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Biology

Dissezione manuale di Caenorhabditis elegans Intestini

Published: September 13, 2022
doi:
10.3791/64120
, , ,
1Department of Biochemistry & Molecular Biology,Colorado State University

Summary

Il presente protocollo descrive una procedura per isolare manualmente l’intestino dai vermi nematodi adulti Caenorhabditis elegans per l’input in genomica, proteomica, microbioma o altri test.

Abstract

Composto da sole 20 cellule, l’intestino di Caenorhabditis elegans è il nesso di molte funzioni di supporto vitale, tra cui la digestione, il metabolismo, l’invecchiamento, l’immunità e la risposta ambientale. Le interazioni critiche tra l’ospite di C. elegans e il suo ambiente convergono all’interno dell’intestino, dove si concentra il microbiota intestinale. Pertanto, la capacità di isolare il tessuto intestinale lontano dal resto del verme è necessaria per valutare i processi specifici dell’intestino. Questo protocollo descrive un metodo per sezionare a mano gli intestini adulti di C. elegans. La procedura può essere eseguita in ceppi marcati con fluorescenza per facilità o scopi di allenamento. Una volta perfezionata la tecnica, gli intestini possono essere raccolti da vermi non etichettati di qualsiasi genotipo. Questo approccio di microdissezione consente la cattura simultanea del tessuto intestinale dell’ospite e del microbiota intestinale, un vantaggio per molti studi sul microbioma. Pertanto, le applicazioni a valle per i preparati intestinali generati da questo protocollo possono includere, ma non sono limitate all’isolamento dell’RNA dalle cellule intestinali e all’isolamento del DNA dal microbiota catturato. Nel complesso, la dissezione manuale degli intestini di C. elegans offre un metodo semplice e robusto per studiare aspetti critici della biologia intestinale.

Introduction

Il verme nematode Caenorhabditis elegans, con solo 959 cellule e un ciclo di vita da uovo a uovo di 4 giorni, è un sistema modello ideale per molti studi di genetica, genomica e sviluppo 1,2. La facilità dello screening genetico in avanti e indietro, la prevalenza di marcatori fluorescenti ingegnerizzati, la capacità di eseguire l’editing del genoma nucleotidico specifico e le numerose risorse a livello di comunità hanno contribuito a importanti scoperte e intuizioni nel sistema di C. elegans. Tuttavia, uno svantaggio significativo è la difficoltà di ottenere popolazioni pure di cellule, tessuti o organi, che sono piccoli, fragili e possono essere interconnessi. Poiché le popolazioni pure di cellule sono importanti per i saggi genomici come RNA-seq, ChIP-seq e ATAC-seq, sono emersi diversi approcci per ottenere preparazioni pure di cellule, tessuti e organi di C. elegans. Qui viene descritto un metodo per sezionare gli intestini a mano, in ampie sezioni, dai vermi adulti di C. elegans. I preparati risultanti sono adatti per saggi genomici a valle (Figura 1).

Il metodo di dissezione tissutale su scala fine qui descritto (Figura 2) è solo un approccio. Altre tecniche alternative, come la marcatura molecolare, la disaggregazione dei vermi e la purificazione dei tipi cellulari di interesse con la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) e l’analisi post hoc, sono state utilizzate con successo per esaminare le caratteristiche specifiche del tessuto della biologia molecolare di C. elegans. Un vantaggio della dissezione della mano rispetto a questi altri approcci, tuttavia, è che può essere utilizzato per esplorare simultaneamente le caratteristiche dell’intestino di C. elegans e il suo contenuto batterico 3,4,5. Ciò consente il sequenziamento del gene rRNA 16S e facilita gli studi sul microbioma all’interno del sistema C. elegans. Una limitazione importante, tuttavia, è che le cellule intestinali non sono isolate individualmente.

Il tagging molecolare conferisce un tag specifico del tipo di cellula alle molecole solo all’interno del tessuto o delle cellule di interesse specificate. Questi tag possono quindi essere isolati dai preparati totali del worm. In questo modo, i promotori tessuto-specifici che guidano una proteina legante la poliA marcata o un leader spliced hanno permesso il profilo del trascrittoma tessuto-specifico 6,7,8,9,10 e 3’UTR mapping 11,12. Allo stesso modo, i profili dei fattori di trascrizione tessuto-specifici sono stati condotti utilizzando ChIP-seq e DamID, in cui le varianti del fattore di trascrizione specifico del promotore sono state aggiunte con tag o fusioni enzimatiche13,14.

FACS consente di isolare i tipi di cellule di interesse dai vermi dissociati in base alle loro caratteristiche cellulari intrinseche e alle proprietà fluorescenti. Questo approccio ha generato trascrittomi tessuto-specifici da diversi organi 8,15,16 e singoli tipi di cellule neuronali 8,9,15,16,17,18 ed è stato utilizzato per creare una mappa di espressione dell’intero sistema nervoso di C. elegans 19,20 . FACS, e il suo cugino FANS (fluorescence-activated nuclei sorting), sono stati utilizzati anche per generare profili cromatinici cellula-specifici21,22.

