يصف هذا البروتوكول سير عمل عالي الإنتاجية للتجزئة القائمة على الذكاء الاصطناعي للمناطق ذات الأهمية المؤكدة من قبل علم الأمراض من صور قسم الأنسجة الرقيقة الملطخة لإثراء مجموعات الخلايا التي تم حلها بواسطة علم الأنسجة باستخدام التشريح المجهري بالليزر. تتضمن هذه الاستراتيجية خوارزمية جديدة تمكن من نقل الحدود التي تشير إلى مجموعات الخلايا ذات الأهمية المباشرة إلى المجاهر الليزرية.
تمثل البيئة الدقيقة للورم (TME) نظاما بيئيا معقدا يتكون من عشرات أنواع الخلايا المتميزة ، بما في ذلك الورم والسدى والخلايا المناعية. لتوصيف التباين على مستوى البروتيوم وعدم تجانس الورم على نطاق واسع ، هناك حاجة إلى طرق عالية الإنتاجية لعزل المجموعات الخلوية المنفصلة بشكل انتقائي في الأورام الخبيثة الصلبة. يصف هذا البروتوكول سير عمل عالي الإنتاجية ، يتم تمكينه بواسطة الذكاء الاصطناعي (الذكاء الاصطناعي) ، والذي يقسم صور أقسام الأنسجة الرقيقة الملطخة بالهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) إلى مناطق ذات أهمية مؤكدة من قبل علم الأمراض للحصاد الانتقائي لمجموعات الخلايا التي تم حلها بواسطة علم الأنسجة باستخدام التشريح المجهري بالليزر (LMD). تتضمن هذه الاستراتيجية خوارزمية جديدة تمكن من نقل المناطق التي تشير إلى مجموعات الخلايا ذات الأهمية ، والتي تم شرحها باستخدام برنامج الصور الرقمية ، مباشرة إلى مجاهر الليزر ، وبالتالي تمكين مجموعات أكثر سهولة. تم تنفيذ سير العمل هذا بنجاح ، مما يدل على فائدة هذه الطريقة المنسقة لحصاد مجموعات الخلايا السرطانية بشكل انتقائي من TME للتحليل البروتيني الكمي متعدد الإرسال بواسطة مطياف الكتلة عالي الدقة. تتكامل هذه الاستراتيجية تماما مع المراجعة الروتينية لعلم الأنسجة المرضي ، والاستفادة من تحليل الصور الرقمية لدعم إثراء المجموعات الخلوية ذات الأهمية وهي قابلة للتعميم بالكامل ، مما يتيح حصادا منسقا لمجموعات الخلايا من TME للتحليلات المتعددة.
يمثل TME نظاما بيئيا معقدا تسكنه مجموعة متنوعة للغاية من أنواع الخلايا ، مثل الخلايا السرطانية والخلايا اللحمية والخلايا المناعية والخلايا البطانية وأنواع الخلايا الوسيطة الأخرى والخلايا الشحمية ، إلى جانب مصفوفة معقدة خارج الخلية1. يختلف هذا النظام البيئي الخلوي داخل وعبر مواقع أعضاء المرض المختلفة ، مما يؤدي إلى عدم تجانس الورم المعقد 2,3. أظهرت الدراسات الحديثة أن الأورام غير المتجانسة والأورام ذات الخلايا السرطانية المنخفضة (النقاء المنخفض) غالبا ما ترتبط بسوء تشخيص المرض 2,3.
لفهم التفاعل الجزيئي بين مجموعات الخلايا السرطانية وغير السرطانية داخل TME على نطاق واسع ، تعد الاستراتيجيات الموحدة وعالية الإنتاجية ضرورية لحصاد مجموعات خلوية متميزة ذات أهمية انتقائية للتحليل متعدد الخلايا في المراحل النهائية. تمثل البروتينات الكمية تقنية سريعة التطور ومتزايدة الأهمية لتعزيز فهم بيولوجيا السرطان. حتى الآن ، فإن غالبية الدراسات التي تستخدم البروتيوميات قد فعلت ذلك مع البروتينات المستخرجة من مستحضرات أنسجة الورم الكاملة (على سبيل المثال ، المسحوقة بالتبريد) ، مما أدى إلى ندرة في فهم عدم التجانس على مستوى البروتيوم في TME 4,5,6.
