腫瘍微小環境のマイクロスケールプロテオミクス分析のための工業化された人工知能誘導レーザーマイクロダイセクション

すべての研究プロトコルは、米国連邦規則45 CFR 46.102(f)の下で免除されるとみなされた、西部IRB承認プロトコル「臨床的に有益なバイオマーカーを同定および検証するための子宮内膜癌および卵巣癌の統合分子分析」の下での使用が承認された。この研究におけるヒトデータを含むすべての実験プロトコールは、ヘルシンキ宣言に準拠していた。インフォームドコンセントは、研究に関与するすべての被験者から得られた。 警告: プロトコール全体を通して使用される以下の試薬は、発がん性物質が既知または疑われる試薬、および/または有害物質を含んでいます:エタノール、DEPC水、メイヤーズヘマトキシリン溶液、エオシンY溶液、メタノール、アセトニトリル、およびギ酸。各安全データシート(SDS)に記載されているように、適切な取り扱い、および適切な個人用保護具(PPE)の使用が必須です。 1. キャリブレータ基準を含むデフォルトのシェイプリストデータ(.sld)ファイルの生成 メモ: このセクションで説明するプロトコル手順は、倒立レーザー顕微鏡および関連ソフトウェアで使用するために固有の ものです(材料表を参照)。デフォルトの.sldファイルの作成は、レーザー顕微鏡ごとに1回だけ必要です。結果のファイルは、基準をその後に使用されるすべてのPENスライドにカットするために使用できます。おおよその時間:5分(1回のみ)。 LMD ソフトウェアを開き、ポリエチレンナフタレート (PEN) メンブレンをスライドさせて LMD ステージに下向きにロードし、ラベルをユーザーに近づけます。プログラムウィンドウの右側にある [線を閉じる]ボックスの選択を解除します。 高倍率(63倍)下で PtoP (ポイントツーポイント)関数を使用して、3つの「V」矢印を描画してキャリブレーション基準として機能します。V上の1つの外部点から始めて、Vの中点に線を引き、シングルクリックします。次に、V の中心点から 2 番目の外部 V 点の端まで 2 番目の線を引き、ダブルクリックして、2 本の線から閉じていない単一の V 字型を作成します。メモ:これらのキャリブレーション基準は、スライドの3つのコーナー(フロント右、リア右、リア左)に配置する必要があります。 カット前にAF(オートフォーカス)オプションを選択します。スライドを位置1にカットし、残りのスライド位置のそれぞれに移動し、キャリブレーションカットを正確にトレースします。 .sld ファイルを保存し、ポップアップダイアログボックスから「キャリブレーション なしで保存」オプションを選択して、キャリブレーション 基準を膜にカットしないようにします。注: 4 つのスライド位置の標準キャリブレータ基準を含む代表的な .sld ファイルは、 補足ファイル 1 に記載されています。 2. LMD スライドの準備 メモ: このセクションで説明するプロトコル手順は、倒立レーザー顕微鏡および関連ソフトウェアで使用するために固有の ものです(材料表を参照)。おおよその時間:5分。 基準校正基準を切断する前に、スライドが完全に乾いていることを確認してください。LMD ソフトウェアを開き、[ 図形のインポート] オプションで既定のキャリブレーション .sld ファイルを開きます。 カット前にAF(オートフォーカス)オプションを選択します。ティッシュが下を向いた状態でスライドをロードし、ラベルをオペレータの近くにスライドさせてLMDステージのスライドホルダーに挿入します。 レーザー顕微鏡とデフォルトのキャリブレーション.sldファイルを使用して、キャリブレーション基準をPEN膜にカットします。 オプション:組織切片がスライド上に置かれる前または後に、校正基準をPEN膜に切断します。組織配置前にキャリブレーション基準を切断する場合は、ステップ2.5で組織をスライド上に配置したときに、組織および/または固定液がキャリブレータと重ならないことを確認してください。組織配置後に較正基準が切断される場合は、ステップ2.4の完了後に停止し、セクション3に進みます。 すべてのキャリブレータを個別に見直して、各カットが完全で見えることを確認します。