Infine, l’analisi post-hoc può essere eseguita in saggi di risoluzione a singola cellula. In questo metodo, vengono esaminate tutte le singole cellule, il tipo di cella di ciascuna viene attribuito nella fase di analisi e i tipi di cellule di interesse vengono filtrati selettivamente per ulteriori studi. L’analisi post-hoc è stata utilizzata con successo per ottenere trascrittomi di cellule in via di sviluppo con alta risoluzione spaziale e temporale negli embrioni di C. elegans 23,24,25,26,27 e L1 28 vermi allo stadio. L’accessibilità della cromatina è stata anche caratterizzata utilizzando ATAC-seq invece di RNA-seq utilizzando una strategia simile29.

Ogni approccio ha i suoi vantaggi e limiti. Per l’intestino di C. elegans, la disaggregazione del verme e l’isolamento FACS delle cellule intestinali è realizzabile negli stadi embrionale e larvale30, ma è difficile negli adulti. Si pensa che ciò sia dovuto alle cellule grandi, endo-reduplicate e fortemente aderenti dell’intestino che le rendono difficili da dissociare intatte. Il metodo di dissezione della mano qui descritto aggira queste sfide, consentendo l’isolamento di ampie sezioni dell’intestino del verme adulto. La pratica di sezionare a mano le gonadi da questo stesso stadio è diffusa e semplice. La dissezione intestinale è simile alla dissezione delle gonadi, ma meno comunemente eseguita32. Il protocollo qui presentato è adattato da un protocollo più lungo e inedito sviluppato dal Dr. James McGhee e Barb Goszczynski. Questo protocollo semplificato prende in prestito tecniche per isolare i blastomeri dagli embrioni in fase iniziale 23,33,34,35. Sebbene la dissezione della mano non sia fattibile per isolare la maggior parte dei tipi di cellule o tessuti in C. elegans, è ideale per isolare l’intestino dai vermi adulti. Pertanto, la dissezione della mano integra altri mezzi per ottenere preparati cellulari specifici per l’intestino.

