Microdissection laser industrialisée guidée par l’intelligence artificielle pour l’analyse protéomique à micro-échelle du microenvironnement tumoral

Tous les protocoles d’étude ont été approuvés pour une utilisation en vertu d’un protocole approuvé par la CISR de l’Ouest « An Integrated Molecular Analysis of Endometrial and Ovarian Cancer to Identify and Validate Clinically Informative Biomarkers » réputé exempté en vertu du règlement fédéral américain 45 CFR 46.102 (f). Tous les protocoles expérimentaux impliquant des données humaines dans cette étude étaient conformes à la Déclaration d’Helsinki. Le consentement éclairé a été obtenu de tous les sujets impliqués dans l’étude. ATTENTION : Les réactifs suivants utilisés tout au long du protocole sont des cancérogènes connus ou soupçonnés et/ou contiennent des matières dangereuses : éthanol, eau DEPC, solution d’hématoxyline de Mayer, solution d’éosine Y, méthanol, acétonitrile et acide formique. Une manipulation appropriée, telle que décrite dans les fiches de données de sécurité (FDS) respectives, et l’utilisation d’équipements de protection individuelle (EPI) appropriés sont obligatoires. 1. Génération du fichier de données de liste de formes par défaut (.sld) contenant des fiducials calibrator REMARQUE : Les étapes du protocole décrites dans cette section sont spécifiques à utiliser avec un microscope laser inversé et le logiciel associé (voir la Table des matériaux). La création d’un fichier .sld par défaut n’est nécessaire qu’une seule fois par microscope laser. Le fichier résultant peut être utilisé pour découper des fiducials dans toutes les diapositives PEN utilisées par la suite. Durée approximative : 5 min (une seule fois). Ouvrez le logiciel LMD et chargez la membrane en polyéthylène naphtalate (PEN) sur l’étage LMD face vers le bas, avec l’étiquette la plus proche de l’utilisateur. Décochez la case Fermer la ou les lignes sur le côté droit de la fenêtre du programme. Utilisez la fonction PtoP (point à point) sous fort grossissement (63x) pour dessiner trois flèches « V » servant de fiducials d’étalonnage. En partant d’un point externe sur le V, tracez une ligne jusqu’au point médian du V et cliquez un seul clic. Ensuite, tracez une deuxième ligne à partir du point central du V jusqu’à la fin du deuxième point V externe, puis double-cliquez pour créer une forme en V unique et non fermée à partir des deux lignes.REMARQUE: Ces fiducials d’étalonnage doivent être placés dans trois coins de la diapositive: avant droite, arrière droit, arrière gauche. Sélectionnez l’option AF (autofocus) avant la coupe . Coupez la diapositive en position 1, déplacez-la dans chacune des positions restantes de la diapositive et tracez avec précision les coupes d’étalonnage. Enregistrez le fichier .sld et sélectionnez l’option Enregistrer sans étalonnage dans la boîte de dialogue contextuelle pour éviter de couper les fiducials d’étalonnage dans la membrane.REMARQUE : Un fichier .sld représentatif contenant des fiducials d’étalonnage standard pour quatre positions de diapositive est fourni dans le fichier supplémentaire 1. 2. Préparation des lames LMD REMARQUE : Les étapes du protocole décrites dans cette section sont spécifiques à utiliser avec un microscope laser inversé et le logiciel associé (voir la Table des matériaux). Durée approximative : 5 min. Assurez-vous que la lame est complètement sèche avant de couper les fiducials d’étalonnage de référence. Ouvrez le logiciel LMD et ouvrez le fichier .sld d’étalonnage par défaut sous l’option Importer des formes . Sélectionnez l’option AF (autofocus) avant la coupe . Chargez la ou les lames avec le tissu tourné vers le bas et la glissière d’étiquette plus près de l’opérateur dans le porte-diapositives sur la scène LMD. À l’aide du microscope laser et du fichier .sld d’étalonnage par défaut, découpez les fiducials d’étalonnage dans la membrane PEN. FACULTATIF : Coupez les fiducials d’étalonnage dans la membrane PEN avant ou après que la ou les sections tissulaires soient/soient placées sur la lame. Si les fiducials d’étalonnage sont coupés avant la mise en place du tissu, assurez-vous que le tissu et/ou le fixateur ne se chevauchent pas avec les calibrateurs lorsque le tissu est placé sur la lame à l’étape 2.5. Si des fiducials d’étalonnage sont coupés après la mise en place de tissus, arrêtez-vous après la fin de l’étape 2.4 et passez à la section 3. Examinez tous les calibrateurs individuellement pour vous assurer que chaque coupe est complète et visible.REMARQUE: Utilisez la fonction Déplacer et couper pour diriger manuellement le laser sur tous les fiducials d’étalonnage qui n’ont pas complètement coupé à travers la membrane PEN. Placer la section de tissu congelée ou fixée au formol, incorporée à la paraffine (FFPE) sur la lame contenant les fiducials d’étalonnage. 