メモ: 移動およびカット 機能を使用して、PEN膜を完全に切断しなかったキャリブレーション基準にレーザーを手動で向けます。 凍結またはホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織切片を、較正基準を含むスライドの上に置きます。 3. 組織染色 注:おおよその時間:30分。 凍結LMD組織スライドをホスファターゼ阻害剤カクテル試薬を含む70%エタノール(EtOH)中で5分間固定する。 ホスファターゼ阻害剤カクテル試薬を含むジエチルピロカルボメート(DEPC)水でスライドを1分間洗浄する。 スライドをDEPC水で1分間洗う。 スライドをメイヤーのヘマトキシリン溶液中で3分間インキュベートする。 スライドをDEPC水で3分間すすいでください。 DEPC水を1分間交換したばかりの状態でスライドをすすいでください。 スライドをEosin Y水溶液中で1秒間インキュベートする。 スライドを95%EtOH中で2 x 5秒すすぎます。 スライドを100%EtOH中で3 x 10秒すすぎます。 スライドの背面から余分なEtOHを拭き取り、スライドを風乾させます。 LMDがすぐに実行されない場合は、スライドを-80°Cで保管してください。 4. スライドイメージング メモ: このセクションで説明するプロトコル手順は、スキャンしたスライド( 材料表を参照)と、.svsファイルとして保存された結果のイメージに固有のものです。画像解析ソフトウェア( 材料表を参照)が開くことができる形式で画像ファイルを生成するスキャナおよび関連するソフトウェアを使用します。サポートされているピラミッド型 TIFF を使用するファイルの種類には、JPG、TIF、MRXS、QPTIFF、コンポーネント TIFF、SVS、AFI、SCN、LIF、DCM、OME などがあります。TIFF、ND2、VSI、NDPI、NDPIS、CZI、BIF、KFB、および ISYNTAX です。おおよその時間:5分。 スキャナーの電源を入れ、スライドスキャナーソフトウェアを開きます。ティッシュを上に向けてスライドをスキャナーの 1 つのスライドステージにセットします。スライドが完全に乾いていることを確認し、カバースリップをティッシュの上にそっと置きます。カバースリップの下にエタノールや浸漬油を使用しないでください。 メーカーの指示に従って、ガラスの背景の代わりにPEN膜を調整し、背景膜染色を無視するように較正された設定を使用して顕微鏡写真画像をキャプチャします。 必要に応じて、内側の緑色の周囲をドラッグしてサイズ変更し、PEN膜領域全体をキャプチャして、イメージング領域を調整します。スナップショットの概要画像をダブルクリックして組織に4つのフォーカスポイントを追加し、キャリブレーション基準の近くの膜に3つのフォーカスポイントを追加します(3つのキャリブレーション基準のそれぞれに1つのフォーカスポイント)。メモ:4つのフォーカスポイントは、組織断面のほぼどこにでも配置できますが、暗すぎる染色で黒く見える組織に配置すると、スキャンが失敗する可能性があります。 表示メニューで、ビデオモニターを選択します。必要に応じて、ファインフォーカススライダーおよび/またはマクロフォーカススライダーを使用して、LMD組織の周りの各ポイントに対して手動でフォーカスを調整します。高倍率(20倍)で画像スキャンをキャプチャします。保存した画像にすべてのキャリブレーション基準が透明で明瞭であることを確認します。 5. 画像解析ソフトウェアによる自動特徴選択 腫瘍コレクション全体(おおよその時間:5分、症例依存): 画像解析ソフトウェアを開きます( 材料表を参照)。 [画像を開く] を選択し、ポップアップ ウィンドウから、AT2 スキャナーでのスライドのスキャンから生成された .svs 画像ファイルを選択します。注: 代表的な .svs イメージ ファイルは、 補足ファイル 2 で提供されています。 「 アノテーション」 タブに移動します。アノテーションツールバーの ペン ツールを選択し、ティッシュの周囲にシェイプを描画します。 図形を選択し、画像を右クリックします。 [詳細設定] ドロップダウン メニューから、[ パーティショニング (タイル)] を選択します。 [タイル サイズ ] と [スペースの範囲 ] をそれぞれ 500 と 40 に設定し、[ OK ] を選択してタイルを生成します。手順 5.1.2 でタイルの生成に使用した境界図形を選択して削除します。 [レイヤーアクション]ドロップダウンメニュー|選択します。エクスポートして、タイル状の注釈を .annotation ファイルとして保存します。注:腫瘍組織コレクション全体に対する代表的な.annotationファイルは、 補足ファイル3に提供されています。 セッションまたはプロジェクト用のフォルダーを作成し、スライドの一意の識別子でラベル付けされたサブフォルダー内に .annotation ファイルを保存します。 「 アノテーション」 タブに移動します。 [レイヤーアクション] ドロップダウン |選択します。[すべてのレイヤーを削除] : 画像からすべての注釈を削除します。 ペン ツールを選択し、キャリブレーション基準ごとに矢印の内側の先端から短い線を引きます。マークから、左上、右上、右下の順序で線を描画します。 [レイヤーアクション]ドロップダウンメニューを選択|エクスポートして、行注釈を .annotation ファイルとして保存します。ファイル名に_calibを追加し、タイル図形の座標を含むサブフォルダーにファイルを配置します。注: 代表的な _calib.annotation ファイルは、 補足ファイル 4 に用意されています。 メインプロジェクトまたはセッションフォルダのアドレスをコピーします。IDLE統合開発環境を使用して、XMLインポート生成スクリプト「Malleator」(https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022 から入手可能)を開き、スクリプトの下部にある引用符の間にプロジェクトフォルダアドレスを貼り付けます。 [ 実行 ] ドロップダウンメニュー |選択します。モジュールを実行して スクリプトを実行します。メモ: .xml LMD インポートファイルは、画像/スライド用に作成されたサブフォルダ内に生成されます。代表的な.xmlファイルは、 補足ファイル5に提供されています。 LMD が豊富なコレクションのみ (おおよその時間: 15 分、大文字と小文字が異なります):画像解析ソフトウェアを開きます( 材料表を参照)。 [画像を開く] を選択し、ポップアップ ウィンドウから、スライドのスキャンによって生成された .svs 画像ファイルを選択します。 「 アノテーション」 タブに移動します。 [長方形] 注釈ツールを選択して使用し、組織の周囲にボックスを描画します。 ボックスの注釈を選択し、画像を右クリックします。[ 詳細設定 ]ドロップダウンメニュー |選択します。パーティショニング(タイル) オプション。 [タイル サイズ ] と [スペースの範囲 ] をそれぞれ 500 と 40 に設定し、[ OK ] を選択してタイルを生成します。手順 5.2.2 でタイルの生成に使用した境界ボックスの注釈を選択して削除します。 [レイヤーアクション]ドロップダウンメニュー|選択します。エクスポートして、タイル状の注釈を .annotation ファイルとして保存します。 AI 分類アノテーションレイヤーをマージするために開発された Python “Dapọ” (https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022 経由で利用可能) アルゴリズムの保存済みコピーを、タイルアノテーションファイルと同じフォルダーに配置します。 タイルアノテーションファイルの名前をコピーします。IDLE 統合開発環境を使用して Python プログラムを開き、プログラムの下部にある引用符の間にタイル状の注釈ファイルの名前を貼り付けます。 [ファイル名を指定して 実行 ]ドロップダウンメニュー |モジュールを実行します。すべてのタイルアノテーションが単一のレイヤーの下にマージされる新しいファイルが生成されるのを待ちます。 画像解析ソフトウェアを開き、[ 注釈] タブに移動します。 [レイヤーアクション] ドロップダウンメニュー |選択します。[すべてのレイヤーを削除] : 画像からすべての注釈を削除します。 [レイヤーアクション]ドロップダウンメニュー|選択します。ローカルアノテーションファイルをインポートします。ポップアップウィンドウで、スクリプトによって生成されたマージされた .annotation ファイルを選択します。読み込まれたすべてのタイルが同じアノテーション レイヤーの下にあることを確認します。 [分類子] タブに移動し、製造元の指示に従って ROI の図形を生成します。分類子を実行する前に、[高度な分類子オプション] の下にある [注釈] タブの [ROI ボックス] をオンにして、目的の注釈レイヤー (腫瘍または間質層) を選択します。分類子アクションメニューの「アノテーションレイヤー」オプションを使用して、分類子を実行します。 分類子解析が完了したら、「 アノテーション」(Annotations) タブに移動し、解析から生成されたアノテーションレイヤーを選択します。 [レイヤーアクション] ドロップダウンメニュー |選択します。「現在のレイヤーを除くすべてのレイヤーを削除」 を選択すると、他のすべてのアノテーションレイヤーが画像から削除されます。 [レイヤーアクション]ドロップダウンメニューを選択|エクスポートして、注釈を .annotation ファイルとして保存します。セッションまたはプロジェクト用のフォルダーを作成し、スライドの一意の識別子でラベル付けされたサブフォルダー内に .annotation ファイルを保存します。注: 分類された LMD 濃縮組織コレクションの代表的な .annotation ファイルは、 補足ファイル 6 に用意されています。 [ 注釈] タブに移動し、[ レイヤー アクション] ドロップダウン |[すべてのレイヤーを削除] : 画像からすべての注釈を削除します。 ペン ツールを選択し、各キャリブレーション基準から短い線を引きます。マークから、左上、右上、右下の順序で線を描画します。 [レイヤーアクション]ドロップダウンメニュー|選択します。エクスポートして、行注釈を .annotation ファイルとして保存します。ファイル名に_calibを追加し、タイル図形の座標を含むサブフォルダーにファイルを配置します。 メインプロジェクトまたはセッションフォルダのアドレスをコピーします。IDLE統合開発環境を使用してXMLインポート生成スクリプト「Malleator」(https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022 から入手可能)を開き、スクリプトの下部にある引用符の間にプロジェクトフォルダアドレスを貼り付けます。 [ファイル名を指定して 実行 ]ドロップダウンメニュー |モジュールを実行して スクリプトを実行します。メモ: .xml LMD インポートファイルは、イメージ/スライド用に作成されたサブフォルダ内に生成されます。 6. レーザーマイクロダイセクション メモ: このセクションで説明するプロトコル手順は、倒立レーザー顕微鏡および関連ソフトウェアで使用するために固有の ものです(材料表を参照)。おおよその時間:2時間。ケースによって異なります。 組織を下向きにし、ラベル側をオペレータに近づけた状態で、マークされたメンブレンスライド(校正基準を含む)をレーザー顕微鏡ステージのスライドホルダーにロードします。 [ファイル] ドロップダウン メニューから [図形のインポート] を選択します。スライド用に生成された.xml LMD インポートファイルを選択します。ポップアップウィンドウで「いいえ」(No) を選択すると、ファイルから参照点が読み込まれず、2 番目のポップアップウィンドウで「いいえ」を選択すると、以前に保存した基準点がキャリブレーションに使用されなくなります。 LMDアプリケーションのプロンプトに従って、キャリブレーションクロスをスライド上の3つのキャリブレーション基準のそれぞれに合わせます。画像解析ソフトウェアで、スライド画像の左上、右上、右下に表示されるキャリブレーション基準を探します。これは、顕微鏡ステージ上の反転 LMD スライドの前面右隅、後部右隅、および後部左隅の基準点に対応します。5x対物レンズを使用して位置を特定し、63x対物レンズを使用して各キャリブレーション基準を整列させます。