Protocol

Per il presente studio sono stati utilizzati vermi CL2122. I vermi sono stati ottenuti attraverso il Caenorhabditis Genetics Center (CGC, vedi Table of Materials), finanziato dall’Ufficio NIH dei programmi di infrastruttura di ricerca (P40 OD010440). 1. Crescita di vermi per la dissezione Far crescere una grande piastra di vermi CL2122 in stadio misto per la sincronizzazione seguendo le procedure di coltura standard (cioè piastre NGM seminate con E. coli OP50)36,37.NOTA: Generalmente ci vogliono ~ 96 ore per raggiungere la massima capacità di deposizione delle uova.L’embrione prepara i vermi entro il periodo di 72-96 ore. Dopo la preparazione dell’embrione, lasciare che gli embrioni si schiudano in M9 (vedi Tabella 1) per 48 ore. Ciò produrrà una popolazione sincrona di worm dello stadio L1.NOTA: I vermi CL2122 ospitano un transgene-GFP integrato (proteina fluorescente verde) espulso dal promotore38 mtl-2 (MeTaLlotionein 2) specifico dell’intestino. Questo promotore è specifico per il citoplasma delle cellule intestinali e consente di visualizzare l’intestino su un microscopio a dissezione fluorescente. Una volta addestrati, gli utenti potrebbero non trovare necessaria una guida alla fluorescenza. Piastra sincronizzata L1 worm su un minimo di due piastre piccole. Coltivare vermi su piastre NGM con cibo sufficiente fino a raggiungere lo stadio adulto (identificato dalla presenza di embrioni in grado di deporre le uova). Questo richiede tra 38-46 h a 20 °C.Fare attenzione a garantire che lo stesso stadio di sviluppo venga raccolto attraverso repliche e ceppi comparativi.NOTA: Il periodo di tempo per far crescere i vermi dipende dal ceppo, dalla temperatura, dalla fonte di cibo e dallo stadio di sviluppo target39. Possono essere utilizzati anche altri stadi vicino allo stadio adulto, come gli stadi L4 e gli stadi adulti più anziani. Per la pianificazione di esperimenti sul microbioma, diverse fonti alimentari batteriche oltre alla fonte alimentare tradizionale (E. coli OP50) possono essere utilizzate per far crescere vermi, come i ceppi CeMbio4 o un patogeno di interesse40. 2. Preparazione di soluzioni madre e pipette microcapillari NOTA: La tabella 1 fornisce i dettagli di tutti i buffer e le soluzioni utilizzate per il presente studio. Preparare 50 mL di sali d’uovo (noto anche come tampone per uova) in un tubo conico privo di nucleasi (vedere Tabella dei materiali). Una volta preparato, conservare a temperatura ambiente. Preparare 10 mL di soluzione madre di levamisolo 100 mM in un tubo conico privo di nucleasi. Una volta preparate, preparare 500 μL di aliquote e conservarle a -20 °C. Le aliquote possono essere scongelate e conservate a 4 °C per 1 settimana alla volta. Preparare 1 mL di soluzione madre di albumina sierica (BSA) acetilata da 20 mg/mL in una provetta da microcentrifuga priva di nucleasi. Una volta preparate, preparare aliquote monouso da 50 μL e conservarle a -20 °C.NOTA: è importante utilizzare la versione acetilata di BSA perché questa è l’unica forma di BSA priva di nucleasi. La BSA non acetilata può essere una fonte significativa di nucleasi e, quindi, portare alla degradazione dei campioni. Preparare almeno cinque pipette microcapillari da 50 μm e 100 μm, ciascuna seguendo i passaggi seguenti.In primo luogo, tirare capillari di vetro standard (4 di lunghezza e 1,2 mm di diametro esterno) in una forma di ago per iniezione utilizzando un estrattore di aghi (vedere la tabella dei materiali) e le condizioni per “Adherent Cell, C. elegans, & Drosophila” dal Sutter Instruments Pipette Cookbook41 (Condizioni: Calore = Rampa + 5; Tirare = 100; Vel. = 75; Ritardo = 90; Pressione = 500; Scatola 2,5 mm x 2,5 mm). Quindi, forgiare le pipette microcapillari a 50 μm (tre segni di graduazione come indicato dal righello oculare della microforgia sotto l’obiettivo M5/0.1) o 100 μm (cinque segni di zecca nelle stesse condizioni) utilizzando una microforgia (vedere Tabella dei materiali). Queste dimensioni rappresentano il diametro di apertura stimato della pipetta microcapillare (Figura 3). Quindi, applicare un tubo aspiratore della bocca alle pipette microcapillari.NOTA: le pipette dell’aspiratore sono tradizionalmente controllate dal pipettaggio a bocca, ma molti protocolli di sicurezza moderni non consentono questo metodo. Pertanto, gli utenti possono controllare l’aspirazione con il tubo dell’aspiratore della bocca pizzicando il tubo tra il dito e il pollice. Inoltre, un filtro a siringa può essere installato all’interno del sistema di tubi dell’aspiratore della bocca per una maggiore sicurezza. 