דיסקציה ידנית של Caenorhabditis elegans מעיים
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך לבידוד מעיים מתולעי נמטודת Caenorhabditis elegans בוגרות ביד לצורך קלט בגנומיקה, פרוטאומיקה, מיקרוביום או מבחנים אחרים.
Abstract
המעי Caenorhabditis elegans , המורכב מ-20 תאים בלבד, הוא הקשר של תפקודים תומכי חיים רבים, כולל עיכול, חילוף חומרים, הזדקנות, חסינות ותגובה סביבתית. אינטראקציות קריטיות בין ה-C. elegans המארח לבין סביבתו מתכנסות בתוך המעי, שם מרוכזת המיקרוביוטה של המעיים. לכן, היכולת לבודד רקמת המעי הרחק משאר התולעת נחוצה כדי להעריך תהליכים ספציפיים למעי. פרוטוקול זה מתאר שיטה לניתוח ידני של מעי C. elegans בוגרים. ניתן לבצע את ההליך בזנים המסומנים בפלואורסצנטיות למטרות קלות או אימון. לאחר שהטכניקה מושלמת, ניתן לאסוף מעיים מתולעים ללא תווית של כל גנוטיפ. גישה זו של מיקרו-דיסקציה מאפשרת לכידה בו-זמנית של רקמת המעי המארח ושל מיקרוביוטה של המעיים, יתרון למחקרי מיקרוביום רבים. ככזה, יישומים במורד הזרם עבור תכשירי המעיים שנוצרו על ידי פרוטוקול זה יכולים לכלול, בין היתר, בידוד RNA מתאי מעיים ובידוד DNA ממיקרוביוטה שנלכדה. באופן כללי, ניתוח ידני של מעי C. elegans מאפשר שיטה פשוטה וחזקה לחקור היבטים קריטיים של הביולוגיה של המעי.
Introduction
תולעת הנמטודה Caenorhabditis elegans, עם 959 תאים בלבד ומחזור חיים של 4 ימים מביצה לביצה, היא מערכת מודל אידיאלית למחקרים גנטיים, גנומיים והתפתחותיים רבים 1,2. קלות הסינון הגנטי קדימה ואחורה, השכיחות של סמנים פלואורסצנטיים מהונדסים, היכולת לבצע עריכת גנום ספציפית לנוקלאוטידים והמשאבים הרבים ברחבי הקהילה תרמו כולם לתגליות ולתובנות משמעותיות במערכת C. elegans. עם זאת, חסרון משמעותי הוא הקושי להשיג אוכלוסיות טהורות של תאים, רקמות או איברים, שהם קטנים, שבריריים ויכולים להיות מחוברים זה לזה. מכיוון שאוכלוסיות טהורות של תאים חשובות למבחני גנומיקה כגון RNA-seq, ChIP-seq ו- ATAC-seq, התפתחו מספר גישות להשגת תכשירים טהורים של תאים, רקמות ואיברים של C. elegans. כאן מתוארת שיטה לניתוח ידני של מעיים, בחלקים גדולים, מתוך תולעים בוגרות מסוג C. elegans. התכשירים שהתקבלו מתאימים למבחנים גנומיים במורד הזרם (איור 1).
שיטת כריתת הרקמות בקנה מידה עדין המתוארת כאן (איור 2) היא רק גישה אחת. טכניקות חלופיות אחרות – כגון תיוג מולקולרי, פירוק תולעים וטיהור סוגי תאים בעלי עניין באמצעות מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS) ואנליזה לאחר הוק – שימשו גם הן בהצלחה לסקר את התכונות הספציפיות לרקמות של הביולוגיה המולקולרית של C. elegans. עם זאת, יתרון של דיסקציה ידנית על פני גישות אחרות אלה הוא שניתן להשתמש בה כדי לחקור בו-זמנית את התכונות של המעי C. elegans ותכולת החיידקיםשלו 3,4,5. זה מאפשר ריצוף גנים של 16S rRNA ומקל על מחקרי מיקרוביום בתוך מערכת C. elegans. מגבלה חשובה, עם זאת, היא שתאי מעיים אינם מבודדים בנפרד.
תיוג מולקולרי מקנה תג ספציפי לסוג תא למולקולות רק בתוך הרקמה או התאים שצוינו. לאחר מכן ניתן לבודד תגים אלה מסך ההכנות של התולעים. בדרך זו, מקדמים ספציפיים לרקמות המניעים חלבון קושר פוליA מתויג או מנהיג שחבור אפשרו פרופיל תעתיק ספציפי לרקמות 6,7,8,9,10 ומיפוי 3’UTR 11,12. באופן דומה, פרופילי פקטורי שעתוק ספציפיים לרקמות נערכו באמצעות ChIP-seq ו-DamID, שבהם נוספו וריאנטים של פקטורי שעתוק ספציפיים לקידום עם תגים או היתוך אנזים13,14.
FACS מאפשר לבודד סוגי תאים בעלי עניין מתולעים מנותקות בהתבסס על המאפיינים התאיים הפנימיים שלהם ותכונותיהם הפלואורסצנטיות. גישה זו יצרה תעתיקים ספציפיים לרקמות מאיברים מגוונים 8,15,16 וסוגי תאים עצביים בודדים 8,9,15,16,17,18 ושימשה ליצירת מפת ביטוי של כל מערכת העצבים C. elegans 19,20 . FACS, ובן דודו מיון גרעינים המופעלים על ידי פלואורסצנציה (FANS), שימשו גם ליצירת פרופילי כרומטין ספציפיים לתאים21,22.
לבסוף, ניתוח לאחר הוק יכול להתבצע במבחנים ברזולוציה של תא בודד. בשיטה זו, כל התאים הבודדים נסקרים, סוג התא של כל אחד מהם מיוחס בשלב הניתוח, וסוגי התאים המעניינים מסוננים באופן סלקטיבי למחקר נוסף. ניתוח פוסט-הוק שימש בהצלחה להשגת תעתיקים של תאים מתפתחים ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה בעוברי C. elegans 23,24,25,26,27 ותולעי שלב L1 28. נגישות הכרומטין אופיינה גם בשימוש ב-ATAC-seq במקום ב-RNA-seq באמצעות אסטרטגיה דומה29.