ポップアップ ウィンドウで [ いいえ ] を選択して参照ポイントをファイルに保存しないようにし、2 番目のポップアップ ウィンドウで [ OK ] を選択してスライドが挿入されていることを確認します。 5倍対物レンズを所定の位置に移動し、ポップアップウィンドウで[ はい ]を選択して実際の倍率を使用します。読み込んだ図形が表示されたら、カメラをティッシュに合わせます。 「シェイプ リスト」(Shapes List) ウィンドウですべてのシェイプをハイライト表示して選択し、視野内の 1 つまたは 2 つのアノテーションを参照として使用して所定の位置にドラッグし、レーザーで切断するために垂直 Z 軸を揃えます。 読み込まれた図形を確認し、コレクションの適切なチューブ位置に割り当てます。「 カット開始」 を押してレーザーを開始します。注: .xml ファイルで読み込まれた図形は、[ 図形リスト ] ウィンドウの [キャップなし] の位置に自動的に割り当てられます。組織を採取するには、インポートした形状を、装填されたチューブを含む位置に再割り当てする必要があります。 7. 圧力サイクル技術(PCT)によるタンパク質消化 注:おおよその時間:4時間(真空遠心分離機乾燥時間なしで3時間)。 LMD採取組織を含むキャップ付きPCTマイクロチューブを20 μLの100 mM TEAB/10%アセトニトリルに収めた0.5 mLチューブをサーモサイクラーに入れ、99°Cで30分間加熱した後、50°Cまで10分間冷却します。 チューブを 4,000 × g で 30 秒間回転させ、0.5 mL チューブからマイクロチューブを取り外します。マイクロキャップツールを使用して、PCTマイクロチューブからマイクロキャップを取り外して廃棄します。トリプシン( 材料表を参照)を30 mm 2組織あたり1 μgの割合で加え、MicroCapツールを使用して MicroTubeにMicroPestreを挿入します。 マイクロチューブをバロサイクラーカートリッジに移し、カートリッジ全体を組み立てます。カートリッジをバロサイクラー圧力チャンバーに入れ、蓋を固定します。バロサイクルは45,000 psiで50秒間、大気圧は50°Cで10秒間、60サイクルです。 バロサイクルが完了したら、マイクロチューブを0.5 mLの微量遠心チューブに移し、4,000 × gで2分間遠心分離 します。 キャップツールを使用して、0.5 mL の微量遠心チューブから MicroTube を取り外します。キャップツールを使用して乳棒を慎重に取り外し、乳棒の下半分を20 μLの液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)グレードの水ですすぎ、洗浄液を清潔な0.5 mLの微量遠心チューブに集めます。 ベンチ上部のMicroTubeを静かに叩いて液体を底に移動し、すべての溶液をMicroTubeから0.5mLの微量遠心チューブに移します。 20 μL の LC-MS グレードの水を MicroTube に加え、ベンチトップで軽く叩きます。洗浄液を0.5mLチューブに移し、この洗浄工程をもう一度繰り返す。 真空遠心分離機でサンプルを〜2 μLまで乾燥させ、100 μLの100 mM TEAB、pH 8.0を加えます。 比色アッセイ(ビシンコニン酸(BCA)アッセイ; 材料表を参照)を用いてペプチド濃度を決定し、製造業者のプロトコールに従っている。 8. タンデムマスタグ(TMT)ラベリングとイージーペップクリーンアップ 注:おおよその時間:7時間20分(真空遠心分離機乾燥時間なしで2時間20分)。 アイソバリックTMT標識試薬を周囲温度にしてから開封してください。各TMTバイアル(5mg)に500μLの100%アセトニトリルを加える。時折ボルテックスで10分間インキュベートします。 5 μg のペプチドサンプルを 100 μL の 100 mM TEAB (pH 8.0) に溶解し、所定の TMT 試薬を 10 μL 加えます。複数のTMT多重化9にわたる試料の定量化を容易にするために、実験中の各TMT多重化セットにおける各個々の試料を表す参照プールを構築し、含める。