3. Preparazione sperimentale Preparare 5 mL di tampone di dissezione in un tubo conico privo di nucleasi. Conservare a temperatura ambiente. Preparare 1 mL di soluzione di BSA acetilata di lavoro in una provetta di microcentrifuga priva di nucleasi. Mantenere il ghiaccio. Produrre 350 μL di soluzione di lecamisole di lavoro in una provetta da microcentrifuga priva di nucleasi. Preparare in triplice copia (una provetta per circa 20 vermi). Mantenere il ghiaccio. Preparare il tampone chelante in una provetta da microcentrifuga priva di nucleasi (Tabella 1). Make in replicate (un tubo per circa 10 vermi sezionati). Mantenere il ghiaccio. L’uso del tampone chelante durante le dissezioni della mano migliora la qualità e la quantità dell’RNA (Figura 4). Preparare una provetta per microcentrifuga per gruppo sperimentale contenente 500 μL di reagente isolante dell’acido nucleico o reagente di isolamento specificato dal kit (vedere la tabella dei materiali) in una provetta priva di nucleasi. Mantenere il ghiaccio. Questo tubo verrà utilizzato per raccogliere gli intestini finali isolati per la conservazione o l’uso successivo. Preparare un bagno M9 e un bagno tampone di dissezione. Per fare ciò, ottenere due piastre di Petri sterili da 35 mm di diametro. Quindi, aggiungere 2 ml di M9 a un piatto e 2 ml di tampone di dissezione all’altro. Infine, aggiungere 100 μL di soluzione BSA funzionante ad ogni bagno. Agitare per mescolare. L’aggiunta di BSA ai bagni impedirà ai vermi di attaccarsi alla plastica. Preparare la matrice di dissezione. Ottenere un vetrino a concavità a 2 pozzetti (vedere Tabella dei materiali) e aggiungere 150 μL di soluzione di levamisolo di lavoro al primo pozzetto. Quindi, aggiungere 150 μL di tampone di dissezione al secondo pozzetto. Infine, aggiungere 20 μL di soluzione BSA funzionante a ciascun pozzetto. L’aggiunta di BSA a ciascun pozzetto impedirà ai vermi di attaccarsi alla diapositiva. 4. Dissezione della mano dell’intestino di C. elegans Utilizzando un plettro per vermi, spostare 20 vermi adulti dalla piastra NGM al bagno M9 (passaggio 3.6). Questo laverà i batteri esterni dai vermi. Quindi, spostare tutti i 20 worm dal bagno M9 al bagno tampone di dissezione (passaggio 3.6). Ciò laverà ulteriormente via i batteri esterni ed equilibrerà i vermi nel tampone di dissezione. Quindi, spostare i lotti di vermi (cioè in serie di 10) dal bagno tampone di dissezione nella soluzione di levamisolo contenente pozzetto (punto 3.7).NOTA: Il levamisolo paralizza temporaneamente i vermi.Una volta che i movimenti del verme rallentano, spostarli rapidamente dal pozzetto del levamisolo al pozzetto contenente il tampone di dissezione (punto 3.7). Fai attenzione a non paralizzare eccessivamente i vermi.NOTA: Il numero di vermi spostati in lotti nella soluzione di levamisolo può variare in base al comfort dell’utente. Questo vale anche per il numero di vermi raccolti inizialmente nel bagno M9 e poi spostati nel bagno tampone di dissezione. È buona norma avere ulteriori worm disponibili per la dissezione, specialmente durante l’allenamento, poiché l’utente impara e prende confidenza con il protocollo. Quindi, lasciare che i worm inizino a muoversi leggermente nel buffer di dissezione prima di iniziare le dissezioni.NOTA: Gli intestini non estrudono bene da vermi eccessivamente paralizzati (cioè vermi che non si muovono affatto). Quando è pronto, sezionare i vermi sotto un cannocchiale fluorescente usando un ago ipodermico (cioè 27 G x 1/2 in) (vedi Tabella dei materiali) effettuando un taglio appena dietro la faringe (Figura 5Aa) o appena davanti al retto (Figura 5Ab). Questo produrrà due grandi sezioni dell’intestino, una metà anteriore-media e una metà medio-posterioreI. Continuare questo schema per il resto dei vermi, mantenendo equivalente il numero di sezioni intestinali ottenute dalle sezioni anteriore-media e medio-posteriore fino a quando non viene acquisito il numero totale desiderato di intestini.NOTA: L’apposizione dell’ago ipodermico su un cilindro di siringa vuoto da 1 ml può aiutare nella sua manipolazione durante le dissezioni della mano. A seconda del comfort e dell’esperienza dell’utente, non è raro effettuare un taglio di dissezione che non produce alcun frammento intestinale. Tuttavia, con la pratica, questo diventa molto meno comune. Attendere circa 1 minuto affinché l’intestino estruda al massimo dal corpo. In genere assumono una forma ad anello e possono essere attaccati a una porzione delle gonadi (Figura 5A). Durante l’attesa, aggiungere 50 μL di tampone chelante al pozzetto per contribuire a ridurre la degradazione dell’RNA (Figura 4). Durante l’attesa e per facilitare ulteriormente l’estrusione intestinale, utilizzare la pipetta microcapillare da 100 μm collegata a un aspiratore orale e aspirare l’intestino/verme dentro e fuori dalla pipetta (Figura 5B). Questo aiuterà anche a liberare l’intestino dalla gonade. Fare attenzione a non perdere l’intestino aspirandolo accidentalmente completamente nella pipetta microcapillare.NOTA: L’utente può alternare le pipette microcapillari da 100 μm e 50 μm per liberare l’intestino dal resto del corpo e dalla gonade. L’apertura di diametro più piccolo della pipetta microcapillare da 50 μm può offrire un vantaggio per rimuovere i pezzi appiccicosi dall’intestino. Le pipette dell’aspiratore sono tradizionalmente controllate dal pipettaggio a bocca, ma molti protocolli di sicurezza moderni non consentono questo metodo. Pertanto, gli utenti