לכל גישה יתרונות ומגבלות. עבור המעי C. elegans, פירוק תולעים ובידוד FACS של תאי מעיים הוא בר השגה בשלבי העובר והזחל30 אך הוא מאתגר במבוגרים. הסברה היא שהסיבה לכך היא שהתאים הגדולים של המעי, בעלי הכפילות האנדו-ריפוליסטית והדבקות החזקה, מקשים עליהם להתנתק ללא פגע. שיטת נתיחת היד המתוארת כאן עוקפת אתגרים אלה, ומאפשרת בידוד של חלקים גדולים במעי התולעת הבוגרת. הנוהג של יד לנתח גונדות מאותו שלב הוא נפוץ ופשוט. דיסקציה של המעי דומה לדיסקציה של גונד אך פחות מבוצעת32. הפרוטוקול המוצג כאן מותאם מפרוטוקול ארוך יותר, שלא פורסם, שפותח על ידי ד”ר ג’יימס מקגי וברב גושצ’ינסקי. פרוטוקול יעיל זה שואל טכניקות לבידוד בלסטומרים מעוברים בשלב מוקדם 23,33,34,35. למרות שדיסקציה ידנית אינה אפשרית לבידוד רוב סוגי התאים או הרקמות ב– C. elegans, היא אידיאלית לבידוד מעיים מתולעים בוגרות. לכן, דיסקציה ידנית משלימה אמצעים אחרים להשגת תכשירי תאים ספציפיים למעי.
Protocol
תולעי CL2122 שימשו למחקר הנוכחי. התולעים הושגו באמצעות המרכז לגנטיקה של Caenorhabditis (CGC, ראו טבלת חומרים), במימון משרד תוכניות תשתית המחקר של NIH (P40 OD010440). 1. גידול תולעים לנתיחה הגדל צלחת אחת גדולה של תולעי CL2122 בשלב מעורב לסנכרון בהתאם להליכי גידול סטנדרטיים (כלומר, לוחות NGM שנזרעו עם E. coli OP50)36,37.הערה: בדרך כלל לוקח ~ 96 שעות כדי להגיע ליכולת הטלת ביצים מקסימלית.העובר מכין את התולעים בטווח של 72-96 שעות. לאחר הכנת העובר, אפשרו לעוברים לבקוע ב-M9 (ראו טבלה 1) למשך 48 שעות. זה יניב אוכלוסייה סינכרונית של תולעי שלב L1.הערה: תולעי CL2122 מכילות טרנסגן-GFP משולב (חלבון פלואורסצנטי ירוק) המונע ממקדם mtl-2 ספציפי למעי (MeTaLlothionein 2)38. מקדם זה הוא ספציפי לציטופלסמה של תאי המעי ומאפשר לדמיין את המעי במיקרוסקופ דיסקציה פלואורסצנטי. לאחר ההכשרה, ייתכן שמשתמשים לא ימצאו צורך בהדרכה פלואורסצנטית. צלחת מסונכרנת L1 תולעים על מינימום של שתי צלחות קטנות. לגדל תולעים על צלחות NGM עם מספיק מזון עד שהם מגיעים לשלב הבוגר (מזוהה על ידי נוכחות של עוברים המסוגלים להטיל ביצים). זה לוקח בין 38-46 שעות ב 20 מעלות צלזיוס.הקפידו לוודא שאותו שלב התפתחותי נקצר על פני שכפולים ועל פני זנים השוואתיים.הערה: משך הזמן לגידול התולעים תלוי בזן, בטמפרטורה, במקור המזון ובשלב ההתפתחותיהמיועד 39. ניתן להשתמש גם בשלבים אחרים ליד שלב הבוגרים, כגון L4 ושלבים למבוגרים יותר. לצורך תכנון ניסויים במיקרוביום, מקורות מזון חיידקיים שונים מעבר למקור המזון המסורתי (E. coli OP50) יכולים לשמש לגידול תולעים, כגון זני CeMbio4 או פתוגן מעניין40. 2. הכנת פתרונות מלאי ופיפטות מיקרו-קפילריות הערה: טבלה 1 מספקת את הפרטים של כל המאגרים והפתרונות ששימשו למחקר הנוכחי. הכינו 50 מ”ל של מלחי ביצים (a.k.a., חיץ ביצים) בצינור חרוטי נטול נוקלאז (ראו טבלת חומרים). לאחר ההכנה, יש לאחסן בטמפרטורת החדר. הכן 10 מ”ל של 100 mM תמיסת מלאי levamisole בצינור חרוטי ללא נוקלאזה. לאחר ההכנה, הכינו 500 μL aliquots ואחסנו אותם בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס. Aliquots ניתן להפשיר ולאחסן ב 4 °C (64 °F) במשך שבוע אחד בכל פעם. הכינו 1 מ”ל של תמיסת אלבומין (BSA) בסרום בקר במינון 20 מ”ג/מ”ל בצינור מיקרוצנטריפוגה נטול נוקלאז. לאחר ההכנה, הכינו 50 μL לשימוש חד פעמי ואחסנו אותם בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס.הערה: חשוב להשתמש בגרסה האצטילטית של BSA מכיוון שזו הצורה היחידה של BSA שאינה מכילה נוקלאזות. BSA שאינו אצטילציה יכול להיות מקור משמעותי של nucleases, ובכך, להוביל השפלה של דגימות. הכן לפחות חמישה פיפטות מיקרו-קפילריות של 50 מיקרומטר ו-100 מיקרומטר כל אחת לפי השלבים הבאים.ראשית, משוך נימי זכוכית סטנדרטיים (4 אינץ’ אורך וקוטר חיצוני של 1.2 מ”מ) לצורת מחט הזרקה באמצעות מושך מחט (ראו טבלת חומרים) ותנאים ל”תא דבק, C. elegans, & Drosophila” מתוך ספר הבישול של Sutter Instruments Pipette41 (תנאים: חום = רמפה + 5; משיכה = 100; Vel. = 75; עיכוב = 90; לחץ = 500; קופסה של 2.5 מ”מ x 2.5 מ”מ). לאחר מכן, זייפו את הפיפטות המיקרו-קפילריות לגודל של 50 מיקרומטר (שלושה סימני שנתות כפי שמצוין על ידי סרגל העיניים של microforge תחת המטרה M5/0.1) או לגודל של 100 מיקרומטר (חמישה סימני שנתות באותם תנאים) באמצעות מיקרופורג’ (ראו טבלת חומרים). גדלים אלה מייצגים את קוטר הפתח המשוער של הפיפטה המיקרו-קפילרית (איור 3). לאחר מכן, הצמידו צינור שואב לפה לפיפטות המיקרו-קפילריות.