3. Coloration tissulaire REMARQUE: Durée approximative: 30 min. Fixer les lames de tissu LMD congelées dans de l’éthanol à 70% (EtOH) contenant des réactifs cocktails inhibiteurs de phosphatase pendant 5 min. Laver les lames dans de l’eau pyrocarbomate de diéthyle (DEPC) contenant des réactifs cocktails inhibiteurs de la phosphatase pendant 1 min. Lavez les lames à l’eau DEPC pendant 1 min. Incuber les lames dans la solution d’hématoxyline de Mayer pendant 3 min. Rincez les lames à l’eau DEPC pendant 3 min. Rincez les lames dans un échange frais d’eau DEPC pendant 1 min. Incuber les lames dans une solution aqueuse d’Eosin Y pendant 1 s. Rincez les lames 2 x 5 s dans 95% EtOH. Rincez les lames 3 x 10 s en 100% EtOH. Essuyez l’excès d’EtOH à l’arrière des glissières et laissez les lames sécher à l’air. Stockez les lames à -80 °C si la LMD ne doit pas être effectuée immédiatement. 4. Imagerie de diapositives Remarque : Les étapes de protocole décrites dans cette section sont spécifiques aux diapositives numérisées (voir la table des matériaux) et aux images résultantes enregistrées en tant que fichiers .svs. Utilisez n’importe quel scanner et son logiciel associé qui génèrent des fichiers image dans un format que le logiciel d’analyse d’images (voir la Table des matériaux) peut ouvrir. Les types de fichiers utilisant des tiffs pyramidaux pris en charge incluent JPG, TIF, MRXS, QPTIFF, composant TIFF, SVS, AFI, SCN, LIF, DCM, OME. TIFF, ND2, VSI, NDPI, NDPIS, CZI, BIF, KFB et ISYNTAX. Durée approximative : 5 min. Allumez le scanner et ouvrez le logiciel du scanner de diapositives. Chargez la diapositive avec le tissu tourné vers le haut sur l’étage de diapositive unique dans le scanner. Assurez-vous que la lame est complètement sèche et placez doucement un couvercle sur le tissu. N’utilisez pas d’éthanol ou d’huile d’immersion sous le couvercle. Capturez l’image de la micrographie à l’aide de paramètres calibrés pour ajuster la membrane PEN au lieu de l’arrière-plan en verre et pour ignorer la coloration de la membrane d’arrière-plan, conformément aux instructions du fabricant. Ajustez la zone d’imagerie en faisant glisser et en redimensionnant le périmètre vert interne pour capturer toute la zone de la membrane PEN, selon les besoins. Ajoutez quatre points de mise au point sur le tissu en double-cliquant sur l’image d’aperçu de l’instantané et trois points de mise au point sur la membrane près des fiduciaires d’étalonnage (un point de mise au point pour chacun des trois fiducials d’étalonnage).REMARQUE: Les quatre points de mise au point peuvent être placés presque n’importe où sur la section de tissu, bien que le placement sur un tissu trop taché et qui semble noir puisse entraîner l’échec de l’analyse. Dans le menu Affichage , sélectionnez Moniteur vidéo. Ajustez manuellement la mise au point à l’aide du curseur de mise au point fine et/ou macro, selon les besoins, pour chaque point autour du tissu LMD. Capturez la numérisation de l’image sous un grossissement élevé (20x). Vérifiez que toutes les fiduciales d’étalonnage sont visibles et claires dans l’image enregistrée. 