possono controllare l’aspirazione con il tubo dell’aspiratore della bocca pizzicando il tubo tra il dito e il pollice. Inoltre, un filtro a siringa può essere installato all’interno del sistema di tubi dell’aspiratore della bocca per una maggiore sicurezza. Una volta che l’intestino è sufficientemente estruso, utilizzare l’ago ipodermico da 27 G per tagliarlo dal resto del corpo e da qualsiasi gonade rimanente. La dimensione della sezione intestinale isolata può variare notevolmente a seconda dell’esperienza della mietitrice, della qualità del taglio e del livello di paralisi nel verme.NOTA: L’integrità dell’intestino e dei frammenti intestinali può essere facilmente monitorata durante tutto il protocollo tramite la loro fluorescenza GFP. Ora, utilizzare la pipetta microcapillare per aspirare la sezione intestinale e spostarla fuori dal pozzo e nel tubo di microcentrifuga contenente il reagente di isolamento dell’acido nucleico o il reagente di isolamento specificato dal kit. Mantenere l’intestino isolato nel reagente sul ghiaccio e ripetere per l’intestino rimanente.NOTA: è possibile aggiungere più intestini alla provetta della microcentrifuga contenente un reagente di isolamento dell’acido nucleico o un altro reagente di isolamento specificato dal kit durante il giorno. Mantenere il ghiaccio. Se tutti gli intestini non possono essere isolati in 1 giorno, quelli che sono già isolati e immagazzinati in un reagente di isolamento degli acidi nucleici (che conserva gli acidi nucleici) possono essere mantenuti a -80 ° C fino a quando gli isolamenti non riprendono e / o possono essere completati. Qui, i campioni sono stabili a lungo termine (cioè da diversi mesi a 1 anno) e possono rimanere fino al momento di isolare gli acidi nucleici. L’intestino può essere raccolto in acqua o in qualsiasi tampone di lisi specifico per kit. Tuttavia, è necessario prendere in considerazione quando si determina per quanto tempo l’intestino può rimanere in un dato tampone sul ghiaccio (o altra temperatura desiderata) prima di passare alle applicazioni a valle. 5. Isolamento dell’RNA dall’intestino sezionato Omogeneizzare i tessuti acquisiti immagazzinati nel reagente di isolamento dell’acido nucleico eseguendo tre cicli di congelamento / disgelo / vortice. Per fare ciò, utilizzare un bagno di perline a 37 °C e azoto liquido (o altri mezzi comparabili). Quindi, aggiungere brevemente 0,2 volumi di reagente fenolo:cloroformio:IAA (vedere Tabella dei materiali) al campione e al vortice. Ad esempio, per un volume di campione iniziale di 500 μL, 0,2 volumi di cloroformio sarebbero 100 μL. Agitare il tubo a mano per 20 s, quindi incubare a temperatura ambiente per 3 minuti. Separare le fasi del campione mediante centrifugazione (10.000 x g, 18 min, 4 °C). Rimuovere la fase acquosa e trasferirla in una nuova provetta per microcentrifuga priva di nucleasi.NOTA: Fare attenzione a non aspirare o disturbare l’interfaccia. Quindi, aggiungere un volume uguale di etanolo al 100% alla fase acquosa e agitare il campione a mano per 20 s. Trasferire 700 μL del campione nella colonna di spin (vedere Tabella dei materiali). Quindi, far aderire l’RNA alla colonna con centrifugazione (≥8.000 x g, 30 s, RT [temperatura ambiente]). Eliminare il flusso in corso. Ripetere l’operazione per ogni altro campione rimanente. Aggiungere 350 μL di tampone RW1 (vedere Tabella dei materiali) alla colonna per lavare il campione. Quindi, centrifugare (≥8.000 x g, 30 s, RT) e scartare il flusso continuo. Eseguire la digestione del DNA su colonna. Aggiungere 80 μL di DNasi I nel buffer RDD (vedere Tabella dei materiali) alla colonna del campione. Quindi, incubare per 15 minuti a RT. Quindi, aggiungere 350 μL di tampone RW1 alla colonna per lavare il campione. Centrifugare (≥8.000 x g, 30 s, RT) e trasferire la colonna in un nuovo tubo di raccolta. Scartare il tubo di raccolta a flusso continuo e il vecchio tubo di raccolta. Questo lavaggio rimuove la DNasi. Aggiungere 500 μL di RPE (vedere Tabella dei materiali) alla colonna del campione. Quindi, centrifugare (≥8.000 x g, 30 s, RT) e scartare il flusso continuo. Ripetere per un secondo lavaggio. Quindi, centrifugare per un ulteriore 1 minuto per asciugare ulteriormente la membrana della colonna (≥8.000 x g, 1 min, RT). Quindi, trasferire la colonna del campione in una provetta di raccolta della microcentrifuga priva di nucleasi fresca con un coperchio. Scartare il tubo di raccolta a flusso continuo e il vecchio tubo di raccolta. Aggiungere 14 μL di acqua priva di nucleasi direttamente alla membrana della colonna del campione. Quindi, incubare il campione per 2 minuti a RT. Quindi, centrifugare (≥8.000 x g, 1 min, RT) per eluire l’RNA. Conservare il campione su ghiaccio. Successivamente, valutare la qualità e la quantità dell’RNA del campione utilizzando kit di analisi disponibili in commercio (vedere la tabella dei materiali). Una volta fatto, conservare il campione in un congelatore a -80 °C.NOTA: L’RNA è generalmente stabile a -80 °C fino a 1 anno senza degradazione.

