カエノラブディティスエレガンス腸の手剖

CL2122ワームを本研究に用いた。ワームは、NIH研究インフラストラクチャプログラム局(P40 OD010440)によって資金提供されたCaenorhabditis遺伝学センター(CGC、 資料表を参照)を通じて入手されました。 1.解剖のためのワームの成長 標準的な培養手順(すなわち、大腸菌OP50を播種したNGMプレート)に従って同期させるために、混合段階CL2122ワームの1つの大きなプレートを成長させます36,37。注:通常、最大の産卵能力に達するには~96時間かかります。胚は72-96時間以内にワームを準備します。胚の準備後、胚をM9( 表1を参照)で48時間孵化させます。これにより、L1段階のワームの同期集団が生成されます。注:CL2122線虫は、腸特異的MTL-2(MeTaLlothionein 2)プロモーター38から駆り立てられる統合された導入遺伝子GFP(緑色蛍光タンパク質)を持っています。このプロモーターは腸細胞質に特異的であり、蛍光解剖顕微鏡で腸を可視化することができます。トレーニングが完了すると、ユーザーは蛍光ガイダンスが必要ない場合があります。 プレートは、少なくとも2つの小さなプレートでL1ワームを同期させます。成虫期に達するまで(産卵可能な胚の存在によって識別される)十分な食物と共にNGMプレート上でワームを成長させる。これには、20°Cで38〜46時間かかります。同じ発生段階が反復および比較株間で確実に収穫されるように注意してください。注:ワームを成長させる時間の長さは、対象となる株、温度、食料源、および発生段階によって異なります39。L4および高齢者の段階など、成人段階に近い他の段階も使用できます。マイクロバイオーム実験を計画するために、従来の食料源(大腸菌 OP50)を超えたさまざまな細菌の食物源を使用して、CeMbio株4 や目的の病原体40などのワームを増殖させることができます。 2.原液およびマイクロキャピラリーピペットの調製 注: 表1 は、本研究に使用されたすべてのバッファーと溶液の詳細を示しています。 ヌクレアーゼフリーのコニカルチューブで50 mLの卵塩(別名、卵バッファー)を準備します( 材料の表を参照)。作ったら、室温で保存してください。 10 mLの100 mMレバミゾールストック溶液をヌクレアーゼフリーのコニカルチューブに調製します。調製したら、500 μLのアリコートを作り、-20°Cで保存します。 アリコートは解凍して、一度に1週間4°Cで保存できます。 ヌクレアーゼフリーの微量遠心チューブで1 mLの20 mg/mLストックアセチル化ウシ血清アルブミン(BSA)溶液を調製します。調製したら、50 μLのシングルユースアリコートを作り、-20°Cで保存します。注:アセチル化バージョンのBSAはヌクレアーゼを含まない唯一の形態であるため、BSAを使用することが重要です。非アセチル化BSAはヌクレアーゼの重要な供給源となり得、したがって、サンプルの分解をもたらす可能性がある。 以下の手順に従って、少なくとも5つの50 μmおよび100 μmマイクロキャピラリーピペットを準備します。まず、標準的なガラス毛細血管(長さ4本、外径1.2mm)をニードルプラー(材料表参照)とSutter Instruments Pipette Cookbook41の「接着細胞、C.エレガンス、ショウジョウバエ」の条件(条件:熱=ランプ+5;プル= 100;ベル= 75;遅延 = 90;圧力= 500;2.5ミリメートル×2.5ミリメートルボックス)。 次に、マイクロフォージを使用して、マイクロキャピラリーピペットを50 μm(M5/0.1対物レンズのマイクロフォージ接眼定規で示されている3つの目盛り)または100 μm(同じ条件下で5つの目盛り)のサイズに鍛造します( 材料の表を参照)。これらのサイズは、マイクロキャピラリーピペットの推定開口直径を表しています(図3)。 次に、口腔アスピレーターチューブをマイクロキャピラリーピペットに貼り付けます。注:アスピレーターピペットは伝統的に口ピペッティングによって制御されますが、多くの最新の安全プロトコルではこの方法が許可されていません。そのため、ユーザーは指と親指の間でチューブをつまむことで、口内吸引器チューブで吸引を制御できます。さらに、安全性を高めるために、シリンジフィルターを口内アスピレーターチューブシステム内に設置することができます。 3. 実験準備 ヌクレアーゼフリーのコニカルチューブに5 mLの解剖バッファーを調製します。室温で保管してください。 ヌクレアーゼフリーのマイクロ遠心チューブで1 mLの実用的なアセチル化BSA溶液を調製します。