הערה: פיפטות אספירטור נשלטות באופן מסורתי על ידי פיפטינג פיות, אך פרוטוקולי בטיחות מודרניים רבים אוסרים על שיטה זו. ככזה, משתמשים יכולים לשלוט בשאיפה עם צינורות שואפי הפה על ידי צביטה של הצינור בין האצבע לאגודל. בנוסף, ניתן להתקין מסנן מזרק בתוך מערכת צינורות שואב הפה לתוספת בטיחות. 3. הכנה ניסיונית הכן 5 מ”ל של חיץ דיסקציה בצינור חרוטי ללא נוקלאזה. יש לאחסן בטמפרטורת החדר. הכן 1 מ”ל של תמיסת BSA אצטילטית עובדת בצינור מיקרוצנטריפוגה ללא נוקלאז. שמור על קרח. הפק 350 μL של תמיסת לבאמיזול עובדת בצינור מיקרוצנטריפוגה ללא נוקלאזות. מכינים במשולש (צינור אחד לכ-20 תולעים). שמור על קרח. הכינו חיץ כלציה בצינור מיקרוצנטריפוגה נטול נוקלאז (טבלה 1). עושים שכפול (צינור אחד לכ-10 תולעים חתוכות). שמור על קרח. שימוש במאגר כלציה במהלך נתיחות ידניות משפר את איכות וכמות הרנ”א (איור 4). הכן שפופרת מיקרוצנטריפוגה אחת לכל קבוצת ניסוי המכילה 500 μL של מגיב לבידוד חומצות גרעין או מגיב בידוד שצוין על ידי ערכה (ראה טבלת חומרים) בצינור ללא נוקלאזות. שמור על קרח. צינור זה ישמש לאיסוף המעיים הסופיים והמבודדים לאחסון או לשימוש מאוחר יותר. הכינו אמבט M9 אחד ואמבטיית חיץ דיסקציה אחת. לשם כך, השג שתי צלחות פטרי סטריליות בקוטר 35 מ”מ. לאחר מכן, להוסיף 2 מ”ל של M9 למנה אחת ו 2 מ”ל של חיץ דיסקציה לשני. לבסוף, הוסף 100 μL של תמיסת BSA עובדת לכל אמבטיה. מערבלים כדי לערבב. הוספת BSA לאמבטיות תמנע מהתולעים להידבק לפלסטיק. הכן את מערך הנתיחה. השג שקופית קעורה של 2 בארות (ראה טבלת חומרים) והוסף 150 μL של תמיסת לבאמיזול עובד לבאר הראשונה. לאחר מכן, הוסף 150 μL של מאגר דיסקציה לבאר השנייה. לבסוף, הוסף 20 μL של פתרון BSA עובד לכל באר. הוספת BSA לכל באר תמנע מהתולעים להידבק לשקופית. 4. דיסקציה ידנית של המעי C. elegans באמצעות בחירת תולעים, העבירו 20 תולעים בוגרות מצלחת ה-NGM לאמבטיית M9 (שלב 3.6). זה ישטוף חיידקים חיצוניים מהתולעים. לאחר מכן, העבר את כל 20 התולעים מאמבטיית M9 לאמבטיית חיץ הנתיחה (שלב 3.6). זה ישטוף עוד יותר חיידקים חיצוניים וישווה את התולעים במאגר הדיסקציה. לאחר מכן, העבר קבוצות של תולעים (כלומר, בקבוצות של 10) מאמבטיית חיץ הדיסקציה לתמיסת הלבאמיזול המכילה היטב (שלב 3.7).הערה: Levamisole ישתק באופן זמני את התולעים.לאחר שתנועות התולעת מאטות, העבירו אותן במהירות מבאר הלבאמיזול לבאר המכילה את מאגר הנתיחה (שלב 3.7). היזהרו לא לשתק יתר על המידה את התולעים.הערה: מספר התולעים המועברות באצוות לתמיסת הלבאמיזול עשוי להשתנות בהתאם לנוחות המשתמש. זה נכון גם לגבי מספר התולעים שנקטפו בתחילה לאמבטיית M9 ולאחר מכן עברו לאמבטיית חיץ הנתיחה. זה נוהג טוב יש תולעים נוספות זמין עבור דיסקציה, במיוחד במהלך האימון, כמו המשתמש לומד ומקבל נוח עם הפרוטוקול. לאחר מכן, אפשרו לתולעים להתחיל לנוע מעט במאגר הדיסקציה לפני תחילת הנתיחות.הערה: המעיים אינם בוקעים היטב מתולעים משותקות יתר על המידה (כלומר, תולעים שאינן זזות כלל). כשהן מוכנות, נתחו את התולעים תחת היקף ניתוח פלואורסצנטי באמצעות מחט היפודרמית (כלומר, 27 גרם x 1/2 אינץ’) (ראו טבלת חומרים) על-ידי חיתוך אחד ממש מאחורי הלוע (איור 5Aa) או ממש לפני פי הטבעת (איור 5Ab). זה יפיק שני חלקים גדולים של המעי, חצי קדמי-אמצעי וחצי אחורי. המשך דפוס זה עבור שאר התולעים, תוך שמירה על מספר מקטעי המעי המתקבלים מהחלקים הקדמיים-אמצעיים והאמצעיים האחוריים שווה ערך עד לרכישת המספר הכולל הרצוי של המעיים.הערה: הדבקת המחט ההיפודרמית לחבית מזרק ריקה של 1 מ”ל יכולה לסייע במניפולציה שלה במהלך נתיחות ידיים. בהתאם לנוחות ולניסיון של המשתמש, אין זה נדיר לבצע חתך דיסקציה שאינו מניב שבר מעיים. עם זאת, עם תרגול, זה הופך להיות הרבה פחות נפוץ. המתן כדקה עד שהמעיים יובלטו באופן מקסימלי מהגוף. הם בדרך כלל לובשים צורת לולאה ועשויים להיות דבוקים לחלק מהגונדות (איור 5A). בזמן ההמתנה, הוסיפו 50 μL של מאגר כלציה לבאר כדי לעזור להפחית את פירוק הרנ”א (איור 4). בזמן ההמתנה וכדי להקל עוד יותר על שחול המעי, השתמש בפיפטה מיקרו-קפילרית בגודל 100 מיקרומטר המחוברת לשואב את המעי/התולעת פנימה והחוצה מהפיפטה (איור 5B). זה גם יעזור לשחרר את המעי מן הגונד. היזהרו לא לאבד את המעי על ידי מציצתו בטעות לתוך פיפטה microcapillary.