Representative Results

Il presente protocollo è stato utilizzato per isolare ampie sezioni dell’intestino da C . elegans adulti a mano (Figura 2). Il campione finale dell’intestino per ciascun gruppo sperimentale mostrato è composto da una raccolta uguale di sezioni dell’intestino anteriore-medio e medio-posteriore. Tuttavia, a seconda della domanda sperimentale, potrebbe anche comprendere una raccolta di sole sezioni dell’intestino anteriore, medio o posteriore. Collettivamente, vengono presentati tre risultati rappresentativi per questo protocollo. Il primo descrive il successo della dissezione e dell’isolamento dell’intestino (Figura 6). Il secondo riporta i risultati dell’isolamento dell’RNA da intestini isolati (Figura 7). Il terzo mostra i risultati della sorveglianza microbica da intestini isolati (Figura 8). Per il primo risultato, la Figura 6A mostra l’aspetto di un intestino estruso dopo aver effettuato un’incisione primaria nel sito “a” nella Figura 5A all’interno di vermi adulti CL2122. Poiché i vermi CL2122 ospitano il promotore mtl-2 specifico dell’intestino fuso con GFP (mtl-2 p::GFP), gli intestini isolati si illumineranno di verde sotto il cannocchiale fluorescente. La dissezione riuscita di un segmento intestinale è quindi mostrata nella Figura 6B. Questa sezione intestinale è priva di contaminanti visibili come detriti dalla gonade o dalla carcassa. Al contrario, la Figura 6C mostra gli intestini che non vengono sezionati con successo, poiché la gonade e la carcassa sono ancora visibilmente attaccate al segmento intestinale. Per il secondo risultato, gli intestini sono stati raccolti in un reagente di isolamento degli acidi nucleici e trattati il giorno successivo utilizzando un protocollo di estrazione di RNA totale a basso input (vedi Tabella dei materiali). Un campione finale di 60 sezioni intestinali totali dalle sezioni anteriore-media e medio-posteriore produce circa 15 ng di RNA totale di alta qualità (Figura 7A). Questa quantità di intestino totale può essere facilmente ottenuta in un solo giorno, ma può anche essere suddivisa in diversi giorni, se necessario. I rendimenti dell’RNA dalla dissezione della mano sono più efficienti della disaggregazione dei vermi e dell’isolamento FACS delle cellule intestinali in quanto sono necessarie centinaia di migliaia di cellule intestinali per ottenere quantità commisurate di RNA totale (Figura 7B). È importante sottolineare che le rese di RNA generate dalla dissezione manuale sono più che sufficienti come input per i kit di librerie commerciali di RNA-seq (ad esempio, NEBNext Ultra II e NEBNext Single Cell / Low Input), che possono richiedere un minimo di 2 pg di RNA. Per il terzo risultato, gli intestini sono stati raccolti inddH 20 sterile e trattati lo stesso giorno utilizzando un kit di isolamento del DNA microbico commerciale (vedi Tabella dei materiali). Un campione finale dell’intestino di 40 sezioni intestinali totali dalle sezioni anteriore-media e medio-posteriore produce circa 0,009 pg di DNA microbico totale utilizzando un saggio di rilevamento pan-batterico (vedi Tabella dei materiali) (Figura 8). Queste quantità sono troppo basse per i metodi di quantificazione tradizionali e devono essere estrapolate dalle curve standard qPCR. Idealmente, gli utenti dovrebbero mirare a una quantità totale finale di intestino >40 in quanto ciò aumenta il limite di rilevamento e il limite del segnale-rumore per quanto riguarda i livelli di contaminazione da reagenti. Quando si considera la progettazione sperimentale, è sempre necessaria la raccolta di campioni di controllo appropriati. Per gli esperimenti di trascrittomica, un controllo sperimentale adatto può includere preparazioni dell’intero verme raccolto allo stesso modo dell’intestino. Durante la dissezione e l’isolamento degli intestini da C. elegans, tuttavia, è comune vedere pezzi di carcassa e gonade aggrappati alle sezioni dell’intestino. Mentre idealmente questi tessuti contaminanti saranno rimossi dall’intestino prima dello stoccaggio per l’uso a valle, ulteriori controlli sperimentali possono includere la raccolta delle carcasse di vermi rimanenti dopo la dissezione intestinale e / o la raccolta di gonadi sezionate. Per gli esperimenti sul microbioma, i controlli possono anche includere preparazioni dell’intero verme raccolto allo stesso modo dell’intestino, oltre ai controlli convenzionali positivi (coltura batterica) e negativi (acqua). Figura 1: Dissezione manuale dell’intestino da C. elegans adulto utilizzato per generare preparati tessuto-specifici da utilizzare in un’ampia varietà di saggi omici a valle. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Schema per il protocollo di dissezione della mano. Questo protocollo è stato utilizzato per isolare ampie sezioni dell’intestino da C. elegans adulto a mano. Gli intestini possono essere isolati per diversi test a valle. Qui è mostrato l’uso dell’intestino per l’isolamento dell’RNA e l’isolamento del DNA microbico. Immagine creata con BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 3: Fabbricazione di pipette microcapillari. (A) Una pipetta microcapillare appena tirata ma non forgiata viene mostrata attraverso il pezzo oculare di una microforgia. Un righello oculare viene utilizzato per misurare pipette microcapillari di dimensioni 50 μm con un diametro interno stimato di tre segni di graduazione (mostrato, indicato da una freccia). (B) Le pipette microcapillari non forgiate, da 50 μm e 100 μm, sono mostrate sotto l’oscilloscopio di dissezione accanto a un righello di taratura con 1 div = 0,1 mm. (C) Le pipette microcapillari da 50 μm e 100 μm di (B) sono mostrate di nuovo, ma da un punto di vista diverso. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 4: L’uso del tampone chelante (CB) durante la dissezione della mano per migliorare la resa di RNA. Un protocollo di estrazione dell’RNA totale a basso input ha generato preparazioni di RNA da tessuti nominati. Vengono mostrati cicli rappresentativi di elettroforesi su gel che caratterizzano la qualità dell’RNA totale isolato (RIN, RNA integrity number) e la quantità. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 5: Fasi di dissezione della mano . (A) Le fasi di dissezione descritte nel protocollo sono descritte qui. In (1), l’intestino del verme viene visualizzato mediante fluorescenza GFP. Il sito di incisione primario può essere distribuito uniformemente tra i vermi per garantire una copertura uniforme su tutta la lunghezza dell’intestino. In alternativa, è possibile selezionare i siti di incisione primaria “a” o “b” per ottenere una preparazione specifica del frammento intestinale anteriore-medio o medio-posteriore. In (2), l’intestino si è estruso, assumendo una forma ad anello. In (3), l’intestino viene prima tagliato via dal corpo del verme mentre tenta di liberarlo dalla carcassa e dalla gonade. L’intestino viene quindi rimosso da qualsiasi carcassa o gonade rimanente che non può essere rimosso. In (4), una sezione pulita dell’intestino è isolata e pronta per la conservazione. (B) Un passo critico è quello di rimuovere eventuali detriti aggrappati (cioè gonade, carcassa) dall’intestino facendolo entrare e uscire dalla pipetta microcapillare modellata all’estremità dell’aspiratore della bocca. Barre di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 6: Risultati rappresentativi delle fasi di dissezione della mano. Un’immagine rappresentativa che mostra (A) l’estrusione dell’intestino dal verme. Questi sono vermi del genotipo CL2122, che esprimono GFP sotto il promotore mtl-2 specifico della cellula intestinale. Due immagini rappresentative mostrano (B) una sezione pulita e completamente isolata dell’intestino e (C) un intestino isolato con gonadi contaminanti e tessuti della carcassa. Barre di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 7: Risultati rappresentativi dell’estrazione totale dell’RNA da intestini isolati . (A) Viene mostrata un’immagine rappresentativa dei preparati di RNA risolti mediante elettroforesi su gel di agarosio, che caratterizza la qualità (RIN, RNA integrity Number) e la quantità di RNA totali isolati. (B) Un gel rappresentativo di RNA totale isolato da cellule intestinali raccolte da vermi allo stadio L1 tramite selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS) è mostrato per il confronto. A 20 cellule per intestino, si può dedurre che il metodo di dissezione della mano produce più RNA totale per intestino rispetto alle cellule intestinali purificate da FACS. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 8: Risultati rappresentativi per l’estrazione totale del DNA microbico da intestini isolati. Un kit commerciale di isolamento del DNA microbico ha generato preparati di DNA da intestino, vermi interi e controlli. Un saggio genetico pan-batterico è stato utilizzato per quantificare il numero di batteri nei campioni. Un’immagine rappresentativa di (A) le curve di amplificazione qPCR generate, (B) la curva standard OP50 di E. coli utilizzata per quantificare i campioni e (C) i campioni sono mostrati. In (B), le concentrazioni logaritmiche iniziali degli standard di E. coli sono rappresentate graficamente rispetto ai loro valori di CT . In (C), due repliche (reps) di 40 vermi interi sono state tagliate medialmente e 40 sezioni intestinali isolate sono state elaborate per l’isolamento microbico del gDNA. Viene mostrato anche il No-Template-Control (NTC) dall’esecuzione qPCR. L’asse Y rappresenta i valori CT del campione. La quantità di DNA quantificata dalle PCR è mostrata come valori totali di picogrammi (pg) al di sopra delle barre del campione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Tabella 1: Composizione dei tamponi e delle soluzioni utilizzati in questo studio. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussion

Questo articolo descrive il protocollo passo-passo per la dissezione manuale degli intestini da C. elegans adulti, generando preparati puri per saggi a valle. I passaggi critici in questo protocollo includono (1) garantire di non paralizzare eccessivamente i vermi, (2) effettuare tagli di dissezione accurati, (3) forgiare micro-pipette di dimensioni appropriate per la dissezione e (4) garantire il rapido recupero di intestini sani durante il raccolto finale. Per questi motivi, è necessario prestare attenzione quando si espongono i vermi alla soluzione di levamisolo e gli aghi ipodermici devono essere rinfrescati frequentemente per garantire la massima nitidezza. La manipolazione dell’intestino utilizzando la pipetta microcapillare e l’aspiratore della bocca è un altro passo che richiederà pratica. Le micropipette opportunamente forgiate delle dimensioni appropriate fanno anche una differenza sostanziale nell’isolare ampie sezioni dell’intestino durante le dissezioni, oltre a ridurre il rischio di perdere l’intestino all’interno della micro-pipetta. Gli utenti di nuovi protocolli comunemente perdono l’intestino sul bordo interno della pipetta microcapillare prima che possano essere espulsi nel reagente di isolamento. Questo problema può essere modificato con pipette microcapillari praticate e opportunamente forgiate.

Il protocollo qui descritto è stato progettato per l’uso nei vermi adulti. Studi preliminari supportano che questo protocollo è efficace anche per l’uso nei vermi L4 e nei vermi adulti più anziani. Tuttavia, l’efficacia di questo protocollo non è stata ancora valutata nei vermi allo stadio larvale iniziale. Un limite di questo approccio è la piccola quantità di materiale che produce. Sebbene le quantità siano sufficienti per RNA-seq e PCR, potrebbero non essere adeguate per altri test. Pertanto, gli utenti devono determinare se l’input minimo richiesto per un test può essere raccolto in modo fattibile con questo protocollo.

Il nostro laboratorio utilizza abitualmente FACS per purificare le cellule intestinali dopo l’isolamento 30, metodi di analisi post-hoc per l’identificazione delle cellule intestinali e questo metodo di dissezione della mano30,42. La dissezione della mano ha il vantaggio di essere suscettibile per l’uso nei vermi adulti quando la disaggregazione dei vermi e l’isolamento cellulare hanno meno successo. Inoltre, l’efficienza e la qualità dell’RNA totale estratto dai preparati di dissezione delle mani sono elevate, probabilmente perché i tessuti vengono rapidamente strappati dai vermi e quindi rapidamente depositati in un reagente di isolamento dell’acido nucleico, riducendo la degradazione dell’RNA. Un altro vantaggio del metodo di dissezione della mano è che è a basso costo, facile da imparare e non richiede attrezzature specializzate. Infine, questo approccio consente la raccolta e l’isolamento dei batteri intestinali dall’intestino dei vermi, consentendo studi sul microbioma a valle.

