Culturas organotípicas de explantes da retina de macacos

A degeneração hereditária da retina (DR) é caracterizada pela morte progressiva das células fotorreceptoras e causada por mutações em uma grande variedade de genes patogênicos1. O resultado final da DR é a perda da visão e, na grande maioria dos casos, a doença permanece intratável até hoje. Portanto, é importante estudar os mecanismos celulares que levam à morte dos fotorreceptores usando modelos que representem fielmente a condição da doença humana. Aqui, os modelos baseados em primatas são de particular interesse devido à sua proximidade com os humanos. Notadamente, tais modelos podem avançar no desenvolvimento de intervenções terapêuticas apropriadas que possam deter ou retardar a morte celular dos fotorreceptores.

Pesquisas prévias sobre os mecanismos de morte celular na DR demonstraram que a diminuição ou perda da atividade da fosfodiesterase 6 (PDE6) causada por mutações no gene desencadeante da DR leva à redução da hidrólise do monofosfato de guanosina cíclico (GMPc)^2,3. O GMPc é um agonista específico dos canais iônicos dependentes de nucleotídeo cíclico (CNGCs) nos segmentos externos dos bastonetes (ROSs) e também é uma molécula-chave responsável pela conversão de sinais luminosos em sinais elétricos em células fotorreceptoras de^vertebrados4. A hidrólise reduzida do GMPc causa o acúmulo de GMPc em ROSs, levando à abertura de CNGCs ⁵. Consequentemente, as vias de fototransdução são ativadas, resultando em um aumento nas concentrações de cátions nas células fotorreceptoras. Esse processo impõe uma carga metabólica aos fotorreceptores, que quando superativados, por exemplo, por mutações na PDE6, podem causar morte celular.

Muitos estudos têm demonstrado que um acúmulo significativo de GMPc em fotorreceptores de modelos de camundongos com diferentes mutações no gene da DR pode causar a ativação da proteína quinase dependente de GMPc (PKG)^3,6. Isso leva a um aumento substancial de células TUNEL-positivas e a um afinamento gradual da camada de células fotorreceptoras. Estudos prévios sugerem que a superativação de PKG causada por níveis elevados de GMPc é uma condição necessária e suficiente para a indução de morte de células fotorreceptoras ^2,5. Estudos em diferentes modelos murinos de DR também mostraram que a ativação de PKG induzida por níveis elevados de GMPc em fotorreceptores leva à superativação de efetores a jusante, como poli-ADP-ribose polimerase 1 (PARP1), histona desacetilase (HDAC) e calpaína 2,7,8,9. Isso implica associações causais entre essas diferentes proteínas-alvo e a morte de células fotorreceptoras.

No entanto, pesquisas anteriores sobre a patologia, toxicofarmacologia e terapia da DR foram baseadas principalmente em modelos murinos para DR^10,11,12. No entanto, ainda persistem imensas dificuldades na tradução clínica desses resultados. Isso se deve às consideráveis diferenças genéticas e fisiológicas entre camundongos e humanos, especialmente no que diz respeito à estrutura da retina. Em contraste, primatas não humanos (NHPs) também compartilham um alto grau de similaridade com humanos no que diz respeito a características genéticas, padrões fisiológicos e regulação de fatores ambientais. Por exemplo, a terapia optogenética foi investigada como um meio de restaurar a atividade retiniana em um modelo de PNH¹³. Lingam e seus colegas demonstraram que as células precursoras de fotorreceptores da retina derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos de boa prática de fabricação podem resgatar danos ao fotorreceptor do cone no NHP¹⁴. Portanto, modelos de PNH são importantes para a exploração da patogênese da DR e o desenvolvimento de métodos de tratamento eficazes. Em particular, modelos de PNH de DR, exibindo mecanismos patogênicos semelhantes aos de humanos, poderiam desempenhar um papel crítico em estudos sobre o desenvolvimento e análise toxicofarmacológica in vivo de novos fármacos.

Tendo em vista o longo ciclo de vida, o alto nível de dificuldades técnicas e o alto custo envolvido no estabelecimento de modelos in vivo de primatas, estabelecemos um modelo in vitro de primata não humano (NHP) usando culturas de retina de macaco explantado. Primeiramente, macacos selvagens com idade entre 1 e 3 anos foram selecionados para cultivo in vitro de explantes da retina, que incluíram o complexo retina-EPR-coróide. Os explantes foram então tratados com diferentes concentrações do inibidor de PDE6 zaprinast (100 μM, 200 μM e 400 μM) para induzir a via de sinalização GMP-PKG. A morte de células fotorreceptoras foi quantificada e analisada pelo ensaio TUNEL e o acúmulo de GMPc nos explantes foi verificado por imunofluorescência. Dado o alto grau de similaridade com relação à distribuição e morfologia celular, espessura da camada retiniana e outras características fisiológicas da retina entre macacos e humanos, o estabelecimento da via de sinalização GMPc-PKG no modelo retiniano in vitro pode facilitar futuras pesquisas sobre a patogênese da DR, bem como estudos sobre o desenvolvimento e toxicofarmacologia de novas drogas para o tratamento da DR.