dejenerasyon (RD), ilerleyici fotoreseptör hücre ölümü ile karakterizedir ve çok çeşitli patojenik genlerdeki mutasyonlardan kaynaklanır1. RD’nin nihai sonucu görme kaybıdır ve vakaların büyük çoğunluğunda hastalık bu güne kadar tedavi edilemez olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, fotoreseptör ölümüne yol açan hücresel mekanizmaları, insan hastalık durumunu sadık bir şekilde temsil eden modelleri kullanarak incelemek önemlidir. Burada, primat bazlı modeller, insanlara olan yakınlıkları nedeniyle özellikle ilgi çekicidir. Özellikle, bu tür modeller fotoreseptör hücre ölümünü durdurabilecek veya geciktirebilecek uygun terapötik müdahalelerin geliştirilmesini ilerletebilir.
RD’de hücre ölümü mekanizmaları üzerine yapılan önceki araştırmalar, RD’yi tetikleyen gen mutasyonlarının neden olduğu fosfodiesteraz 6 (PDE6) aktivitesinin azalmasının veya kaybının, siklik guanozin monofosfatın (cGMP) hidrolizinin azalmasına yol açtığını göstermiştir2,3. cGMP, çubuk dış segmentlerindeki (ROS’lar) siklik nükleotid kapılı iyon kanallarının (CNGC’ler) spesifik bir agonistidir ve aynı zamanda omurgalı fotoreseptör hücrelerinde ışık sinyallerinin elektrik sinyallerine dönüştürülmesinden sorumlu anahtar bir moleküldür4. Azaltılmış cGMP hidrolizi, ROS’larda cGMP birikimine neden olur ve CNGC’lerin açılmasına neden olur 5. Sonuç olarak, fototransdüksiyon yolları aktive edilir ve fotoreseptör hücrelerde katyon konsantrasyonlarında bir artışa neden olur. Bu süreç, fotoreseptörlere, örneğin PDE6’daki mutasyonlar tarafından aşırı aktive edildiğinde hücre ölümüne neden olabilecek metabolik bir yük getirir.
Birçok çalışma, farklı RD gen mutasyonlarına sahip fare modellerinin fotoreseptörlerinde önemli miktarda cGMP aşırı birikiminin, cGMP’ye bağımlı protein kinazının (PKG) aktivasyonuna neden olabileceğini göstermiştir3,6. Bu, ölme, TUNEL-pozitif hücrelerde önemli bir artışa ve fotoreseptör hücre tabakasının kademeli olarak incelmesine yol açar. Önceki çalışmalar, yüksek cGMP seviyelerinin neden olduğu PKG aşırı aktivasyonunun, fotoreseptör hücre ölümünün indüksiyonu için gerekli ve yeterli bir koşul olduğunu göstermektedir 2,5. RD’nin farklı fare modelleri üzerinde yapılan çalışmalar, fotoreseptörlerde yüksek cGMP seviyeleri tarafından indüklenen PKG aktivasyonunun, poli-ADP-riboz polimeraz 1 (PARP1), histon deasetilaz (HDAC) ve calpain 2,7,8,9 gibi aşağı akış efektörlerinin aşırı aktivasyonuna yol açtığını göstermiştir. Bu, bu farklı hedef proteinler ile fotoreseptör hücre ölümü arasındaki nedensel ilişkileri ima eder.
Bununla birlikte, RD’nin patolojisi, toksikofarmakolojisi ve tedavisi ile ilgili önceki araştırmalar esas olarak RD10,11,12 için fare modellerine dayanıyordu. Bununla birlikte, bu sonuçların klinik çevirisinde büyük zorluklar devam etmektedir. Bu, fareler ve insanlar arasındaki, özellikle retinal yapı ile ilgili önemli genetik ve fizyolojik farklılıklardan kaynaklanmaktadır. Buna karşılık, insan olmayan primatlar (NHP’ler) ayrıca genetik özellikler, fizyolojik kalıplar ve çevresel faktör düzenlemesi açısından insanlarla yüksek derecede benzerlik göstermektedir. Örneğin, optogenetik tedavi, bir NHP model13’te retinal aktiviteyi geri kazanmanın bir yolu olarak araştırılmıştır. Lingam ve meslektaşları, iyi üretim uygulaması sınıfı insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı retinal fotoreseptör öncü hücrelerinin NHP14’te koni fotoreseptör hasarını kurtarabileceğini göstermiştir. Bu nedenle NHP modelleri, RD patogenezinin araştırılması ve etkin tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi açısından önemlidir. Özellikle, insanlardakine benzer patojenik mekanizmalar sergileyen RD’nin NHP modelleri, yeni ilaçların geliştirilmesi ve in vivo toksikofarmakoloji analizi ile ilgili çalışmalarda kritik bir rol oynayabilir.