Il protocollo di dissezione della mano qui descritto per isolare l’intestino da C. elegans adulto rappresenta un potente strumento per studiare vari aspetti della biologia di C. elegans. Ad esempio, con una pura preparazione di intestino, i ricercatori possono studiare l’intersezione tra immunità, invecchiamento, metabolismo e microbioma.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Siamo in debito con il lavoro pionieristico di James McGhee e Barb Goszczynski, che inizialmente hanno sviluppato il metodo di dissezione intestinale da cui questo protocollo è adattato. Il nostro lavoro è supportato da un premio MIRA (R35) supervisionato dal National Institute of General Medical Sciences (National Institutes of Health, R35GM124877 a EON) e un NSF-CAREER Award supervisionato dal NSF MCB Div Of Molecular and Cellular Bioscience (Award #2143849 a EON).

Materials

Acetylated Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 97061-420 Nuclease free BSA
CL2122 worm strain CGC (Caenorhabditis Genetics Center) CL2122 dvIs15 [(pPD30.38) unc-54(vector) + (pCL26) mtl-2::GFP]. Control strain for CL2120. Phenotype apparently WT.
Calcium Chloride Dihydrate Fisher C79 needed for making Egg Salts
50 mL Centrifuge Tubes, Bulk Olympus Plastics 28-108 Nuclease free conical tube needed for solution making.
15 mL Centrifuge Tubes, Bulk Olympus Plastics 28-103 Nuclease free conical tube needed for solution making.
Concavity slide (2-well) Electron Microscopy Sciences 71878-08 12-pk of 2-well concavity slides
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) Millipore Sigma E3889 needed for making chelation buffer
Fluorescent Dissection Microscope Leica M205 FCA This is an optional piece of equipment that can be used with fluorescent C. elegans strains to help guid users during hand dissections
N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Millipore Sigma H4034 needed for making dissection buffer
High Sensitivity RNA ScreenTape Agilent 5067-5579 for assesment of total RNA quality and quantity
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder Agilent 5067-5581 for assesment of total RNA quality and quantity
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent 5067-5580 for assesment of total RNA quality and quantity
HostZERO Microbial DNA Kit Zymo Research D4310 Isolation of microbial DNA from worm intestines/worms
Hypodermic Needle (27G x 1/2") BD Scientific 305109 needed for hand dissection of intestines
Levamisole (a.k.a. (-)-Tetramisole hydrochloride) Millipore Sigma L9756 used to temporarily paralyze worms prior to hand dissection of intestines.
Luer-Lok General Use Disposable Syringe (1 mL) BD Scientific 309628 Optional. Can be used to affix the hypodermic needle to, allowing easier manipulation of the needle during dissection. Remove the plunger.
Magnesium Chloride Hexahydrate Fisher M33 needed for making Egg Salts
Magnesium Sulfate Hpetahydrate Sigma-Aldrich 230391-500G needed for making M9 buffer
MF-900 Microforge Narishige MF-900 Used to forge the microcapillary pipettes. Available through Tritech Research.
1.7 mL Microtubes, Clear Olympus Plastics 22-282 Nuclease free microfuge tube needed for solution making and sample storage.
Mouth Aspirator Tube Millipore Sigma A5177 Mouth aspirator tube is needed in combination with the microcapillary pipette to allow aspiration of dissected intestines.
16S Pan-Bacterial Control TaqMan Assay Thermo Fisher A50137 Assay ID: Ba04930791_s1. Assay used for gut microbial detection via qPCR.
P-1000 Micropipette Puller Sutter Instruments Model P-1000 Used to pull the microcapillary pippettes prior to forging.
Petri Dish (35 x 10 mm) Genesee Scientific – Olympus Plastics 32-103 Used to make M9 bath and Disseciton Buffer bath for washing worms prior to dissection.
Phenol:Chloroform:IAA Ambion AM9730 Used in the isolation of total RNA
Potassium Chloride Millipore Sigma 529552 needed for making Egg Salts
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich P0662-500G needed for making M9 buffer
Qubit 3 Fluorometer Invitrogen Q33216 Accompanies the Qubit RNA HS Assay Kit. Can be used to quantify RNA prior to running sample on the Agilent ScreenTape.
Qubit RNA HS Assay Kit Invitrogen Q32852 Can be used to quantify RNA prior to running sample on the Agilent ScreenTape.
RNasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2111 Broad spectrum inhibition of common eukaryotic Rnases
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254 used for on-column DNA digestion during RNA isolation protocol.
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 Used for isolation of total RNA from worm intestines/worms
Standard Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-4 4 in OD 1.2 mm standard borosilicate glass capillaries used to make microcapillary pipettes for dissection
Sodium Chloride Fisher S271 needed for making Egg Salts
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Fisher Scientific S373-500 needed for making M9 buffer
Syringe filter (0.2 micrometer SCFA) Thermo Fisher 72302520 Optional for use with the mouth aspirator tube when mouth pipetting.
4150 TapeStation System Agilent G2992AA Accompanies the RNA ScreenTape reagents for assessing RNA quality and quantity
TaqPath BactoPure Microbial Detection Master Mix Applied Biosystems A52699 master mix used for qPCR
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596026 Nucleic acid isolation and preservation. QIAzol (Qiagen; 79306) can be substituted if preferred.
Worm Pick NA NA Made in house from a pasteur pipette and a platinum wire. See wormbook for details.
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Hill, J. L., Moore, A., Williams, R. T. P., Osborne Nishimura, E. Hand Dissection of Caenorhabditis elegans Intestines. J. Vis. Exp. (187), e64120, doi:10.3791/64120 (2022).
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