הערה: המשתמש יכול להחליף בין פיפטות מיקרו-קפילריות של 100 מיקרומטר ל-50 מיקרומטר כדי לשחרר את המעי משאר הגוף והגונד. הפתח בקוטר הקטן יותר של פיפטה מיקרו-קפילרית בקוטר 50 מיקרומטר עשוי להעניק יתרון להסרת חתיכות דביקות מהמעי. פיפטות אספירטור נשלטות באופן מסורתי על ידי פיפטות פה, אך פרוטוקולי בטיחות מודרניים רבים אוסרים על שיטה זו. ככזה, משתמשים יכולים לשלוט בשאיפה עם צינורות שואפי הפה על ידי צביטה של הצינור בין האצבע לאגודל. בנוסף, ניתן להתקין מסנן מזרק בתוך מערכת צינורות שואב הפה לתוספת בטיחות. ברגע שהמעי מובלט מספיק, השתמש במחט היפודרמית של 27 גרם כדי לחתוך אותה משאר הגוף ומכל הגונד שנותר. גודל קטע המעי המבודד יכול להשתנות במידה רבה בהתאם לניסיון של הקוצר, איכות החתך ורמת השיתוק בתולעת.הערה: ניתן לנטר בקלות את שלמות המעי ושברי המעיים לאורך כל הפרוטוקול באמצעות פלואורסצנציית GFP שלהם. כעת, השתמש בפיפטה המיקרו-קפילרית כדי לשאוף את קטע המעי ולהעביר אותו אל מחוץ לבאר ואל תוך צינור המיקרוצנטריפוגה המכיל מגיב לבידוד חומצות גרעין או מגיב בידוד שצוין על-ידי הערכה. יש לשמור את המעיים המבודדים בריאגנט על הקרח ולחזור על הפעולה עבור המעיים הנותרים.הערה: ניתן להוסיף מעיים מרובים לצינור המיקרוצנטריפוגה המכיל מגיב לבידוד חומצות גרעין או מגיב בידוד אחר שצוין על-ידי הערכה במהלך היום. שמור על קרח. אם לא ניתן לבודד את כל המעיים ביום אחד, אלה שכבר מבודדים ומאוחסנים בריאגנט לבידוד חומצות גרעין (המשמר את חומצות הגרעין) יכולים להישמר בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס עד לחידוש הבידודים ו/או להשלמתם. כאן, הדגימות יציבות לטווח ארוך (כלומר, מספר חודשים עד שנה) ויכולות להישאר עד שיהיו מוכנות לבודד חומצות גרעין. ניתן לקצור מעיים למים או לכל חיץ ליזיס ספציפי לערכה. עם זאת, יש לתת את הדעת בעת קביעת משך הזמן שבו המעיים יכולים להישאר במאגר נתון על קרח (או בטמפרטורה רצויה אחרת) לפני המעבר ליישומים במורד הזרם. 5. בידוד RNA ממעיים מנותקים הומוגניות של הרקמות הנרכשות המאוחסנות בריאגנט לבידוד חומצות גרעין על ידי ביצוע שלושה מחזורי הקפאה/הפשרה/מערבולת. כדי לעשות זאת, השתמש באמבט חרוזים של 37 מעלות צלזיוס ובחנקן נוזלי (או באמצעים דומים אחרים). לאחר מכן, הוסף 0.2 כרכים של פנול:כלורופורם:מגיב IAA (ראה טבלת חומרים) לדגימה ולמערבולת בקצרה. לדוגמה, עבור נפח מדגם התחלתי של 500 μL, 0.2 נפחים של כלורופורם יהיו 100 μL. לנער את הצינור ביד במשך 20 שניות, ולאחר מכן לדגור בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות. הפרד את שלבי הדגימה על ידי צנטריפוגה (10,000 x גרם, 18 דקות, 4 מעלות צלזיוס). הסר את הפאזה המימית והעבר לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש ללא נוקלאזה.הערה: הקפד לא לשאוף או להפריע לממשק. לאחר מכן, הוסיפו נפח שווה של 100% אתנול לשלב המימי ונערו את הדגימה ביד במשך 20 שניות. העבר 700 μL של הדגימה לעמודת הספין (ראה טבלת חומרים). לאחר מכן, הדבק RNA לעמודה עם צנטריפוגה (≥8,000 x גרם, 30 שניות, RT [טמפרטורת החדר]). בטל את הזרימה. חזור על הפעולה עבור כל דגימה נוספת שנותרה. הוסף 350 μL של מאגר RW1 (ראה טבלת חומרים) לעמודה כדי לשטוף את הדגימה. לאחר מכן, צנטריפוגה (≥8,000 x גרם, 30 שניות, RT) ולהשליך את הזרימה. בצע עיכול DNA על עמודה. הוסף 80 μL של DNase I במאגר RDD (ראה טבלת חומרים) לעמודה לדוגמה. לאחר מכן, דגירה במשך 15 דקות ב- RT. לאחר מכן, הוסף 350 μL של מאגר RW1 לעמודה כדי לשטוף את הדגימה. צנטריפוגה (≥8,000 x גרם, 30 שניות, RT) ולהעביר את העמודה לצינור איסוף חדש. השליכו את צינור האיסוף הישן והזורם. שטיפה זו מסירה את ה-DNase. הוסף 500 μL של RPE (ראה טבלת חומרים) לעמודה לדוגמה. לאחר מכן, צנטריפוגה (≥8,000 x גרם, 30 שניות, RT) ולהשליך את הזרימה. יש לחזור על הפעולה לשטיפה שנייה. לאחר מכן, צנטריפוגה למשך דקה אחת נוספת כדי לייבש עוד יותר את קרום העמודה (≥8,000 x g, 1 דקה, RT). לאחר מכן, העבר את עמודת הדגימה לצינור איסוף מיקרוצנטריפוגה טרי ללא נוקלאז עם מכסה. השליכו את צינור האיסוף הישן והזורם. הוסף 14 μL של מים ללא נוקלאז ישירות לקרום של עמודת הדגימה. לאחר מכן, דגירה של הדגימה למשך 2 דקות ב- RT. לאחר מכן, צנטריפוגה (≥8,000 x גרם, דקה אחת, RT) כדי לרומם את הרנ”א. אחסנו את הדגימה על קרח. לאחר מכן, הערך את איכות וכמות ה-RNA של הדגימה באמצעות ערכות בדיקה זמינות מסחרית (ראה טבלת החומרים). לאחר שתסיים, אחסן את הדגימה במקפיא של −80 מעלות צלזיוס.הערה: RNA הוא בדרך כלל יציב ב -80 מעלות צלזיוס למשך עד שנה אחת ללא השפלה.