5. Sélection automatisée des caractéristiques à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images Pour les collections de tumeurs entières (durée approximative: 5 min; en fonction du cas): Ouvrez le logiciel d’analyse d’images (voir la Table des matériaux). Sélectionnez Ouvrir les images et, dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez le fichier image .svs généré par l’analyse de la diapositive sur le scanner AT2.REMARQUE : Un fichier image .svs représentatif est fourni dans le fichier supplémentaire 2. Accédez à l’onglet Annotations . Sélectionnez l’outil Plume dans la barre d’outils Annotation et dessinez une forme autour du tissu. Sélectionnez la forme et faites un clic droit sur l’image. Dans le menu déroulant Avancé, sélectionnez Partitionnement (en mosaïque). Définissez la taille et l’espace entre les vignettes sur 500 et 40, respectivement, puis sélectionnez OK pour générer les vignettes. Sélectionnez et supprimez la forme de périmètre utilisée pour générer les vignettes à l’étape 5.1.2. Sélectionnez le menu déroulant Actions de calque | Exportez pour enregistrer les annotations en mosaïque en tant que fichier .annotation.REMARQUE: Un fichier d’annotation représentatif pour une collection complète de tissus tumoraux est fourni dans le fichier supplémentaire 3. Créez un dossier pour la session ou le projet et enregistrez le fichier .annotation dans un sous-dossier étiqueté avec l’identificateur unique de la diapositive. Accédez à l’onglet Annotations . Sélectionnez le menu déroulant Actions de calque | Supprimer tous les calques pour supprimer toutes les annotations de l’image. Sélectionnez l’outil Plume et tracez une courte ligne à partir de la pointe interne de la pointe de flèche pour chaque fiducial d’étalonnage. Tracez les lignes à partir des marques dans l’ordre suivant : en haut à gauche, en haut à droite, en bas à droite. Sélectionnez le menu déroulant Actions de calque | Exportez pour enregistrer les annotations de ligne en tant que fichier .annotation. Ajoutez _calib au nom de fichier et placez le fichier dans le sous-dossier qui contient les coordonnées des formes en mosaïque.REMARQUE : Un fichier _calib.annotation représentatif est fourni dans le fichier supplémentaire 4. Copiez l’adresse du dossier principal du projet ou de la session. Ouvrez le script de génération d’importation XML, « Malleator » (disponible via https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022), à l’aide de l’environnement de développement intégré IDLE et collez l’adresse du dossier du projet entre les guillemets au bas du script. Sélectionnez le menu déroulant Exécuter | Exécutez Module pour exécuter le script.REMARQUE : Le fichier d’importation LMD .xml sera généré dans le sous-dossier créé pour l’image/diapositive. Un dossier .xml représentatif est fourni dans le dossier supplémentaire 5. Pour les collections enrichies en LMD uniquement (durée approximative : 15 min ; en fonction du cas) :Ouvrez le logiciel d’analyse d’images (voir la Table des matériaux). Sélectionnez Ouvrir les images et, dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez le fichier image .svs généré par l’analyse de la diapositive. Accédez à l’onglet Annotations . Sélectionnez et utilisez l’outil d’annotation Rectangle pour dessiner une zone autour du tissu. Sélectionnez l’annotation de la boîte et faites un clic droit sur l’image. Sélectionnez le menu déroulant Avancé | Option de partitionnement (mosaïque). Définissez la taille et l’espace entre les vignettes sur 500 et 40, respectivement, puis sélectionnez OK pour générer les vignettes. Sélectionnez et supprimez l’annotation de zone de périmètre utilisée pour générer les vignettes à l’étape 5.2.2. Sélectionnez le menu déroulant Actions de calque | Exportez pour enregistrer les annotations en mosaïque en tant que fichier .annotation. Placez une copie enregistrée de l’algorithme Python « Dapọ » (disponible via https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022), développé pour fusionner les couches d’annotation classées par l’IA, dans le même dossier que le fichier d’annotations en mosaïque. Copiez le nom du fichier d’annotation en mosaïque. Ouvrez le programme Python à l’aide de l’environnement de développement intégré IDLE et collez le nom du fichier d’annotation en mosaïque entre les guillemets au bas du programme. Sélectionnez le menu déroulant Exécuter | Exécutez Module. Attendez qu’un nouveau fichier soit généré qui aura toutes les annotations en mosaïque fusionnées sous un seul calque. Ouvrez le logiciel d’analyse d’images et accédez à l’onglet Annotations . Sélectionnez le menu déroulant Actions de calque | Supprimer tous les calques pour supprimer toutes les annotations de l’image. Sélectionnez le menu déroulant Actions de calque | Importer un fichier d’annotation local. Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez le fichier .annotation fusionné généré par le script. Assurez-vous que toutes les vignettes importées se trouvent sous le même calque d’annotation. Accédez à l’onglet Classificateur et suivez les instructions du fabricant pour générer des formes pour les rois. Avant d’exécuter le classificateur, sélectionnez la ou les couches d’annotation souhaitées (c’est-à-dire la ou les couches de tumeur ou de stroma) en cochant la ou les cases ROI de l’onglet Annotations , sous options avancées du classificateur. Utilisez l’option Calque d’annotation du menu Actions du classificateur pour exécuter le classificateur. Une fois l’analyse du classificateur terminée, accédez à l’onglet Annotations et sélectionnez la couche d’annotation générée à partir de l’analyse. Sélectionnez le menu déroulant Actions de calque | Supprimer tous les calques mais actuels pour supprimer tous les autres calques d’annotation de l’image. Sélectionnez le menu déroulant Actions de calque | Exportez pour enregistrer les annotations en tant que fichier .annotation. Créez un dossier pour la session ou le projet et enregistrez le fichier .annotation dans un sous-dossier étiqueté avec l’identificateur unique de la diapositive.REMARQUE : Un fichier d’annotation représentatif pour une collection de tissus enrichis en LMD classifiée est fourni dans le fichier supplémentaire 6. Accédez à l’onglet Annotations , sélectionnez la liste déroulante Actions de calque | Supprimer tous les calques pour supprimer toutes les annotations de l’image. Sélectionnez l’outil plume et tracez une courte ligne à partir de chaque fiducial d’étalonnage. Tracez des lignes à partir des marques dans l’ordre suivant : en haut à gauche, en haut à droite, en bas à droite. Sélectionnez le menu déroulant Actions de calque | Exportez pour enregistrer les annotations de ligne en tant que fichier .annotation. Ajoutez _calib au nom de fichier et placez le fichier dans le sous-dossier qui contient les coordonnées des formes en mosaïque. Copiez l’adresse du dossier principal du projet ou de la session. Ouvrez le script de génération d’importation XML, « Malleator » (disponible via https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022), à l’aide de l’environnement de développement intégré IDLE, puis collez l’adresse du dossier du projet entre les guillemets au bas du script. Sélectionnez le menu déroulant Exécuter | Exécutez Module pour exécuter le script.REMARQUE : Le fichier d’importation LMD .xml sera généré à l’intérieur du sous-dossier créé pour l’image/diapositive. 6. Microdissection laser REMARQUE : Les étapes du protocole décrites dans cette section sont spécifiques à utiliser avec un microscope laser inversé et le logiciel associé (voir la Table des matériaux). Temps approximatif: 2 h; selon le cas. Chargez la lame membranaire marquée (contenant des fiducials d’étalonnage) avec le tissu tourné vers le bas et le côté de l’étiquette plus près de l’opérateur dans le porte-lames sur l’étage du microscope laser. Sélectionnez Importer des formes dans le menu déroulant Fichier . Sélectionnez le fichier d’importation LMD .xml généré pour la diapositive. Sélectionnez Non dans la fenêtre contextuelle pour éviter de charger des points de référence à partir du fichier et Non dans la deuxième fenêtre contextuelle pour éviter d’utiliser des points de référence précédemment stockés pour l’étalonnage. Suivez les instructions de l’application LMD et alignez la croix d’étalonnage sur chacune des trois fiduciales d’étalonnage sur la diapositive. Recherchez les fiducials d’étalonnage qui apparaissent en haut à gauche, en haut à droite et en bas à droite de l’image de diapositive dans le logiciel d’analyse d’image qui correspondront aux points de référence dans les coins avant droit, arrière droit et arrière gauche, respectivement, de la lame LMD inversée sur l’étage du microscope. Basculez entre l’utilisation de l’objectif 5x pour localiser et l’objectif 63x pour aligner chaque fiducial d’étalonnage. Sélectionnez Non dans la fenêtre contextuelle pour éviter d’enregistrer les points de référence dans un fichier et OK dans la deuxième