إن تطوير استراتيجيات جمع العينات التي تتكامل بسلاسة مع المعلومات المستمدة من سير عمل علم الأمراض السريري وتسخرها سيمكن جيلا جديدا من البروتينات التي تم حلها في علم الأنسجة والتي تعد مكملة للغاية لسير عمل علم الأمراض التشخيصي ذي المعيار الذهبي. يتيح LMD الجمع المباشر والانتقائي للسكان الفرعيين الخلويين أو المناطق ذات الأهمية (ROIs) من خلال الفحص المجهري للأقسام الرقيقة من الأنسجة الملطخة نسيجيا7. أظهرت التطورات الرئيسية الحديثة في علم الأمراض الرقمي والتحليل المدعوم الذكاء الاصطناعي القدرة على تحديد الميزات التركيبية الفريدة وعائد الاستثمار داخل TME بطريقة آلية ، يرتبط الكثير منها بالتغيرات الجزيئية وميزات الأمراض السريرية ، مثل مقاومة العلاج وتشخيص المرض8.
يستفيد سير العمل الموصوف في البروتوكول المعروض هنا من حلول البرمجيات التجارية لتعليق عائد الاستثمار على الورم بشكل انتقائي داخل صور علم الأنسجة الرقمية ، ويستخدم أدوات برمجية تم تطويرها داخليا لنقل عائد الاستثمار على الورم إلى مجاهر الليزر للجمع الآلي للمجموعات الخلوية المنفصلة ذات الأهمية التي تتكامل بسلاسة مع سير عمل التحليل متعدد الأورام في المراحل النهائية. تقلل هذه الاستراتيجية المتكاملة بشكل كبير من وقت مشغل LMD وتقلل من المدة التي يلزم فيها أن تكون الأنسجة في درجة الحرارة المحيطة. يتم إثبات تكامل الاختيار الآلي للميزات وحصاد LMD مع البروتينات الكمية عالية الإنتاجية من خلال تحليل تفاضلي ل TME من نوعين فرعيين نسيجيين تمثيليين لسرطان المبيض الظهاري ، سرطان المبيض المصلي عالي الجودة (HGSOC) وسرطان الخلايا المبيض الشفاف (OCCC).
في حين كانت هناك سوابق دراسة متعددة تهدف إلى تطوير و / أو تحسين سير العمل لإثراء المجموعات الفرعية الخلوية المستهدفة من FFPE و / أو الأنسجة المجمدة الطازجة ومنهجيات للحفاظ على جودة العينات أثناء المعالجة9،12،13،14،15 ، هناك حاجة كبيرة لتطوير استراتيجيات آلية لإعداد عينات الأنسجة السريرية للتحليلات الجزيئية لتقليل التباين و زيادة قابلية التكرار. يصف سير العمل هذا بروتوكولا موحدا شبه آلي يدمج أدوات برامج تحليل الصور الحالية (انظر جدول المواد) للحصاد الذي تم حله بواسطة الأنسجة لمجموعات الخلايا المنفصلة بواسطة LMD من عينات الأنسجة السريرية.
يمثل إثراء LMD الذي تم حله مكانيا لعائد الاستثمار الذي يلتقط مجموعات الخلايا المنفصلة خطوة معالجة الأنسجة من الجيل التالي قبل التحليلات متعددة الأزمنة لتحسين التوصيف الجزيئي وتحديد الهوية وتسهيل اكتشاف المؤشرات الحيوية الانتقائية للخلايا. يحسن هذا البروتوكول من المنهجيات الحالية عن طريق تقليل التعرض الطويل في كثير من الأحيان لأقسام الأنسجة للبيئة المحيطة المرتبطة بالتقسيم اليدوي لعائد الاستثمار من قبل أخصائي الأنسجة (والذي يمكن أن يستغرق >1-2 ساعة قبل جمع LMD). يسمح سير العمل هذا بدلا من ذلك بتحديد عائد الاستثمار مسبقا من خلال التصنيف والتقسيم الموجه الذكاء الاصطناعي. إن الحد من وقت بقاء الأنسجة سيقلل من الاختلافات الزائفة في تقييمات الأهداف الجزيئية عالية القابلية للاختبار ، مثل الببتيدات الفوسفاتية و mRNA ، أو للتقنيات التحليلية القائمة على الأجسام المضادة التي تعتمد على البروتين المستهدف في تشكيله الأصلي للكشف.