Representative Results
הפרוטוקול הנוכחי שימש לבידוד חלקים גדולים של המעי מ-C. elegans בוגרים ביד (איור 2). דגימת המעי הסופית של כל קבוצת ניסוי המוצגת מורכבת מאוסף שווה של מקטעי המעי הקדמי-אמצעי-אחורי. עם זאת, בהתאם לשאלת הניסוי, הוא יכול גם לכלול אוסף של חלקי המעי הקדמי, האמצעי או האחורי בלבד. יחד, מוצגות שלוש תוצאות מייצגות עבור פרוטוקול זה. הראשון מתאר את הדיסקציה והבידוד המוצלחים של המעיים (איור 6). השנייה מדווחת על תוצאות של בידוד RNA ממעיים מבודדים (איור 7). השלישי מראה את התוצאות של מעקב מיקרוביאלי ממעיים מבודדים (איור 8). עבור התוצאה הראשונה, איור 6A מראה כיצד נראה מעי שהובלט לאחר ביצוע חתך ראשוני באתר “a” באיור 5A בתוך תולעי CL2122 בוגרות. מכיוון שתולעי CL2122 מכילות את מקדם mtl-2 הספציפי למעי שהתמזג עם GFP (mtl-2 p::GFP), מעיים מבודדים יזהרו בירוק תחת היקף החיתוך הפלואורסצנטי. הדיסקציה המוצלחת של מקטע מעיים מוצגת באיור 6B. חלק מעי זה נקי ממזהמים גלויים כגון פסולת מהגונד או הפגר. לעומת זאת, איור 6C מציג מעיים שלא נותחו בהצלחה, שכן גונד ופגר עדיין מחוברים באופן נראה לעין למקטע המעיים. עבור התוצאה השנייה, המעיים נקטפו לריאגנט לבידוד חומצות גרעין ועובדו למחרת באמצעות פרוטוקול מיצוי RNA כולל עם קלט נמוך (ראו טבלת חומרים). דגימת מעי סופית של 60 מקטעי מעי סה”כ מהחלקים הקדמיים-אמצעיים והאמצעיים-אחוריים מניבה בערך 15 ננוגרם של RNA כולל באיכות גבוהה (איור 7A). כמות זו של המעיים הכוללים ניתן להשיג בקלות ביום אחד, אך ניתן גם לפרק אותה על פני מספר ימים במידת הצורך. תפוקות רנ”א מדיסקציה ידנית יעילות יותר מפירוק תולעים ובידוד FACS של תאי מעיים, בכך שמאות אלפי תאי מעיים נדרשים כדי להשיג כמויות תואמות של סך הרנ”א (איור 7B). חשוב לציין כי תפוקות ה-RNA הנוצרות על-ידי דיסקציה ידנית הן די והותר כקלט עבור ערכות ספריית RNA-seq מסחריות (כלומר, NEBNext Ultra II ו-NEBNext Single Cell/Low Input), שיכולות לקחת עד 2 pg של RNA. עבור התוצאה השלישית, המעיים נקטפו לתוך ddH20 סטרילי ועובדו באותו יום באמצעות ערכת בידוד DNA מיקרוביאלית מסחרית (ראו טבלת חומרים). דגימת מעי סופית של 40 מקטעי מעי כוללים מהחלקים הקדמיים-אמצעיים והאמצעיים-אחוריים מניבה כ-0.009 pg של סך הדנ”א המיקרוביאלי באמצעות בדיקת זיהוי פאן-בקטריאלית (ראו טבלת חומרים) (איור 8). כמויות אלה נמוכות מדי עבור שיטות כימות מסורתיות ויש לבצע אקסטרפולציה מעקומות סטנדרטיות qPCR. באופן אידיאלי, משתמשים צריכים להתמקד בכמות כוללת סופית של מעיים >40 מכיוון שהדבר מגדיל את גבול הזיהוי ואת הגבול של אות לרעש לגבי רמות זיהום מגיבים. כאשר שוקלים תכנון ניסוי, איסוף דגימות בקרה מתאימות הוא תמיד הכרחי. עבור ניסויי תעתיק, בקרה ניסיונית מתאימה יכולה לכלול הכנות של התולעת כולה שנאספה באותו אופן כמו מעיים. במהלך דיסקציה ובידוד של מעיים מ C. elegans, עם זאת, זה נפוץ לראות חתיכות של פגר וגונד נצמד למקטעי המעי. בעוד שבאופן אידיאלי רקמות מזהמות אלה יוסרו מהמעיים לפני האחסון לשימוש במורד הזרם, בקרות ניסיוניות נוספות יכולות לכלול את איסוף פגרי התולעים שנותרו לאחר נתיחת המעי ו/או איסוף גונדות מנותחות. עבור ניסויים במיקרוביום, בקרות יכולות לכלול גם תכשירים של התולעת כולה שנאספה באותו אופן כמו מעיים, בנוסף לבקרות חיוביות קונבנציונליות (תרבית חיידקים) ושליליות (מים). איור 1: כריתת מעיים ידניים מ-C. elegans בוגרים המשמשת ליצירת תכשירים ספציפיים לרקמות לשימוש במגוון רחב של מבחני omics במורד הזרם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 2: סכימה לפרוטוקול דיסקציה ידנית. פרוטוקול זה שימש לבידוד חלקים גדולים של המעי מ – C. elegans בוגרים ביד. ניתן לבודד את המעיים עבור בדיקות שונות במורד הזרם. מוצג כאן השימוש במעיים לבידוד RNA ובידוד DNA מיקרוביאלי. תמונה שנוצרה באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 3: ייצור פיפטה מיקרו-קפילרית. (A) פיפטה מיקרו-קפילרית טרייה אך לא מזויפת מוצגת דרך חתיכת העין של מיקרופורג’. סרגל עיניים משמש למדידת פיפטות מיקרו-קפילריות בגודל 50 מיקרומטר לקוטר פנימי משוער של שלושה סימני שנתות (מוצג, מסומן על ידי חץ). (B) פיפטות מיקרו-קפילריות לא מזוהות, 50 מיקרומטר ו-100 מיקרו-מטר מוצגות תחת היקף החיתוך לצד סרגל כיול עם 1 div = 0.1 מ”מ. (C) הפיפטות המיקרו-קפילריות של 50 מיקרומטר ו-100 מיקרומטר מ-(B) מוצגות שוב אך מנקודת תצפית אחרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 4: השימוש במאגר כלציה (CB) במהלך דיסקציה ידנית כדי לשפר את תפוקת