fenêtre contextuelle pour confirmer que la diapositive est insérée. Déplacez l’objectif 5x en position et sélectionnez Oui dans la fenêtre contextuelle pour utiliser le grossissement réel. Une fois que les formes importées apparaissent, concentrez l’appareil photo sur le tissu. Mettez en surbrillance et sélectionnez toutes les formes dans la fenêtre Liste des formes , faites-les glisser en place à l’aide d’une ou deux annotations dans le champ de vision en tant que références et alignez l’axe Z vertical pour la découpe avec le laser. Examinez les formes importées et affectez-les à la position de tube appropriée pour la collecte. Appuyez sur Démarrer la découpe pour démarrer le laser.Remarque : Les formes importées dans le fichier .xml seront automatiquement affectées à la position « sans majuscule » dans la fenêtre Liste des formes . Pour prélever des tissus, les formes importées doivent être réaffectées à une position contenant un tube chargé. 7. Digestion des protéines par la technologie du cycle de pression (PCT) REMARQUE: Temps approximatif: 4 h (3 h sans temps de séchage par centrifugeuse sous vide). Placer des tubes de 0,5 mL contenant les microtubes PCT coiffés contenant du tissu LMD récolté dans 20 μL de 100 mM teaB/10 % d’acétonitrile dans un thermocycleur et chauffer à 99 °C pendant 30 min, puis refroidir à 50 °C pendant 10 min. Faites tourner les tubes pendant 30 s à 4 000 × g , puis retirez les microtubes des tubes de 0,5 mL. À l’aide de l’outil MicroCap, retirez et jetez les MicroCaps des microTubes PCT. Ajouter la trypsine (voir le tableau des matériaux) à un rapport de 1 μg par tissu de 30 mm2 et insérer un MicroPestle dans le MicroTube à l’aide de l’outil MicroCap. Transférez les MicroTubes dans une cartouche de barocycle et assemblez la cartouche complète. Placez la cartouche dans la chambre de pression du barocycle et fixez le couvercle. Barocycle à 45 000 psi pendant 50 s et pression atmosphérique à 10 s à 50 °C pendant 60 cycles. Une fois le barocyclage terminé, transférer les microtubes dans un tube de microcentrifugation de 0,5 mL et centrifuger pendant 2 min à 4 000 × g. Retirez le microtube du tube de microcentrifugation de 0,5 mL à l’aide de l’outil de capuchon. Retirez soigneusement le pilon à l’aide de l’outil de capuchon et rincez la moitié inférieure du pilon avec 20 μL d’eau de qualité chromatographie de masse par chromatographie liquide (LC-MS) et collectez le lavage dans un tube de microcentrifugation propre de 0,5 mL. Tapotez doucement le MicroTube sur la paillasse pour déplacer le liquide vers le bas et transférez toute la solution du MicroTube dans le tube de microcentrifugation de 0,5 mL. Ajoutez 20 μL d’eau de qualité LC-MS au MicroTube et tapotez-le doucement sur la paillasse. Transférer la solution de lavage dans le tube de 0,5 mL et répéter cette étape de lavage une fois de plus. Centrifugeuse sous vide pour sécher les échantillons à ~2 μL et ajouter 100 μL de 100 mM TEAB, pH 8,0. Déterminer la concentration en peptides à l’aide d’un test colorimétrique (dosage de l’acide bicinchoninique (BCA); voir la table des matériaux) selon le protocole du fabricant. 8. Étiquetage de l’étiquette tandem-masse (TMT) et nettoyage EasyPep REMARQUE: Temps approximatif: 7 h 20 min (2 h 20 min sans temps de séchage par centrifugeuse sous vide). Porter les réactifs d’étiquetage TMT isobares à température ambiante avant de les ouvrir. Ajouter 500 μL d’acétonitrile à 100 % à chaque flacon de TMT (5 mg). Incuber pendant 10 min avec des vortex occasionnels. Dissoudre 5 μg de l’échantillon peptidique dans 100 μL de 100 mM de TEAB, pH 8,0, et ajouter 10 μL d’un réactif TMT donné. Construire et inclure des pools de référence représentant chaque échantillon individuel de l’expérience dans chaque ensemble d’échantillons multiplex TMT afin de faciliter la quantification des échantillons sur plusieurs multiplexes TMT9. Incuber les réactions pendant 1 h à température ambiante avec agitation/tapotement occasionnel. Éteindre la réaction de marquage TMT en ajoutant 10 μL d’hydroxylamine à 5% et incuber pendant 30 min à température ambiante avec un taraudage occasionnel. Après trempe, mélanger les échantillons marqués TMT dans un seul tube et sécher à environ 