Uzun yaşam döngüsü, yüksek düzeyde teknik zorluklar ve in vivo primat modellerinin oluşturulmasında yer alan yüksek maliyet göz önüne alındığında, ekzode makak retina kültürlerini kullanarak in vitro insan dışı primat (NHP) modeli oluşturduk. İlk olarak, retina-RPE-koroid kompleksini içeren retinal eksplantların in vitro kültürü için 1-3 yaş arası vahşi tip makaklar seçildi. Eksplantlar daha sonra cGMP-PKG sinyal yolunu indüklemek için farklı konsantrasyonlarda PDE6 inhibitörü zaprinast (100 μM, 200 μM ve 400 μM) ile muamele edildi. Fotoreseptör hücre ölümü TUNEL testi kullanılarak ölçüldü ve analiz edildi ve eksplantlarda cGMP birikimi immünofloresan yoluyla doğrulandı. Maymunlar ve insanlar arasındaki hücre dağılımı ve morfolojisi, retina tabakası kalınlığı ve retinanın diğer fizyolojik özellikleri açısından yüksek derecede benzerlik göz önüne alındığında, in vitro retinal modelde cGMP-PKG sinyal yolunun kurulması, RD’nin patogenezi üzerine gelecekteki araştırmaları ve RD tedavisi için yeni ilaçların geliştirilmesi ve toksikofarmakolojisine yönelik çalışmaları kolaylaştırabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Görsel fototransdüksiyon, ışık sinyallerinin gözün retinasındaki fotoreseptör hücreler tarafından elektrik sinyallerine dönüştürüldüğü biyolojik süreci ifade eder. Fotoreseptör hücreler, fototransdüksiyon yapabilen polarize nöronlardır ve dış segmentlerinin şekillerinden sonra çubuklar ve koniler olarak adlandırılan iki farklı fotoreseptör türü vardır. Çubuklar skotopik görmeden sorumludur ve koniler fotopik ve yüksek keskinlikte görmeden sorumludur. Kalıtsal RD, ilerleyici retina…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 81960180), Zinke miras vakfı ve Charlotte ve Tistou Kerstan Vakfı, Yunnan Göz Hastalığı Klinik Tıp Merkezi (ZX2019-02-01) tarafından verilen hibelerle desteklenmiştir. Bu çalışmada kullanılan maymun gözbebeklerini paylaştığı için Prof. Longbao Lv’ye (Zooloji Enstitüsü, Çin Bilimler Akademisi, Kunming, Çin) teşekkür ederiz.
Materials
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | Blocking solution |
| Corticosterone | Sigma | C2505 | Supplements of Complete Medium |
| DL-tocopherol | Sigma | T1539 | Supplements of Complete Medium |
| Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488 | Life technologies corporation | A11015 | Secondary antibody of cGMP |
| Ethanol-acetic acid solution | Shyuanye | R20492 | Fixing liquid |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 900-108 | Blocking solution |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss | Axio Imager.M2 | Immunofluorescence imaging |
| Glutamine | Sigma | G8540 | Supplements of Complete Medium |
| Glutathione | Sigma | G6013 | Supplements of Complete Medium |
| In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red | Roche | 12156792910 | TUNEL assay |
| Insulin | Sigma | 16634 | Supplements of Complete Medium |
| L-cysteine HCl | Sigma | C7477 | Supplements of Complete Medium |
| Linoleic acid | Sigma | L1012 | Supplements of Complete Medium |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi | 130-100-008 | Optimized storage of fresh organ and tissue samples |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking solution |
| Paraformaldehyde(PFA) | Biosharp | BL539A | Fixing agent |
| PEN. / STREP. 100× | Millipore | TMS-AB2-C | Penicillin / Streptomycin antibiotics |
| Phosphate buffer saline(PBS) | Solarbio | P1010 | Buffer solution |
| Povidone-iodine | Shanghailikang | 310411 | Disinfector agent |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Supplements of Complete Medium |
| Proteinase K | Millpore | 539480 | Break down protein |
| R16 medium | Life technologies corporation | 074-90743A | Basic medium |
| Retinol | Sigma | R7632 | Supplements of Complete Medium |
| Retinyl acetate | Sigma | R7882 | Supplements of Complete Medium |
| Sheep anti-cGMP | Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands | Primary antibody of cGMP | |
| Sucrose | GHTECH | 57-50-1 | Dehydrating agent |
| T3 | Sigma | T6397 | Supplements of Complete Medium |
| Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound) | SAKURA | 4583 | Embedding medium |
| Tocopheryl acetate | Sigma | T1157 | Supplements of Complete Medium |
| Transferrin | Sigma | T1283 | Supplements of Complete Medium |