ה-RNA. פרוטוקול מיצוי RNA כולל עם קלט נמוך יצר תכשירי RNA מרקמות בעלות שם. אלקטרופורזה מייצגת של ג’ל המאפיינת את איכות הרנ”א הכוללת המבודדת (RIN, מספר שלמות RNA) ואת הכמות מוצגות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 5: שלבי נתיחה ידנית . (A) שלבי הדיסקציה המתוארים בפרוטוקול מתוארים כאן. ב-(1), המעי של התולעת הוא הדמיה על ידי פלואורסצנציה GFP. ניתן לחלק את אתר החתך הראשי באופן שווה בין התולעים כדי להבטיח כיסוי אחיד לכל אורך המעי. לחלופין, ניתן לבחור אתרי חתך ראשוניים “a” או “b” כדי לקבל הכנה קדמית-אמצעית או אמצעית-אחורית ספציפית למקטע המעי. ב-(2), המעי התפשט, וקיבל צורה של לולאה. ב-(3), המעי נחתך תחילה מגוף התולעת תוך ניסיון לשחרר אותו מהפגר והגונאדה. לאחר מכן מוציאים את המעי מכל פגר או גונד שנותרו שלא ניתן להסירו. ב-(4), חלק מנוקה של המעי מבודד ומוכן לאחסון. (B) שלב קריטי הוא לעקור כל פסולת נצמדת (כלומר, גונד, פגר) מהמעי על ידי העברתה פנימה והחוצה מהפיפטה המיקרו-קפילרית המעוצבת בקצה שואב הפה. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 6: תוצאות מייצגות של שלבי נתיחת ידיים. תמונה מייצגת המציגה (A) את שחול המעי מהתולעת. אלה הן תולעים של הגנוטיפ CL2122, המבטאות GFP תחת מקדם mtl-2 ספציפי לתאי המעי. שתי תמונות מייצגות מראות (B) מקטע נקי ומבודד לחלוטין של המעי ו-(C) מעי מבודד עם רקמות גונד ופגר מזהמות. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 7: תוצאות מייצגות של מיצוי RNA כולל ממעיים מבודדים . (A) מוצגת תמונה מייצגת של תכשירי RNA שנפתרו על-ידי אלקטרופורזה של ג’ל אגרוז, המאפיינת את האיכות (RINs, מספר שלמות ה-RNA) ואת הכמות של סך הרנ”א המבודד. (B) לשם השוואה מוצג ג’ל מייצג של סך הרנ”א שבודד מתאי מעיים שנקטפו מתולעי שלב L1 באמצעות מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS). ב-20 תאים למעי, ניתן להסיק ששיטת כריתת היד מניבה יותר RNA כולל לכל מעי מאשר תאי מעי מטוהרים ב-FACS. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 8: תוצאות מייצגות עבור מיצוי דנ”א מיקרוביאלי כולל ממעיים מבודדים. ערכה מסחרית לבידוד דנ”א מיקרוביאלי יצרה תכשירי דנ”א ממעיים, מתולעים שלמות ומבקרות. בדיקת גנים פאן-בקטריאליים שימשה לכימות מספר החיידקים בדגימות. תמונה מייצגת של (A) עקומות ההגברה qPCR שנוצרו, (B) העקומה הסטנדרטית E. coli OP50 המשמשת לכימות הדגימות, ו-(C) הדגימות מוצגות. ב-(B), הריכוזים ההתחלתיים של תקני E. coli מוצגים כנגד ערכיC T שלהם. ב-(C), שני שכפולים (חזרות) של 40 תולעים שלמות נחתכו באופן מדיאלי, ו-40 מקטעי מעיים מבודדים עובדו לבידוד gDNA מיקרוביאלי. בקרת ללא תבנית (NTC) מהפעלת qPCR מוצגת גם היא. ציר Y מייצג את ערכיC T לדוגמה. כמות הדנ”א המאומתת מ-PCR מוצגת כערכי פיקוגרמות (pg) מעל פסי הדגימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. טבלה 1: הרכבי המאגרים והתמיסות ששימשו במחקר זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Discussion
מאמר זה מתאר את הפרוטוקול שלב אחר שלב לניתוח ידני של מעיים מ – C. elegans בוגרים, מה שיוצר הכנות טהורות לבדיקות במורד הזרם. צעדים קריטיים בפרוטוקול זה כוללים (1) הקפדה שלא לשתק יתר על המידה את התולעים, (2) ביצוע חיתוכי דיסקציה מדויקים, (3) יצירת מיקרו-פיפטות בגודל מתאים לנתיחה, ו-(4) הבטחת התאוששות מהירה של מעיים בריאים במהלך הקציר הסופי. מסיבות אלה, יש לנקוט בזהירות בעת חשיפת תולעים לתמיסת הלבאמיזול, ויש לרענן את המחטים ההיפודרמיות לעתים קרובות כדי להבטיח חדות מקסימלית. טיפול במעי באמצעות פיפטה מיקרו-קפילרית ושואף פה הוא צעד נוסף שידרוש תרגול. מיקרו-פיפטות מזויפות כראוי בגודל המתאים גם עושות הבדל משמעותי בבידוד חלקים גדולים של המעי במהלך דיסקציות, בנוסף להפחתת הסיכון לאבד מעיים בתוך המיקרו-פיפטה. משתמשי פרוטוקול חדש בדרך כלל מאבדים מעיים בקצה הפנימי של פיפטה מיקרו-קפילרית לפני שהם יכולים להיפלט לתוך מגיב הבידוד. בעיה זו יכולה להיות מתוקנת עם תרגול פיפטות microcapillary מזויף כראוי.
הפרוטוקול המתואר כאן נועד לשימוש בתולעים בוגרות. ניסויים ראשוניים תומכים בכך שפרוטוקול זה יעיל לשימוש גם בתולעי L4 ותולעים מבוגרות יותר. עם זאת, היעילות של פרוטוקול זה עדיין לא הוערכה בתולעים בשלב הזחל המוקדם. מגבלה של גישה זו היא כמות החומר הקטנה שהיא מניבה. למרות שהכמויות מספיקות עבור RNA-seq ו- PCR, ייתכן שהן אינן מספיקות למבחנים אחרים. ככזה, משתמשים צריכים לקבוע אם ניתן לאסוף באופן ריאלי את הקלט המינימלי הנדרש לבדיקה באמצעות פרוטוקול זה.