يعد قطع اعتمادات المعايرة الأنيقة على شريحة غشاء PEN المرئية بوضوح في صورة الشريحة الممسوحة ضوئيا أحد المكونات الرئيسية التي تمكن من دمج برنامج تحليل الصور (انظر جدول المواد) مع سير عمل LMD. إن التأكد من أن المعايرات تحتوي على نقطة دقيقة (“نظيفة”) في أسفل الشكل “V” يسمح باختيار نقطة دقيقة في برنامج تحليل الصور لخطوط المعايرة التي سيتم استخلاصها منها، كما هو موضح في الخطوتين 5.1.6 و 5.2.13. تعد محاذاة هذه النقاط أثناء الاستيراد إلى برنامج LMD أمرا بالغ الأهمية لتراكب التعليقات التوضيحية بشكل صحيح (يتم تسهيلها من خلال إنشاء ملف .xml متوافق باستخدام خوارزميات “Malleator” و / أو “Dapọ”) على عائد الاستثمار على الأنسجة ذات الصلة على شريحة LMD المادية. من الضروري تسليط الضوء على جميع الأشكال و “السحب والإفلات” بشكل جماعي في مكانها حتى عندما تكون المحاذاة دقيقة عند الاستيراد إلى برنامج LMD لتسجيل الموضع الرأسي (z-plane) لمرحلة الشريحة على المجهر الليزر. يمكن أيضا إجراء تعديلات طفيفة على موضع التعليقات التوضيحية على عائد الاستثمار على الأنسجة خلال هذه الخطوة ، إذا لزم الأمر.
أحد قيود الإصدار الحالي من خوارزمية Malleator هو أنه غير متوافق مع أدوات شكل التعليق التوضيحي المحددة مسبقا التي يوفرها برنامج تحليل الصور (انظر جدول المواد) ، على الرغم من أن التحديثات / الإصدارات المستقبلية من الخوارزمية ستهدف إلى تحسين هذا التوافق. يحتوي ملف .annotation للأشكال المرسومة باستخدام هذه الأدوات على مجموعتين فقط من إحداثيات x وy المقترنة لكل تعليق توضيحي، بدون الاتجاه المكاني الكامل حول تلك النقاط. يؤدي الاستخدام الحالي لهذه الأدوات إلى تحويل التعليقات التوضيحية إلى خطوط مستقيمة محددة بنقطتين فقط أثناء عملية الاستيراد. مطلوب تعريف يدوي لشرائح عائد الاستثمار على الأنسجة للتحويل الناجح إلى تنسيق XML واستيراد LMD. يمكن القيام بذلك إما عن طريق تعريف كل عائد استثمار يدويا باستخدام تعليقات توضيحية فردية متعددة الأضلاع حرة خاصة بالمنطقة المستهدفة أو عن طريق تطبيق تعليق توضيحي دائري أو مستطيل تقريبي عبر جميع شرائح عائد الاستثمار في الأنسجة ، إذا رغبت في ذلك ، وسيكون متوافقا مع سير العمل هذا.
في حين تم إثبات سير العمل المعروض هنا للتحليل البروتيني لعينات أنسجة السرطان البشرية المجمدة حديثا ، يمكن استخدام سير عمل LMD المدفوع الذكاء الاصطناعي بشكل متساو مع أنسجة FFPE وأنواع الأنسجة غير السرطانية وتلك من مصادر غير بشرية. ويمكنه أيضا دعم سير عمل التنميط الجزيئي المصب الآخر ، بما في ذلك التحليلات النسخية أو الجينومية أو الفوسفوبروتيومية. يمكن لسير العمل هذا أيضا الاستفادة من الاستخدامات الأخرى لبرنامج تحليل الصور (انظر جدول المواد) ، بما في ذلك القدرات المرتبطة بحساب الخلايا أو الوحدات التحليلية الأخرى ، بما في ذلك وحدة “Multiplex IHC” أو “الوظيفة الإضافية Tissue Microarray (TMA)”. قد تستفيد التطبيقات المستقبلية لسير العمل هذا أيضا من التحديد المسبق لعدد الخلايا لكل جزء من عائد الاستثمار ، وبالتالي ضمان مدخلات خلوية مكافئة عبر مجموعات متعددة ، أو باستخدام طرق بديلة لتحديد عائد الاستثمار الخلوي ذي الأهمية ، مثل الكيمياء النسيجية المناعية أو علم اجتماع الخلية.
The authors have nothing to disclose.