氷の上に保管してください。 350 μLの作業用レバミゾール溶液をヌクレアーゼフリーのマイクロ遠心チューブに入れます。三重に準備します(約20ワーム用の1本のチューブ)。氷の上に保管してください。 ヌクレアーゼフリーの微量遠心チューブでキレートバッファーを調製します(表1)。複製します(約10個の解剖されたワーム用の1本のチューブ)。氷の上に保管してください。手の解剖中にキレートバッファーを使用すると、RNAの質と量が向上します(図4)。 ヌクレアーゼフリーチューブに500 μLの核酸分離試薬またはキット指定の単離試薬( 材料の表を参照)を含む、実験グループごとに1本の微量遠心チューブを準備します。氷の上に保管してください。このチューブは、保管または後で使用するために最終的な分離された腸を収集するために使用されます。 M9浴1槽と解剖緩衝槽1槽を用意する。これを行うには、直径35 mmの滅菌ペトリ皿を2枚入手します。次に、一方の皿に2 mLのM9を加え、もう一方の皿に2 mLの解剖バッファーを追加します。最後に、100 μLの作業用BSA溶液を各浴に加えます。渦巻いて混ぜます。BSAをバスに追加すると、ワームがプラスチックに付着するのを防ぐことができます。 解剖配列を準備します。2ウェル凹型スライド( 材料表を参照)を入手し、150 μLの作業用レバミゾール溶液を最初のウェルに追加します。次に、150 μLの解剖バッファーを2番目のウェルに追加します。最後に、20 μLの作業用BSA溶液を各ウェルに加えます。各ウェルにBSAを追加すると、ワームがスライドに付着するのを防ぐことができます。 4.C.エレガンス腸の手剖 ワームピックを使用して、20匹の成虫をNGMプレートからM9バスに移動します(ステップ3.6)。これはワームから外部のバクテリアを洗い流します。 次に、20匹すべてのワームをM9バスから解剖バッファーバスに移動します(ステップ3.6)。これにより、外部の細菌がさらに洗い流され、解剖バッファー内のワームが平衡化されます。 次に、ワームのバッチ(すなわち、10個セット)を解剖バッファーバスからレバミゾール溶液を含むウェルに移動する(ステップ3.7)。注:レバミゾールは一時的にワームを麻痺させます。ワームの動きが遅くなったら、レバミゾールウェルから解剖バッファーを含むウェルにすばやく移動します(ステップ3.7)。ワームを過度に麻痺させないように注意してください。注:レバミゾールソリューションにバッチで移動されるワームの数は、ユーザーの快適さによって異なります。これは、最初にM9バスにピッキングされ、次に解剖バッファーバスに移動したワームの数にも当てはまります。ユーザーがプロトコルを学習して慣れるにつれて、特にトレーニング中に、解剖に使用できる追加のワームを用意することをお勧めします。 次に、解剖を開始する前に、ワームが解剖バッファー内で少し動き始めるのを待ちます。注:腸は、過度に麻痺したワーム(つまり、まったく動いていないワーム)からうまく押し出されません。 準備ができたら、皮下注射針(つまり、27 G x 1/2インチ)を使用して蛍光解剖スコープの下でワームを解剖します(材料 表を参照)咽頭のすぐ後ろ(図5Aa)または直腸のすぐ前(図5Ab)。これにより、腸の2つの大きなセクション、前中半分と中後半分Iが生成されます。残りのワームについてもこのパターンを継続し、腸の所望の総数が取得されるまで、前中部および中後部から得られた腸切片の数を同等に保ちます。注意: 皮下注射針を空の1mLシリンジバレルに取り付けると、手の解剖中の操作に役立ちます。ユーザーの快適さと経験に応じて、腸の断片を生じない解剖カットを行うことは珍しくありません。しかし、練習すれば、これははるかに一般的ではなくなります。 腸が体から最大限に押し出されるまで約1分待ちます。それらは通常ループ形状を取り、生殖腺の一部に付着している可能性があります(図5A)。待機中に、50 μLのキレートバッファーをウェルに加えると、RNAの分解が減少します(図4)。 待っている間、腸の押し出しをさらに促進するために、マウスアスピレーターに取り付けられた100μmのマイクロキャピラリーピペットを使用して、腸/ワームをピペットに出し入れします(図5B)。これは生殖腺から腸を解放するのにも役立ちます。誤って腸をマイクロキャピラリーピペットに完全に吸い上げて失わないように注意してください。注:ユーザーは、100μmと50μmのマイクロキャピラリーピペットを交互に使用して、腸を体の他の部分や生殖腺から解放することができます。50 μmマイクロキャピラリーピペットの直径が小さい開口部は、腸から粘着性のある部分を除去するための利点をもたらす可能性があります。