המעבדה שלנו משתמשת באופן שגרתי ב-FACS כדי לטהר תאי מעיים לאחר בידוד 30, שיטות ניתוח פוסט-הוק לזיהוי תאי מעיים, ושיטת נתיחת ידזו 30,42. לנתיחה ידנית יש יתרון בכך שהיא ניתנת לשימוש בתולעים בוגרות כאשר פירוק תולעים ובידוד תאים פחות מוצלחים. יתר על כן, היעילות והאיכות של סך הרנ”א המופק מתכשירי דיסקציה ידניים הן גבוהות, ככל הנראה משום שהרקמות נקטפות במהירות מהתולעים ואז מופקדות במהירות בריאגנט לבידוד חומצות גרעין, מה שמפחית את פירוק הרנ”א. יתרון נוסף של שיטת דיסקציה ידנית הוא שהיא זולה, קלה ללמידה ואינה דורשת ציוד מיוחד. לבסוף, גישה זו מאפשרת קציר ובידוד של חיידקי המעיים ממעי התולעים, מה שמאפשר מחקרים במיקרוביום במורד הזרם.
פרוטוקול כריתת היד המתואר כאן לבידוד מעיים מ- C. elegans בוגרים מייצג כלי רב עוצמה לחקר היבטים שונים של הביולוגיה של C. elegans. לדוגמה, בעזרת הכנה טהורה של מעיים, חוקרים יכולים לחקור את ההצטלבות בין מערכת החיסון, ההזדקנות, חילוף החומרים והמיקרוביום.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו חבים חוב לעבודתם החלוצית של ג’יימס מקגי וברב גושצ’ינסקי, שפיתחו בתחילה את שיטת כריתת המעיים שממנה מותאם פרוטוקול זה. עבודתנו נתמכת על ידי פרס MIRA (R35) בפיקוח המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (המכונים הלאומיים לבריאות, R35GM124877 ל- EON) ופרס NSF-CAREER בפיקוח NSF MCB Div של ביומדע מולקולרי ותאי (פרס #2143849 ל- EON).
Materials
| Acetylated Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-420 | Nuclease free BSA |
| CL2122 worm strain | CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | CL2122 | dvIs15 [(pPD30.38) unc-54(vector) + (pCL26) mtl-2::GFP]. Control strain for CL2120. Phenotype apparently WT. |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher | C79 | needed for making Egg Salts |
| 50 mL Centrifuge Tubes, Bulk | Olympus Plastics | 28-108 | Nuclease free conical tube needed for solution making. |
| 15 mL Centrifuge Tubes, Bulk | Olympus Plastics | 28-103 | Nuclease free conical tube needed for solution making. |
| Concavity slide (2-well) | Electron Microscopy Sciences | 71878-08 | 12-pk of 2-well concavity slides |
| Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Millipore Sigma | E3889 | needed for making chelation buffer |
| Fluorescent Dissection Microscope | Leica | M205 FCA | This is an optional piece of equipment that can be used with fluorescent C. elegans strains to help guid users during hand dissections |
| N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Millipore Sigma | H4034 | needed for making dissection buffer |
| High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | for assesment of total RNA quality and quantity |
| High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5581 | for assesment of total RNA quality and quantity |
| High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5580 | for assesment of total RNA quality and quantity |
| HostZERO Microbial DNA Kit | Zymo Research | D4310 | Isolation of microbial DNA from worm intestines/worms |
| Hypodermic Needle (27G x 1/2") | BD Scientific | 305109 | needed for hand dissection of intestines |
| Levamisole (a.k.a. (-)-Tetramisole hydrochloride) | Millipore Sigma | L9756 | used to temporarily paralyze worms prior to hand dissection of intestines. |
| Luer-Lok General Use Disposable Syringe (1 mL) | BD Scientific | 309628 | Optional. Can be used to affix the hypodermic needle to, allowing easier manipulation of the needle during dissection. Remove the plunger. |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher | M33 | needed for making Egg Salts |
| Magnesium Sulfate Hpetahydrate | Sigma-Aldrich | 230391-500G | needed for making M9 buffer |
| MF-900 Microforge | Narishige | MF-900 | Used to forge the microcapillary pipettes. Available through Tritech Research. |
| 1.7 mL Microtubes, Clear | Olympus Plastics | 22-282 | Nuclease free microfuge tube needed for solution making and sample storage. |
| Mouth Aspirator Tube | Millipore Sigma | A5177 | Mouth aspirator tube is needed in combination with the microcapillary pipette to allow aspiration of dissected intestines. |
| 16S Pan-Bacterial Control TaqMan Assay | Thermo Fisher | A50137 | Assay ID: Ba04930791_s1. Assay used for gut microbial detection via qPCR. |
| P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | Model P-1000 | Used to pull the microcapillary pippettes prior to forging. |
| Petri Dish (35 x 10 mm) | Genesee Scientific – Olympus Plastics | 32-103 | Used to make M9 bath and Disseciton Buffer bath for washing worms prior to dissection. |
| Phenol:Chloroform:IAA | Ambion | AM9730 | Used in the isolation of total RNA |
| Potassium Chloride | Millipore Sigma | 529552 | needed for making Egg Salts |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | P0662-500G | needed for making M9 buffer |
| Qubit 3 Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | Accompanies the Qubit RNA HS Assay Kit. Can be used to quantify RNA prior to running sample on the Agilent ScreenTape. |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32852 | Can be used to quantify RNA prior to running sample on the Agilent ScreenTape. |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2111 | Broad spectrum inhibition of common eukaryotic Rnases |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | used for on-column DNA digestion during RNA isolation protocol. |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Used for isolation of total RNA from worm intestines/worms |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | 4 in OD 1.2 mm standard borosilicate glass capillaries used to make microcapillary pipettes for dissection |
| Sodium Chloride | Fisher | S271 | needed for making Egg Salts |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | needed for making M9 buffer |
| Syringe filter (0.2 micrometer SCFA) | Thermo Fisher | 72302520 | Optional for use with the mouth aspirator tube when mouth pipetting. |
| 4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Accompanies the RNA ScreenTape reagents for assessing RNA quality and quantity |
| TaqPath BactoPure Microbial Detection Master Mix | Applied Biosystems | A52699 | master mix used for qPCR |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Nucleic acid isolation and preservation. QIAzol (Qiagen; 79306) can be substituted if preferred. |
| Worm Pick | NA | NA | Made in house from a pasteur pipette and a platinum wire. See wormbook for details. |
References
- Riddel, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. . C. elegans II. , (1997).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).