周囲温度で反応を1時間インキュベートし、時折振盪/タッピングします。 5%ヒドロキシルアミンを10μL添加してTMT標識反応をクエンチし、時折タッピングしながら周囲温度で30分間インキュベートする。クエンチ後、TMT標識サンプルを1本のチューブに結合し、約200μLまで乾燥させます。 1,800 μLの0.1%ギ酸を加える。pHペーパーでpHを確認してください:pH〜3の場合は、1mLの0.1%ギ酸を加えます。pHが>3の場合は、pH〜3になるまで5%ギ酸を10〜20μL添加する。0.1%ギ酸を加えて、3mLの最終容量にする。 ペプチドクリーンアップカラムの下部にあるタブを取り外し、キャップを外して、15 mL の円錐形チューブに入れます。TMT 標識サンプルをカラムに移し、製造元のプロトコルに従ってクリーンアップを続行します。 真空遠心分離機で溶出したペプチドを〜20 μLまでドライダウンし、最終容量80 μLの25 mM炭酸水素アンモニウムを使用してLCバイアルに移し、オフライン分画に進みます。 9. TMTマルチプレックスサンプル分画とプーリング 注:おおよその時間:3時間30分(真空遠心分離機乾燥時間なしで1時間30分)。 移動相B(アセトニトリル)の直線勾配(0.69% min-1)を移動相A(10 mMNH4HCO3、pH 8.0)に展開することにより、塩基性逆相クロマトグラフィーによりTMT標識ペプチド多重化を96画分に分画します。 サンプルウェルをプールして36個の連結画分を生成します。真空遠心分離機で乾燥画分を約2 μLにし、25 mM 炭酸水素アンモニウム (終濃度 1.5 μg/10 μL) に再懸濁し、15,000 × g で 10 ~ 15 分間遠心分離し、MS 分析のために LC バイアルに移します。 10. 液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS/MS) 注:おおよその時間:機器の方法と実験計画によって異なります。 質量分析計は、製造元の指示/プロトコルに従って校正します。 新鮮な移動相および標準を準備し、適切なLCプレラン調製(参照された機器の溶媒のパージ、空気のフラッシュ、およびリークテストスクリプトを含むがこれらに限定されない)を実行します[ 材料表を参照])。分析を開始する前に、分析前および分析前のカラムとサンプルループを平衡化します。 シリアルTMTマルチプレックス分析の前および間に、LC-MSシステムが品質保証/品質管理(QA/QC)TMTM標識ペプチドダイジェストおよび(例:MSPE( 材料表を参照)、HeLa)を使用して、以前にベンチマークされたパフォーマンスメトリックを満たしていることを検証します。 オートサンプラーバイアルをLCオートサンプラーの適切な位置にロードします。適切な勾配/ MS法で個々の画分を分析します。ペプチド標準物質(例えば、ペプチド保持時間較正[PRTC])で「洗浄」ランを散りばめ、クロマトグラフィーおよびマススペクトル性能を評価するために、約1日1回行う。各TMTマルチプレックスサンプルフラクションシリーズの分析に続いて、QA/QC TMTベンチマーク標準を実行してシステム性能を評価します。 QA/QC TMTベンチマーク標準の後に質量分析計の評価ルーチンを実行してサンプル後の性能を評価し、次のサンプルセットのステップ10.1のようにシステムを校正します。 11. バイオインフォマティクスデータ解析 注: おおよその時間: 実験計画によって異なります。 すべてのサンプルデータ(.rawファイルなど)を適切なネットワークストレージ/コンピュータドライブに転送します。 種特異的タンパク質参照データベースに対して適切なパラメータ9 を使用して、所望のデータ分析アプリケーション(例えば、プロテオームディスカバー、マスコット)を使用してすべての画分を一緒に検索し、ペプチドスペクトルマッチ(PSM)を生成し、TMTレポーターイオンシグナル強度を抽出する。適切な品質管理メトリックに基づいてPSMをフィルタリングし、前述のように正規化された中央値log2変換TMTレポーターイオン比存在量をグローバルタンパク質レベル存在量に集約する3、9。 目的の差動分析ソフトウェアを使用して、目的の条件下でのタンパク質の変化を比較します。