200 μL. Ajouter 1 800 μL d’acide formique à 0,1 %. Vérifiez le pH avec du papier pH: si pH ~ 3, ajoutez 1 mL d’acide formique à 0,1%; si le pH >3, ajouter 10-20 μL d’acide formique à 5% jusqu’à pH ~3. Ajouter 0,1 % d’acide formique pour porter à un volume final de 3 mL. Retirez la languette au bas de la colonne de nettoyage des peptides, retirez le capuchon et placez-le dans un tube conique de 15 mL. Transférez l’échantillon étiqueté TMT dans la colonne et procédez au nettoyage conformément au protocole du fabricant. Centrifugeuse sous vide pour sécher les peptides élués à ~20 μL, transfert dans un flacon de LC à l’aide de 25 mM de bicarbonate d’ammonium pour un volume final de 80 μL et procéder au fractionnement hors ligne. 9. Fractionnement et mise en commun des échantillons multiplex TMT REMARQUE: Temps approximatif: 3 h 30 min (1 h 30 min sans temps de séchage par centrifugeuse sous vide). Fractionner les multiplexes peptidiques marqués TMT par chromatographie de base en phase inversée en 96 fractions en développant un gradient linéaire croissant (0,69 % min-1) de la phase mobile B (acétonitrile) en phase mobile A (10 mM NH4HCO3, pH 8,0). Générez 36 fractions concaténées en regroupant des puits d’échantillonnage. Centrifuger sous vide pour sécher les fractions à ~2 μL et remettre en suspension dans 25 mM de bicarbonate d’ammonium (concentration finale 1,5 μg/10 μL), centrifuger à 15 000 × g pendant 10-15 min, et transférer dans des flacons LC pour analyse MS. 10. Chromatographie liquide spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) REMARQUE: Temps approximatif: Méthode de l’instrument et conception expérimentale dépendants. Calibrez le spectromètre de masse selon les instructions/protocoles du fabricant. Préparer de nouvelles phases et normes mobiles et effectuer les préparations LC pré-série appropriées (y compris, mais sans s’y limiter, les solvants de purge, l’air de rinçage et les scripts de test d’étanchéité pour l’instrument référencé [voir le tableau des matériaux]). Équilibrez les colonnes pré- et analytiques et la boucle d’échantillonnage avant de commencer les analyses. Avant et entre les analyses multiplex TMT en série, validez que le système LC-MS répond aux mesures de performance précédemment étalonnées à l’aide de digestes peptidiques marqués TMT d’assurance qualité/ contrôle de la qualité (QA / QC) et (par exemple, MSPE (voir le tableau des matériaux), HeLa). Chargez les flacons d’échantillonneur automatique dans les positions appropriées dans l’échantillonneur automatique LC. Analysez les fractions individuelles avec une méthode de gradient/MS appropriée. Entrecouper un « lavage » avec un étalon peptidique (p. ex., étalonnage du temps de rétention peptidique [PRTC]) environ une fois par jour pour évaluer la performance chromatographique et spectrale de masse. Après l’analyse de chaque série d’échantillons de fractions multiplex TMT, exécutez les normes de référence QA/QC TMT pour évaluer les performances du système. Exécutez des routines d’évaluation du spectromètre de masse selon les normes de référence QA/QC TMT pour évaluer les performances post-échantillonnage, puis étalonnez le système comme à l’étape 10.1 pour le prochain ensemble d’échantillons. 11. Analyse des données bioinformatiques REMARQUE: Temps approximatif: Dépend de la conception expérimentale. Transférez tous les exemples de données (par exemple, les fichiers .raw) vers un stockage réseau/lecteur d’ordinateur approprié. Recherchez toutes les fractions ensemble à l’aide de l’application d’analyse de données souhaitée (par exemple, Proteome Discover, Mascot) en utilisant les paramètres appropriés9 par rapport à une base de données de référence de protéines spécifiques à une espèce pour générer des correspondances spectrales peptidiques (PSM) et extraire les intensités du signal ionique rapporteur TMT. Filtrer les MSP en fonction des mesures de contrôle de la qualité appropriées et agréger les abondances normalisées, médianes du rapport ionique rapporteur TMT transformées log2 en abondances globales au niveau des protéines, comme décrit précédemment 3,9. Comparez les altérations protéiques dans des conditions d’intérêt à l’aide du logiciel d’analyse différentielle souhaité.