| Transwell | Corning Incorporated | 3412 | Cell / tissue culture |
| Tris-buffer (TBS) | Solarbio | T1080 | Blocking buffer |
| Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | Surface active agent |
| VECTASHIELD Medium with DAPI | Vector | H-1200 | Mounting medium |
| Vitamin B1 | Sigma | T1270 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin C | Sigma | A4034 | Supplements of Complete Medium |
| Zaprinast | Sigma | Z0878 | PDE6 inhibitor |
| Zeiss Imager M2 Microscope | Zeiss, Oberkochen,Germany | upright microscope | |
| LSM 900 Airyscan | high resolution laser scanning microscope | ||
| Zeiss Axiocam | Zeiss, Oberkochen,Germany | digital camera | |
| Zeiss Axiovision4.7 | |||
| Adobe | |||
| Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA) | |||
| Primate eyeballs from wildtype macaque | KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY | SYXK ( ) K2017 -0008 |
|
| Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan | |||
| TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany), |
References
- O’Neal, T. B., Luther, E. E. . StatPearls. , (2022).
- Power, M., et al. Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration – Focus on cGMP. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772 (2020).
- Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekström, P. PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models. Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).
- Tolone, A., Belhadj, S., Rentsch, A., Schwede, F., Paquet-Durand, F. The cGMP pathway and inherited photoreceptor degeneration: Targets, compounds, and biomarkers. Genes (Basel). 10 (6), 453 (2019).
- Arango-Gonzalez, B., et al. Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration. PLoS One. 9 (11), 112142 (2014).
- Mencl, S., Trifunović, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study). Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).
- Power, M. J., et al. Systematic spatiotemporal mapping reveals divergent cell death pathways in three mouse models of hereditary retinal degeneration. Journal of Comparative Neurology. 528 (7), 1113-1139 (2020).
- Sancho-Pelluz, J., et al. Excessive HDAC activation is critical for neurodegeneration in the rd1 mouse. Cell Death & Disease. 1 (2), 24 (2010).
- Kulkarni, M., Trifunović, D., Schubert, T., Euler, T., Paquet-Durand, F. Calcium dynamics change in degenerating cone photoreceptors. Human Molecular Genetics. 25 (17), 3729-3740 (2016).
- Trifunović, D., et al. cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina. Journal of Comparative Neurology. 518 (17), 3604-3617 (2010).
- Samardzija, M., et al. HDAC inhibition ameliorates cone survival in retinitis pigmentosa mice. Cell Death & Differentiation. 28 (4), 1317-1332 (2021).
- Schön, C., et al. Gene therapy successfully delays degeneration in a mouse model of PDE6A-linked Retinitis Pigmentosa (RP43). Human Gene Therapy. 28 (12), 1180-1188 (2017).
- McGregor, J. E., et al. Optogenetic therapy restores retinal activity in primate for at least a year following photoreceptor ablation. Molecular Therapy. 30 (3), 1315-1328 (2022).
- Lingam, S., et al. cGMP-grade human iPSC-derived retinal photoreceptor precursor cells rescue cone photoreceptor damage in non-human primates. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 464 (2021).
- Das, S., et al. The role of cGMP-signalling and calcium-signalling in photoreceptor cell death: perspectives for therapy development. Pflugers Archiv. 473 (9), 1411-1421 (2021).
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
- Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
- Maryam, A., et al. The molecular organization of human cGMP specific Phosphodiesterase 6 (PDE6): Structural implications of somatic mutations in cancer and retinitis pigmentosa. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 378-389 (2019).
- Huang, L., Kutluer, M., Adani, E., Comitato, A., Marigo, V. New in vitro cellular model for molecular studies of retinitis pigmentosa. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6440 (2021).
- Zhou, J., Rasmussen, M., Ekström, P. cGMP-PKG dependent transcriptome in normal and degenerating retinas: Novel insights into the retinitis pigmentosa pathology. Experimental Eye Research. 212, 108752 (2021).