アスピレーターピペットは伝統的に口ピペッティングによって制御されていますが、多くの最新の安全プロトコルではこの方法が許可されていません。そのため、ユーザーは指と親指の間でチューブをつまむことで、口内吸引器チューブで吸引を制御できます。さらに、安全性を高めるために、シリンジフィルターを口内アスピレーターチューブシステム内に設置することができます。 腸が十分に押し出されたら、27 Gの皮下注射針を使用して、体の他の部分と残っている生殖腺から腸を切り取ります。単離された腸切片の大きさは、収穫機の経験、切断の質、およびワームの麻痺のレベルによって大きく異なります。注:腸および腸の断片の完全性は、GFP蛍光 を介して プロトコル全体で簡単に監視できます。 次に、マイクロキャピラリーピペットを使用して腸切片を吸引し、ウェルから核酸分離試薬またはキット指定の分離試薬を含むマイクロ遠心チューブに移動します。単離した腸を氷上の試薬に保ち、残りの腸についても繰り返します。注:核酸分離試薬または別のキット指定の単離試薬を含むマイクロ遠心チューブに複数の腸を一日中追加できます。氷の上に保管してください。1日ですべての腸を分離できない場合、すでに分離され、核酸分離試薬(核酸を保存する)に保存されている腸は、分離が再開されるか完了するまで-80°Cに保つことができます。ここで、試料は、長期間(すなわち、数ヶ月〜1年)安定であり、核酸を単離する準備ができるまで残存することができる。腸は、水またはキット固有の溶解バッファーに回収できます。ただし、下流のアプリケーションに移る前に、腸が氷上の特定のバッファー(または他の望ましい温度)にどれだけ長く留まることができるかを決定する際には、考慮する必要があります。 5.解剖腸からのRNA単離 核酸分離試薬に保存されている取得した組織を、凍結/解凍/渦サイクルを3回実行して均質化します。これを行うには、37°Cのビーズバスと液体窒素(または他の同等の手段)を使用します。 次に、0.2容量のフェノール:クロロホルム:IAA試薬( 材料表を参照)をサンプルとボルテックスに短時間加えます。例えば、開始サンプル量が500 μLの場合、0.2容量のクロロホルムは100 μLになります。 チューブを手で20秒間振とうした後、室温で3分間インキュベートします。 遠心分離(10,000 x g、18分、4°C)でサンプル相を分離します。 水相を除去し、新しいヌクレアーゼフリーのマイクロ遠心チューブに移します。注意: インターフェイスを吸引したり乱したりしないように注意してください。 次に、等量の100%エタノールを水相に加え、サンプルを手で20秒間振とうします。 700 μLのサンプルをスピンカラムに移します( 材料表を参照)。その後、遠心分離(≥8,000 x g、30秒、室温)でRNAをカラムに接着させます。フロースルーを破棄します。残りのサンプルについても繰り返します。 350 μLのRW1バッファー( 材料表を参照)をカラムに加え、サンプルを洗浄します。その後、遠心分離(≥8,000 x g、30秒、RT)し、フロースルーを廃棄します。 オンカラムDNA消化を実行します。80 μLのDNase IをRDDバッファー( 材料表を参照)でサンプルカラムに加えます。その後、RTで15分間インキュベートします。 次に、350 μLのRW1バッファーをカラムに加え、サンプルを洗浄します。遠心分離(≥8,000 x g、30秒、RT)し、カラムを新しい収集チューブに移します。フロースルーチューブと古い収集チューブを廃棄します。この洗浄により、DNaseが除去されます。 500 μLのRPE( 材料表を参照)をサンプルカラムに加えます。その後、遠心分離(≥8,000 x g、30秒、RT)し、フロースルーを廃棄します。2回目の洗浄を繰り返します。 その後、さらに1分間遠心分離し、カラムメンブレンをさらに乾燥させます(≥8,000 x g、1分、RT)。次に、サンプルカラムを蓋付きの新しいヌクレアーゼフリーのマイクロ遠心回収チューブに移します。フロースルーチューブと古い収集チューブを廃棄します。 14 μLのヌクレアーゼフリー水をサンプルカラムのメンブレンに直接加えます。次に、サンプルをRTで2分間インキュベートします。次に、遠心分離機(≥8,000 x g、1分、RT)を行い、RNAを溶出させた。 サンプルを氷上に保存します。次に、市販のアッセイキットを使用してサンプルのRNAの質と量を評価します( 材料表を参照)。完了したら、サンプルを-80°Cの冷凍庫に保管します。注:RNAは一般に-80°Cで最大1年間安定であり、分解されません。