Organotypische retinale Explantatkulturen von Makakenaffen

Die hereditäre Netzhautdegeneration (RD) ist durch einen fortschreitenden Zelltod der Photorezeptoren gekennzeichnet und wird durch Mutationen in einer Vielzahl von pathogenen Genen verursacht¹. Das Endergebnis von RD ist der Verlust des Sehvermögens, und in den allermeisten Fällen ist die Krankheit bis heute nicht behandelbar. Daher ist es wichtig, die zellulären Mechanismen, die zum Absterben von Photorezeptoren führen, mit Modellen zu untersuchen, die den menschlichen Krankheitszustand originalgetreu abbilden. Hier sind primatenbasierte Modelle aufgrund ihrer Nähe zum Menschen von besonderem Interesse. Insbesondere können solche Modelle die Entwicklung geeigneter therapeutischer Interventionen vorantreiben, die den Zelltod der Photorezeptoren stoppen oder verzögern können.

Frühere Forschungen zu den Mechanismen des Zelltods bei RD haben gezeigt, dass die Abnahme oder der Verlust der Phosphodiesterase 6 (PDE6)-Aktivität, die durch RD-auslösende Genmutationen verursacht wird, zu einer verminderten Hydrolyse von zyklischem Guanosinmonophosphat (cGMP)^2,3 führt. cGMP ist ein spezifischer Agonist der zyklischen Nukleotid-gesteuerten Ionenkanäle (CNGCs) in den äußeren Stäbchensegmenten (ROS) und ist auch ein Schlüsselmolekül, das für die Umwandlung von Lichtsignalen in elektrische Signale in Photorezeptorzellen von Wirbeltieren verantwortlich ist⁴. Eine reduzierte cGMP-Hydrolyse führt zu einer Akkumulation von cGMP in ROS, was zur Öffnung von CNGCs führt ⁵. Folglich werden die Phototransduktionswege aktiviert, was zu einem Anstieg der Kationenkonzentrationen in den Photorezeptorzellen führt. Dieser Prozess belastet die Photorezeptoren metabolisch, was bei Überaktivierung z.B. durch Mutationen in PDE6 zum Zelltod führen kann.

Viele Studien haben gezeigt, dass eine signifikante Überakkumulation von cGMP in Photorezeptoren von Mausmodellen mit verschiedenen RD-Genmutationen die Aktivierung der cGMP-abhängigen Proteinkinase (PKG) verursachen ^kann3,6. Dies führt zu einer deutlichen Zunahme absterbender, TUNEL-positiver Zellen und zu einer allmählichen Ausdünnung der Photorezeptorzellschicht. Frühere Studien deuten darauf hin, dass die durch erhöhte cGMP-Spiegel verursachte PKG-Überaktivierung eine notwendige und hinreichende Bedingung für die Induktion des Photorezeptorzelltods ist ^2,5. Studien an verschiedenen Mausmodellen von RD haben auch gezeigt, dass die PKG-Aktivierung, die durch erhöhte cGMP-Spiegel in Photorezeptoren induziert wird, zu einer Überaktivierung von nachgeschalteten Effektoren wie Poly-ADP-Ribose-Polymerase 1 (PARP1), Histon-Deacetylase (HDAC) und Calpain 2,7,8,9 führt. Dies impliziert kausale Zusammenhänge zwischen diesen verschiedenen Zielproteinen und dem Tod von Photorezeptorzellen.

Bisherige Forschungen zur Pathologie, Toxikopharmakologie und Therapie von RD basierten jedoch hauptsächlich auf Mausmodellen für RD^10,11,12. Dennoch gibt es nach wie vor immense Schwierigkeiten bei der klinischen Translation dieser Ergebnisse. Dies ist auf die erheblichen genetischen und physiologischen Unterschiede zwischen Mäusen und Menschen zurückzuführen, insbesondere in Bezug auf die Netzhautstruktur. Im Gegensatz dazu weisen nicht-menschliche Primaten (NHPs) auch ein hohes Maß an Ähnlichkeit mit dem Menschen in Bezug auf genetische Merkmale, physiologische Muster und die Regulation von Umweltfaktoren auf. So wurde beispielsweise die optogenetische Therapie als Mittel zur Wiederherstellung der Netzhautaktivität in einem NHP-Modell untersucht¹³. Lingam und seine Kollegen zeigten, dass vom Menschen induzierte pluripotente Stammzellen, die aus retinalen Photorezeptor-Vorläuferzellen gewonnen werden, in der guten Herstellungspraxis eine Schädigung des Zapfen-Photorezeptors in NHP¹⁴ retten können. Daher sind NHP-Modelle wichtig für die Erforschung der RD-Pathogenese und die Entwicklung effektiver Behandlungsmethoden. Insbesondere NHP-Modelle von RD, die ähnliche pathogene Mechanismen wie beim Menschen aufweisen, könnten eine entscheidende Rolle bei Studien zur Entwicklung und In-vivo-toxikopharmakologischen Analyse neuer Medikamente spielen.

Angesichts des langen Lebenszyklus, der hohen technischen Schwierigkeiten und der hohen Kosten, die mit der Etablierung von In-vivo-Primatenmodellen verbunden sind, haben wir ein in vitro nicht-humanes Primatenmodell (NHP) unter Verwendung von Kulturen explantierter Makaken-Netzhaut etabliert. Zunächst wurden Wildtyp-Makaken im Alter von 1-3 Jahren für die In-vitro-Kultur von Netzhautexplantaten ausgewählt, die den Retina-RPE-Aderhaut-Komplex enthielten. Explantate wurden dann mit unterschiedlichen Konzentrationen des PDE6-Inhibitors Zapinast (100 μM, 200 μM und 400 μM) behandelt, um den cGMP-PKG-Signalweg zu induzieren. Der Zelltod der Photorezeptoren wurde mit dem TUNEL-Assay quantifiziert und analysiert, und die cGMP-Akkumulation in Explantaten wurde mittels Immunfluoreszenz verifiziert. Angesichts der hohen Ähnlichkeit in Bezug auf Zellverteilung und -morphologie, Netzhautschichtdicke und andere physiologische Eigenschaften der Netzhaut zwischen Affen und Menschen könnte die Etablierung des cGMP-PKG-Signalwegs im In-vitro-Netzhautmodell zukünftige Forschungen zur Pathogenese der RD sowie Studien zur Entwicklung und Toxikopharmakologie neuer Medikamente zur RD-Behandlung erleichtern.