تم توفير التمويل لهذا المشروع جزئيا من قبل برنامج صحة الدفاع (HU0001-16-2-0006 و HU0001-16-2-00014) إلى جامعة الخدمات النظامية لمركز التميز لسرطان أمراض النساء. ولم يكن للرعاة أي دور في تصميم الدراسة أو تنفيذها أو تفسيرها أو كتابتها. اخلاء المسؤوليه: الآراء المعرب عنها هنا هي آراء المؤلفين ولا تعكس السياسة الرسمية لوزارة الجيش / البحرية / القوات الجوية أو وزارة الدفاع أو حكومة الولايات المتحدة.
1260 Infinity II System | Agilent Technologies Inc | Offline LC system | |
96 MicroCaps (150uL) in bulk | Pressure Biosciences Inc | MC150-96 | |
96 MicroPestles in bulk | Pressure Biosciences Inc | MP-96 | |
96 MicroTubes in bulk (no caps) | Pressure Biosciences Inc | MT-96 | |
9mm MS Certified Clear Screw Thread Kits | Fisher Scientific | 03-060-058 | Sample vial for offline LC frationation and mass spectrometry |
Acetonitrile, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A995-4 | Mobile phase solvent |
Aperio AT2 | Leica Microsystems | 23AT2100 | Slide scanner |
Axygen PCR Tubes with 0.5 mL Flat Cap | Fisher Scientific | 14-222-292 | Sample tubes; size fits PCT tubes and thermocycler |
Barocycler 2320EXT | Pressure Biosciences Inc | 2320-EXT | Barocycler |
BCA Protein Assay Kit | Fisher Scientific | P123225 | |
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
Easy-nLC 1200 | Thermo Fisher Scientific | Liquid Chromatography | |
EasyPep Maxi Sample Prep Kit | Thermo Fisher Scientific | NCI5734 | Post-label sample clean up column |
EASY-SPRAY C18 2UM 50CM X 75 | Fisher Scientific | ES903 | Analytical column |
Eosin Y Solution Aqueous | Sigma Aldrich | HT110216 | |
Formic Acid, 99+ % | Thermo Fisher Scientific | 28905 | Mobile phase additive |
ggplot2 version 3.3.5 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/ | |
HALO | Indica Labs | Image analysis software | |
IDLE (Integrated Development and Learning Environment) | Python Software Foundation | ||
iheatmapr version 0.5.1 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/iheatmapr/ | |
iRT Kit | Biognosys | Ki-3002-1 | LC-MS QAQC Standard |
limma version 3.42.2 | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html | |
LMD Scanning stage Ultra LMT350 | Leica Microsystems | 11888453 | LMD stage model outfitted with PCT tube holder |
LMD7 (software version 8.2.3.7603) | Leica Microsystems | LMD apparatus (microscope, laser, camera, PC, tablet) | |
Mascot Server | Matrix Science | Data analysis software | |
Mass Spec-Compatible Human Protein Extract, Digest | Promega | V6951 | LC-MS QAQC Standard |
Mayer’s Hematoxylin Solution | Sigma Aldrich | MHS32 | |
PEN Membrane Glass Slides | Leica Microsystems | 11532918 | |
Peptide Retention Time Calibration Mixture | Thermo Fisher Scientific | 88321 | LC-MS QAQC Standard |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma Aldrich | P5726 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma Aldrich | P0044 | |
Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Fisher Scientific | 88323 | Instrument calibration solution |
PM100 C18 3UM 75UMX20MM NV 2PK | Fisher Scientific | 164535 | Pre-column |
Proteome Discoverer | Thermo Fisher Scientific | OPTON-31040 | Data analysis software |
Python | Python Software Foundation | ||
Q Exactive HF-X | Thermo Fisher Scientific | Mass spectrometer | |
R version 3.6.0 | CRAN | https://cran-archive.r-project.org/bin/windows/base/old/2.6.2/ | |
RColorBrewer version 1.1-2 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/RColorBrewer/ | |
Soluble Smart Digest Kit | Thermo Fisher Scientific | 3251711 | Digestion reagent |
TMTpro 16plex Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | A44520 | isobaric TMT labeling reagents |
Veriti 60 well thermal cycler | Applied Biosystems | 4384638 | Thermocycler |
Water, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | W6-4 | Mobile phase solvent |
ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 12.5 mm, 5 µm, guard cartridge (ZGC) | Agilent Technologies Inc | 821125-932 | Offline LC trap column |
ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 150 mm, 3.5 µm | Agilent Technologies Inc | 763750-902 | Offline LC analytical column |