- Dirksen, P., et al. CeMbio – The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
- Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
- Roy, P. J., Stuart, J. M., Lund, J., Kim, S. K. Chromosomal clustering of muscle-expressed genes in Caenorhabditis elegans. Nature. 418 (6901), 975-979 (2002).
- Pauli, F., Liu, Y., Kim, Y. A., Chen, P. -. J., Kim, S. K. Chromosomal clustering and GATA transcriptional regulation of intestine-expressed genes in C. elegans. Development. 133 (2), 287-295 (2005).
- Spencer, W. C., et al. A spatial and temporal map of C. elegans gene expression. Genome Research. 21 (2), 325-341 (2011).
- Spencer, W. C., et al. Isolation of specific neurons from C. elegans larvae for gene expression profiling. PLoS One. 9 (11), 112102 (2014).
- Ma, X., et al. Analysis of C. elegans muscle transcriptome using trans-splicing-based RNA tagging (SRT). Nucleic Acids Research. 44 (21), 156 (2016).
- Blazie, S. M., et al. Comparative RNA-Seq analysis reveals pervasive tissue-specific alternative polyadenylation in Caenorhabditis elegans intestine and muscles. BMC Biology. 13 (1), 4 (2015).
- Blazie, S. M., et al. Alternative polyadenylation directs tissue-specific miRNA targeting in Caenorhabditis elegans somatic tissues. Genetics. 206 (2), 757-774 (2017).
- Gómez-Saldivar, G., et al. et al.Tissue-specific transcription footprinting using RNA PoI DamID (RAPID) in Caenorhabditis elegans. Genetics. 216 (4), 931-945 (2020).
- Katsanos, D., Barkoulas, M. Targeted DamID in C. elegans reveals a direct role for LIN-22 and NHR-25 in antagonizing the epidermal stem cell fate. Science Advances. 8 (5), 3141 (2022).
- Kaletsky, R., et al. The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators. Nature. 529 (7584), 92-96 (2015).
- Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Genetics. 14 (8), 1007559 (2018).
- Mathies, L. D., et al. mRNA profiling reveals significant transcriptional differences between a multipotent progenitor and its differentiated sister. BMC Genomics. 20 (1), 427 (2019).
- Liang, X., Calovich-Benne, C., Norris, A. Sensory neuron transcriptomes reveal complex neuron-specific function and regulation of mec-2/ Stomatin splicing. Nucleic Acids Research. 50 (5), 2401-2416 (2021).
- Glenwinkel, L., et al. In silico analysis of the transcriptional regulatory logic of neuronal identity specification throughout the C. elegans nervous system. eLife. 10, 64906 (2021).
- Taylor, S. R., et al. Molecular topography of an entire nervous system. Cell. 184 (16), 4329-4347 (2021).
- Charest, J., et al. Combinatorial action of temporally segregated transcription factors. Developmental Cell. 55 (4), 483-499 (2020).
- Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling. Genome Research. 22 (4), 766-777 (2012).
- Tintori, S. C., Nishimura, E. O., Golden, P., Lieb, J. D., Goldstein, B. A transcriptional lineage of the early C. embryo. Developmental Cell. 38 (4), 430-444 (2016).
- Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. CEL-Seq: Single-cell RNA-Seq by multiplexed linear amplification. Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).
- Hashimshony, T., Feder, M., Levin, M., Hall, B. K., Yanai, I. Spatiotemporal transcriptomics reveals the evolutionary history of the endoderm germ layer. Nature. 519 (7542), 219-222 (2015).
- Packer, J. S., et al. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single-cell resolution. Science. 365 (6459), 1971 (2019).
- Warner, A. D., Gevirtzman, L., Hillier, L. W., Ewing, B., Waterston, R. H. The C. elegans embryonic transcriptome with tissue, time, and alternative splicing resolution. Genome Research. 29 (6), 1036-1045 (2019).
- Cao, J., et al. Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
- Durham, T. J., et al. Comprehensive characterization of tissue-specific chromatin accessibility in L2 Caenorhabditis elegans nematodes. Genome Research. 31 (10), 1952-1969 (2021).
- King, D. C., et al. The transcription factor ELT-2 positively and negatively impacts direct target genes to modulate the Caenorhabditis elegans intestinal transcriptome. bioRxiv. , (2021).
- Kocsisova, Z., Mohammad, A., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell cycle analysis in the C. elegans germline with the thymidine analog EdU. Journal of Visualized Experiments. (140), e58339 (2018).
- Han, S., et al. Mono-unsaturated fatty acids link H3K4me3 modifiers to C. elegans lifespan. Nature. 544 (7649), 185-190 (2017).
- Edgar, L. G., Wolf, N., Wood, W. B. Early transcription in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 120 (2), 443-451 (1994).
- Edgar, L. G., Goldstein, B. Culture and manipulation of embryonic cells. Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).
- Nishimura, E. O., Zhang, J. C., Werts, A. D., Goldstein, B., Lieb, J. D. Asymmetric transcript discovery by RNA-seq in C. elegans blastomeres identifies neg-1, a gene important for anterior morphogenesis. PLoS Genetics. 11 (4), 1005117 (2015).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Fay, D. S., Fluet, A., Johnson, C. J., Link, C. D. In vivo aggregation of β-amyloid peptide variants. Journal of Neurochemistry. 71 (4), 1616-1625 (1998).
- Altun, Z. F., Hall, D. H. WormAtas Hermaphrodite Handbook – Introduction to C. elegans Anatomy. WormAtlas. , (2006).
- Tan, M. -. W., Mahajan-Miklos, S., Ausubel, F. M. Killing of Caenorhabditis elegans by Pseudomonas aeruginosa used to model mammalian bacterial pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 715-720 (1999).
- Oesterle, A. Pipette Cookbook 2018: P-97 & P-1000 Micropipette Pullers. Sutter Instrument Company. , (2018).
- Dineen, A., Nishimura, E. O., Goszczynski, B., Rothman, J. H., McGhee, J. D. Quantitating transcription factor redundancy: The relative roles of the ELT-2 and ELT-7 GATA factors in the C. elegans endoderm. Developmental Biology. 435 (2), 150-161 (2018).
Cite This Article
Hill, J. L., Moore, A., Williams, R. T. P., Osborne Nishimura, E. Hand Dissection of Caenorhabditis elegans Intestines. J. Vis. Exp. (187), e64120, doi:10.3791/64120 (2022).